Pbl Gjennomgang Uke 9

PBL Uke 9 Du bør velge dine foreldre med omhu

Dagens tema

• • • •

Organellene Proteiners skjebne etter translasjonen Intracellulære transportveier Ukens PBL-oppgave

Organellene • CYTOSOL: en rekke metabolske reaksjoner foregår her. Proteinsyntesen • KJERNEN: inneholder genomet. DNA og RNA syntese • ER: syntese av lipider. Syntese av proteiner • GOLGI-APPARATET: modifikasjon, sortering og pakking av proteiner og lipider • LYSOSOMER: intracellulær degradering • ENDOSOMER: sortering av endocytert materiale • MITOKONDIA: ATP syntese ved oksidativ fosforylering • KLOROPLAST: Fotosyntesen og ATP syntese ved karbon fiksering • PEROKSISOMER: oksidasjon av toksiske molekyler

Proteiners skjebne etter translasjonen

FOLDING • Proteiner foldes i en bestemt 3D struktur • Bestemt av aminosyre rekkefølge • Chapperoner hjelper assisterer foldingen

Posttranslasjonelle modifikasjoner • Mange proteiner modifiseres i ER • 1. Disulfidbindinger: Oksidasjon av cystein sidekjeder ▫ Intrakjeder ▫ Interkjeder ▫ Stabiliserende effekt på proteinet

…

• Glycosylering: Påhektelse av korte oligosakkarider ▫ N-glycosylering ▫ O-glycosylering ▫ Beskytter mot degradering og lysosomets lumen

Signalfrekvenser • Proteinene modifiseres videre i Golgi • Signal sekvensene er typisk 15-60 aminosyrer lange. ▫ Gult=Hydrofobe ▫ Rødt=Positivt ladet ▫ Blått=Negativt ladet

Degradering • Organeller slites ut, proteiner kveiles feil-> må degraderes og byttes ut • Skjer vdh Proteasomer og Lysosomer • Proteasomer:

▫ Ubiquitin(UB) bindes til proteinet-> Polyubiquitin er en destruksjonsmerkelapp http://www.youtube.com/watch?v=w2Qd6v-4IIc

• Lysosomer: ▫ Inneholder sure hydrolaser, pH omkring 5 ▫ Usedvanelig glycosylerte membranproteiner ▫ Transport til lysosomet via: Endocytose Fagocytose Autofagi

- Autofagi: ”selvspising”; tar deler av seg selv, sender med autofagocyttiske blærer.

Sure hydrolaser • Syntetiseres i ER, transporteres via Golgi. I ER og cis Golgi merkes de med Mannose-6-fosfat (M6P) • I trans Golgi blir M6P av Mannose-6-fosfat reseptoren (MPR). Dette transporteres i vesikler til lysosomet via endosomer.

Intracellulære transportveier

Transport gjennom kjerneporer • Små vannløselige stoffer kan passere porene • Store molekyler kan bare passere porene hvis de har et bestemt sorteringssignal (nuclear localization signal) som binder seg til nuclear transport receptors.

Transport gjennom proteintranslokatører • Disse proteinene har en signalsekvens på N-terminal som fungerer som en merkelapp. • Proteinet blir først foldet ut før det transporteres inn i organellen. Der vil chaperonene hjelpe til med å folde dem tilbake.

Vesikkeltransport 1) Mekanismer •

Cytoplasmiske proteiner bidrar til vesikkelformasjon: Klatrin, COPI og COPII • Klatrin: ▫ Trebenet molekylstruktur ▫ Danner spontant mangekantet burstruktur ved å binde seg til hverandre

▫ Klatrin binder også adaptinmolekyler bundet til transmembranreseptorer (cargo receptors), som igjen binder molekyler som skal transporteres på ikke-cytosolisk side av membranen (cargo molecules) ▫ Vesikkelen snøres av ved hjelp av GTPasen dynamin

• Hvordan fusjonere med riktig målmembran? ▫ Komplementære SNARE-proteiner danner trans-SNAREkomplekser ▫ Rab-proteiner fasiliterer ”docking” av vesikkelen og riktig paring av vSNARES og tSNARES

