I9. Citometría De Fllujo.pdf

Citometría de flujo Múltiples características físicas de cada sola célula en forma simultanea. Estas características de las células son evaluadas debido a que las células pasan de forma individual por un sistema de fluido que permite un flujo de 500 a 4,000 células por segundo.

Muestra Fluido

Cámara de fluido

Rayo de Luz

Lentes

QUE NOS PUEDE DECIR LA CITOMETRIA DE FLUJO DE CADA CELULA?


Su tamaño relativo. (Forward scatter-FSC)
Su granularidad o su complejidad citoplasmática. (Side scatter-SSC)
Su intensidad de fluorescencia relativa. (FL1, FL2, FL3 o FL4)

COMO DETECTA EL CITOMETRO ESTAS CARACTERISTICAS SOBRE LA CELULA? El citómetro de flujo detecta la interacción entre una célula y un rayo láser. La forma que la célula:
Desvía la luz incidente.
Emite fluorescencia.

Dispersión lateral (SSC)

LASER

Dispersión frontal (FSC)

El como la célula desvía los rayo de luz nos da información acerca del tamaño y la granularidad de cada célula.

PRINCIPIOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Dispersion Amplificador

Lentes Lateral

Laser

Flujo

Frontal

Muestra

¿Qué es un fluorocromo? 488 nm

HO

O

530 nm

CO2H

Luz Incidente

Molécula de

Luz Fluorescente Emitida

Fluoresceína

• El fluorocromo absorbe la luz del láser • El fluorocromo emite un rayo luminoso de diferente longitud de onda

Fluorescencia Intensidad de Fluorescencia Emitida FITC

FITC

=

Sitios de Unión

FITC FITC

Número de Eventos

FITC FITC

FITC FITC FITC

Intensidad Fluorescente

FITC

TABLA DE PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

Fluorocromos 7-amino Actinomycin D Aloficocianina DAPI Fluoresceína Ficoeritrina Hidroxicumarina Hoechst 33342 Mitramicina Naranja de Acridina Peridinina Clorofila Rojo Texas Yoduro de Propidio X-Rodamina

Aplicación 7-AAD ADN, viabilidad APC IF proteínas ADN FITC IF proteínas PE IF proteínas IF proteínas ADN ADN AND/ARN PerCP IF proteínas IF proteínas PI ADN, viabilidad XRITC Mitocondría

Excitación Emisión (nm) (nm) 546 650 345 495 480 ; 565 325 343 445 503 490 589 536 495

647 660 455 519 578 386 483 575 530/640 675 615 617 519

Optica – Fluorescencia FL1 530/30 SSC

FL2

488/10

585/42

670LP

FL3

488 nm Laser azul

.

Cámara De flujo

FSC 488/10

Finalmente la señal análoga de voltaje es pasada a una señal digital numérica que se expresa en “Canales”

Señal digital

Fotones

Resolución 0 – 256 0 –1024

List-Mode FSC

SSC

FL1

FL2

Event 1

30

60

638

840

Event 2

100

160

245

85

Event 3

300

650

160

720

PRESENTACION DE LOS DATOS • Gráficas: Histograma y de distribución en dos dimensiones. • Tablas de números • Valores relativos y absolutos (perlas)

Número de Células

Histograma

0

500

1000

Incremento en intensidad

490

500 Voltios transformados a “Canales de intensidad”

510

IgM (-)

IgM (+)

Negativas Low

Intemediate

M2

High

M1

M1

FSC SSC Eje y

FL-4

FL-3

eje x

FL-2

FL-1

Como se ubican espacialmente las poblaciones de leucocitos de sangre periférica?

Complejidad interna SSC

Gráfica de puntos

G

G

M L

M L L

G

M

Tamaño relativo FSC

Granulocitos

Detritos

Monocitos

Linfocitos

R1

R1 30%

MARCAJE CON 1 SOLO FLUOROCROMO Se quiere saber cuantas células CD3+ hay en sangre periférica. Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluoresceína FITC 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Muestra de sangre periférica. Mezcla de la muestra con el anti-CD3 FITC. FITC Incubar en oscuridad. Lisar los glóbulos rojos. Lavar con solución tampón. Fijar con paraformaldehido. Leer en el citómetro de flujo.

Control de isotipo

Anti-CD3 FITC

Región 1

Tamaño relativo FSC

Fluorescencia naranja (FL2)

Complejidad interna SSC

Control de isotipo

Gráfica de puntos

Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

Gráfica de puntos Fluorescencia naranja (FL2)

Anti-CD3 FITC

UL

UR

LL

LR

Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

Células marcadas

UL 0% UR 0% LL 10% CD3LR 90% CD3+

UL

LL

UR

LR

CD3+ 79.97% de R1

Gate: G1

CD3+ 14.14% Población celular total

Quad Events % Gated % Total UL 0 0.00 0.00 UR 0 0.00 0.00 LL 931 20.03 3.54 LR 3716 79.97 14.14

MARCAJE CON 2 FLUOROCROMOS

Se quiere saber cuantas células CD3+ y CD19+ hay hay en sangre de un individuo. Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluoresceína FITC Anticuerpo anti-CD19 marcado con ficoeritrina PE

