3. Preparación Medio Verduyn.docx

Preparación medio Verduyn 1. Vitamin solution Preparation: Tabla 1. Compuestos para preparar la solución de vitaminas

Chemicals D-(+)-Biotin (store at 4°C) D-Pantothenic acid Calcium salt Nicotinic acid Myo-Inositol Thiamine chloride hydrochloride Pyridoxol hydrochloride 4-Aminobenzoic acid     



  

Formula Molar mass (g/mol) 244.3 𝐶10 𝐻16 𝑁2 𝑂3 𝑆 238.27 𝐶9 𝐻16 𝑁𝑂5 . 𝐶𝑎0.5 123.12 𝐶6 𝐻5 𝑁𝑂2 180.16 𝐶6 𝐻12 𝑂6 337.27 𝐶12 𝐻17 𝐶𝐼𝑁4 𝑂𝑆. 𝐻𝐶𝑙 205.6 𝐶8 𝐻12 𝐶𝐼𝑁𝑂3 137.14 𝐶7 𝐻7 𝑁𝑂2

Conc. [g/L] 0.05 1 1 25 1 1 0.2

Test the pH meter using pH 4 and 7 buffers. Calibrate the pH probe if neccessary. Take a 250 mL Erlenmeyer flask. Fill the flask with demi wáter and mark the 250 mL level Fill the Erlenmeyer flask with 187.5 mL of demi water Write down the weight of the bottles with 1M NaOH and 1M HCl Dissolve the Biotin in 2.5 mL 0.1M NaOH. When it has disolved, add the Biotin solution to the Erlenmeyer flask, and set the pH to 6.5 with 1M HCl Note: La biotina es inestable a un pH alto, así que sea rápido pero preciso Add the other compounds one by one in the specifies order and correct the pH to 6.5 after each addition. Wait until each compound has completely disolved before adding the next compound. When all components have disolved, againd adjust the pH to 6.5 (with 1M HCl) and add demi water to adjust the volume Filtre la solución de vitaminas en una cabina de flujo laminar e implemente un filtro de 0.2 µm. Divida en alícuotas de 1 ml para su posterior uso. Guarde la solución de vitaminas a 4°C y pueden ser implementadas por un periodo de 3 meses

Tabla 2 Cantidad de cada compuesto para realizar la solución de vitaminas

Chemicals D-(+)-Biotin (store at 4°C) D-Panthothenic acid Calcium salt Nicotinic acid Myo-Inositol Thiamine chloride hydrochloride Pyridoxol hydrochloride 4-Aminobenzoic acid

Weigh (g) 0.0125 0.2500 0.2500 6.2500 0.2500 0.2500 0.0500

2. Trace element solution Tabla 3. Compuestos necesarios para preparar el trace element solution

Chemicals

Formula

MW

EDTA Zinc sulphate heptahydrate Manganese chloride dihydrate Cobalt(II)chloride hexahydrate Copper(II)sulphate pentahydrate Di-sodium molybdenum dihydrate Calcium chloride dihydrate Iron sulphate heptahydrate Boric acid Potassium iodide

𝐶10 𝐻14 𝑁2 𝑁𝑎2 𝑂8 . 2𝐻2 𝑂 𝑍𝑛𝑆𝑂4 . 7𝐻2 𝑂 𝑀𝑛𝐶𝑙2 . 2𝐻2 𝑂 𝐶𝑜𝐶𝑙2 . 6𝐻2 𝑂 𝐶𝑢𝑆𝑂4 . 5𝐻2 𝑂 𝑁𝑎2 𝑀𝑜𝑂4 . 2𝐻2 𝑂 𝐶𝑎𝐶𝑙2 . 2𝐻2 𝑂 𝐹𝑒𝑆𝑂4 . 7𝐻2 𝑂 𝐻3 𝐵𝑂3 𝐾𝐼

372.24 287.54 161.88 237.93 249.68 241.95 147.02 278.02 61.83 166.01

 



Weigh (g) 3.000 0.900 0.168 0.060 0.060 0.080 0.900 0.600 0.200 0.020

Disolver el EDTA y el 𝑍𝑛𝑆𝑂4 . 7𝐻2 𝑂 en 150 mL de agua desmineralizada y ajuste el pH a 6.0 con NaOH Mientras que el pH está en 6.0 disuelve cada uno de los componentes uno por uno. Cuando esté listo, ajuste el pH a 4.0 con HCL 1M y termine de aforar el volumen a 200 mL. Esterilice la solución en autoclave por 20 min a 120°C. Almacene las botellas en la oscuridad a temperatura ambiente, las botellas abiertas deben almacenarse a 4°C, pueden ser implementadas por un periodo de 2 meses

3. Verduyn medium 

Para preparar 1L de medio Verduyn, pese los siguientes compuestos

Ammonium sulphate Potassium dihydrogenphosphate (CAS: 7778-77-0) Magnesium sulphate. 7 𝐻2 𝑂

 

g/L 5.0 3.0 0.5

Adicione 800 ml de agua desmineralizada y disuelva las sales Adicione los siguientes compuestos mL/L Trace element solution* 1.0 (*) El stock trace element solution debe ser preparado y guardado a -20°C.

  

 

Si su cepa cuenta con alguna auxotrofia debe poner las cantidades recomendadas por el proveedor Ajuste el PH con 2.0M 𝐻3 𝑃𝑂4 (para pH menores que 4.5) o 4.0M KOH (para pH mayores a 4.5). Asegúrese que su pH este bien calibrado Agregue agua desmineralizada a un volumen final de 949 mL, usando un cilindro de medición graduado Note: Adicione 15g de agar para platos sólidos. Recuerde que el agar no se solidifica a pH 4.5 o más bajos. Esterilice la solución en un autoclave (121°C; 15 min) Cuando la solución ya este fría, adicione los siguientes compuestos en condiciones estériles mL/L Vitamin solution* 1.0 Glucose 40% 50 (*) El stock de la solución de vitaminas debe ser preparado y guardado a -20°C.