▫Selve fusjonen er energikrevende og krever bistand fra et fusjonsmaskineri ▫vSNARES og tSNARES bidrar til membranfusjon ved å tvinge membranene sammen

2) Sekretoriske transportveier • Korrekt foldete proteiner transporteres fra ER til Golgiapparatet ▫ COPII-kledte vesikler fusjonerer med Golgiapparatet ▫ Proteiner returneres til ER i COPI-kledte vesikler

• Golgiapparatet: To hovedfunksjoner 1) Enzymatisk modifikasjon av proteiner fra ER 2) Sortering av proteiner for videre transport

• Sekretoriske proteiner kan ha ulike skjebner ▫ Inkorporeres i ekstracellulær matriks ▫ Tilknyttes plasmamembranen perifert ▫ Diffundere som næring/signalmolekyler til andre celler • Sekresjon skjer ved eksocytose: Fusjon med plasmamembranen

• Den konstitutive sekretoriske veien: ▫ Ikke-selektiv eksocytose ▫ Kontinuerlig i alle eukaryote celler ▫ ”Default pathway”: Forsyner plasmamembranen og ekstracellulær matriks med nye komponenter • Den regulerte sekretoriske veien: ▫ Selektiv eksocytose ▫ Kun i sekretoriske celler ▫ Seleksjon i trans-Golgi ▫ Fusjonerer med plasmamembranen på signal utenfra

3) Endocytiske transportveier • Endocytose: Prosessen hvor celler tar opp makromolekyler, bestemte substanser og andre celler utenfra ved invaginering av plasmamembranen • Kategorisering etter: ▫ Størrelse: Fagocytose versus pinocytose ▫ Spesifisitet: Reseptormediert eller uselektiv

• Fagocytose: Når cellen tar inn store partikler som mikroorganismer og døde celler ▫ Store vesikler (fagosomer) som fusjonerer med lysosomer ▫ Hos animalske arter: Spesialiserte fagocytter beskytter mot patogener og fjerner ødelagte/døde celler ▫ Selektiv • Pinocytose: Kontinuerlig internalisering av plasmamembran og intracellulærvæske ▫ Klatrin- eller kaveolinmediert ▫ Uselektiv

• Reseptormediert endocytose: Selektiv pinocytose via klatrinkledte vesikler ▫ Molekyler i ekstracellulærvæske binder reseptorer i plasmamembranen ▫ Opptak av for eksempel vitamin B12, jern og kolesterol ▫ Danner reseptormakromolekylkomplekser som entrer cellen ▫ Fusjonerer med tidlige endosomer ▫ Proteiner som ikke returneres til plasmamembranen ender opp i lysosomer

Ukens PBL-oppgave

• Kolesterol og LDL-reseptoren • Mutasjon i LDL-reseptoren og familiær hyperkolesterolemi

Lipoproteiner: • Lipoprotein • Apolipoprotein Flere forskj. typer, fungerer som ligand.

• Kolesterol

Lipoproteiner og kolesterol: • Kolymikron: Tarm

fett

plasma

vev

• VLDL: Lever

plasma fett

• LDL: VLDL

LDL

kolester vev ol

• HDL: Lever

vev

plasma

kolester lever ol

Godt og dårlig kolesterol: • Vanlige verdier i plasma: Kolesterol < 5 mmol/L LDL-kolesterol < 3 mmol/L

LDL-reseptorens oppbygning:

Kolesterolopptakets virkning på genregulering:

Familiær hyperkolesterolemi • Tilhører gruppe metabolske sykdommer: hyperlipedemier • Karakteriseres ved: ▫ autosomal dominant nedarvet hyperkolesterolemi ▫ xantomknuter ▫ tidlig debut av hjerte- og karsykdommer.

• skyldes defekte (LDL)-reseptorer på cellenes overflate. • Gir akkumulering av kolesterol i blodet • Rammer 1 av 300 i Norge, 1 av 500 i Storbritannia*

• Kilde: www.pasienthandboka.no

Arvemekanismene Autosomal dominant Heterozygot + frisk --> 50% Homozygot + frisk --> 100% (heterozygot) Heterozygot + heterozygot --> 75% Homozygot + Homozygot --> 100% (homozygot) Kilde: www.pasienthandboka.no Heterozygote pasienter har 2 til 3 ganger høyere kolesterolinnhold i serum enn normalt. Homozygote pasienter har 4 til 8 ganger høyere kolesterolinnhold i serum enn normalt.