Gráfica de puntos

Complejidad interna SSC

Anti-CD3 FITC Anti-CD19 PE

Región 1

Tamaño relativo FSC Células marcadas

Anti-CD3 FITC Anti-CD19 PE

Células marcadas

Fluorescencia naranja (FL2) Anti-CD19 PE

Gráfica de puntos UL

UR

LL

LR

Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC CD3- CD19+

UL 14% UR 0% CD3+ CD19+ LL 10% CD3- CD19LR 76% CD3+ CD19-

CD3+ 72.75% R1 12.10% Total

Gate: G1

CD19+ 16.30% R1 2.71% Total

Quad Events % Gated % Total UL 696 16.30 2.71 UR 7 0.16 0.03 LL 461 10.79 1.80 LR 3107 72.75 12.10

MARCAJE CON 3 FLUOROCROMOS

Se quiere saber cuantas células T CD3+/CD4+/CD8+ hay hay en sangre de un individuo. Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluoresceína FITC Anticuerpo anti-CD4 marcado con ficoeritrina PE Anticuerpo anti-CD8 marcado con Peridinina clorofila PerCP

Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE

Gráfica de puntos

CD3+ CD3+ CD8+

Complejidad interna SSC

Anti-CD8 PrCP

Región 1

CD3+ CD4+

CD3- CD4- CD8-

Tamaño relativo FSC

Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE Anti-CD8 PrCP

UL 5% CD3UR 60% CD3+ LL 10% CD3LR 25% CD3+

CD4+ CD4+ CD4CD4-

Fluorescencia naranja (FL2) Anti-CD4 PE

Gráfica de puntos UL

UR

LL

LR

Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE Anti-CD8 PrCP

UL 5% CD3UR 25% CD3+ LL 10% CD3LR 60% CD3+

Fluorescencia naranja (FL3) Anti-CD8 PerCP

Gráfica de puntos

CD8+ CD8+ CD8CD8-

UL

UR

LL

LR

Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE Anti-CD8 PrCP

Fluorescencia naranja (FL3) Anti-CD4 PE

Gráfica de puntos

UL 65% CD4+ CD8UR 0% CD4+ CD8+ LL 10% CD4- CD8LR 25% CD4- CD8+

UL

UR

LL

LR

Fluorescencia verde (FL3) Anti-CD8 PrCP

PrCP

R1

Complejidad interna SSC

Complejidad interna SSC

UL

Región 1

Tamaño relativo FSC

UR

Región 2 LL

LR

Fluorescencia verde (FL3) Anti-CD3 FITC UL 0% UR 0% LL 25% CD3LR 75% CD3+

R1

R2

File: Leydi Vasquez.001

Gate: G1

Quad Events % Gated % Total UL 0 0.00 0.00 UR 0 0.00 0.00 LL 592 25.25 9.05 LR 1753 74.75 26.79

GRAFICAS Determinar la proporción relativa de una característica para una población celular, con respecto a la población total.

Ubicación en la gráfica

CD10 CD34 CD8 HLA-DR TIMOCITO CD1 CD8 CD2 CD71 CD3 CD38 CD4 TCR

LINFOCITO PRE B CD10 CD19 CD34 CD38

LINFOCITO B CD19 CD20 CD22 IgM

LINFOCITO T COOPERADOR CD4 CD28 CD5

CD3 TCR

LINFOCITO T CITOTOXICO CD8 CD3 CD28 CD5

NK MADURO CD2 CD8+/CD16 CD56 CD57

Leucocitos Linfocitos Células CD3+ Células CD4+ Células CD8+

5800/µl 30% 70% de los linfocitos 30% 65%

Cual es el valor absoluto de cada subpoblación en los linfocitos y cual es el significado clínico del resultado.

Aplicaciones de la Citometría de Flujo en investigación

Células dendríticas derivadas de monocitos

Monocitos CD14+

DC inmadura

CD83-

CD14-

CD83-

DC madura CD14-

CD83+

IL-4 GM-CSF

CD14 CD86

HLA-DR CD83

Estímulo de maduración y/o antígeno de pulga

CBA

CD derivadas de monocitos A A.

R1

CD14

CD86

96.5%

B 99.5%

0.5%

B.

HLA-DR

CD83

Subpoblaciones de CD

R1

R2

CDm Lin- HLA-DRalto CD11c+ CD123int R3 CDp Lin- HLA-DRalto CD11c- CD123alto R4

R5

Detección intracelular de citocinas CMSP

Marcaje Citometría

NE SEB

P

αCD28/αCD49d

12 h BFA x 9 h

Selección de la población de LT CD4+

Células T efectoras secretoras de IL17

0.017

No estimulado

0.000

0.096

SEB

0.064

Pulga 20 µg/ml

0.211

0.585

Células T reguladoras secretoras de IL-10

0.020

No estimulado

0.000

0.492

SEB

0.212

Pulga 20 µg/ml

1.178

0.613

IL-2

IL-13

Evaluación de células T multifuncionales

IL-10

IL-10

Análisis: Esquema de jerarquías LT CD4+

Seder RA. Nat Rev Immunol 2008

Perfil de LT multifuncionales en pacientes con diferentes estadíos de enfermedad. Ej HIV

El perfil multifuncional de los LT varía de acuerdo con el estadio de la enfermedad

Betts MR. Blood 2006

Replicación viral

La multifuncionalidad se asocia con menor carga viral Virus Vaccinia

CMV

HIV-2

HIV-1 (LTNP)

HIV-1 Progresores

Número de funciones

Carga antigénica y duración

Seder RA. NRI 2008

Células T reguladoras naturales

MIF perlas en FL3

Cuantificación de citocinas en fluidos 6 perlas con diferente MIF en FL3 Cada perla con acp de captura para una citocina diferente.

Adición de la muestra O el standard (citocina)

IL-12 TNFα IL-10 IL-6 IL-1β IL-8

Revela la reacción con un conjugado anti citocina MIF en FL2