Heterozygote • totalkolesterol ofte ligge mellom 8 og 12 mmol/L (normal under 5) • Hjerteinfarkt fra 30år • Står for 5% av hjerteinfarkt hos folk under 60 • Behandling: Kolesterolsenkende midler (statiner) kan føre til syntese av LDL reseptorer fra det normale allelet til de heterozygote pasientene. Dermed kan det delvis kompensere.* statiner blokkerer produksjonen av kolesterol i leveren ved at de hemmer virkningen av enzymet hydroksymetyl-glutaryl-koenzym A-reduktase som er det hastighetsbestemmende enzym i kolesterolsyntesen. Da vil cellen kompenserer ved å lage flere reseptorer for å få inn kolesterol fra blodet.

Det finnes også folk som er heterozygote for 2 forskjellige mutasjoner, 1 mutant gen fra hver forelder. *

Kilde: Leren,T,1993, TDNLF, 113,3251-4

Homozygote • Arver 1 mutant gen fra hver forelder. • Alvorlig tilstand • Hjerteinfarkt fra tidlige barneår • Behandling: ▫ Aktuelle behandlingsprinsipper for de homozygote innebærer plasmautskiftninger hver annen til fjerde uke eller levertransplantasjon. ▫ I USA er det gjort lovende forsøkt med genterapi hos disse pasientene. (etablert cellekulturer av hepatocytter, hvor det introduseres et normalt LDL-reseptorgen. Hepatocyttene tranfunderes via vena portae, og slår seg ned i lever) usikker på klinisk anvendelse.

Kilde: Leren,T,1993, TDNLF, 113,3251-4

Mutasjon i LDL-reseptoren • •

•

Per jan 2009: 1100 mutasjoner identifisert Diagnostikk: - Trengs i prinsippet test for hver av mutasjonene

- I familier med påvist FH i minst 2 generasjoner, kan det sjekkes om familiemedlemmet har arvet den samme DNA strengen som den syke i familien, uten å kjenne mutasjonen i genet.

5 Hovedgrupper: 1. 2.

3. 4. 5.

Manglende syntese av reseptorprotein. Manglende intracellulær transport og modifisering av reseptorproteinet Manglende binding av lipoproteiner Manglende internalisering av reseptor-ligand-komplekset Manglende resyklering av reseptor

Kilde: Leren,T,1993, TDNLF, 113,3251-4

1.Manglende syntese av reseptorprotein Det syntetiseres ikke noe påvisbart reseptorprotein Vanligste typer: Nonsense mutasjon Endring av leserammen (mindre delesjoner, duplikasjoner, insersjoner

2. Manglende intracellulær transport og modifisering av reseptorproteinet den vanligste typen, utgjør 50% av alle kjente mutasjoner den intracellulære transporten mellom ER og Golgi-apparatet er helt eller delvis blokkert proteinet får ikke de nødvendige modifikasjonene Lokalisering:

2/3 i det ligandbindende domenet 1/3 i domenet som har homologi med forløperen for EGF

3. Manglende binding av lipoproteiner Fører til at reseptoren ikke binder LDL Lokalisering:

i det ligandbindende domenet i domenet som har homologi med forløperen for EGF

4. Manglende internalisering av reseptor-ligand komplekset Resptorene konsentreres ikke i coated pits dermed kan heller ikke LDL internaliseres ved reseptormediert endocytose Hovedsaklig lokalisert: i det cytoplasmatiske domenet i det membranspennende domenet Av de 22 hydrofobe aminosyrene er det spesielt aminosyre 807 som er spesielt viktig.

5. Manglende resirkulering av reseptor • reseptoren dissosieres ikke fra LDL i endosomet. • reseptoren ikke kan resirkulering, og vil derfor degraderes i lysosomene sammen med LDL. • Type mutasjoner: missensmutasjoner eller delesjoner • Lokalisasjon: domenet som har homologi med forløperen for EGF

Elverum- varianten FH-Elverum mutasjonen er lokalisert til det ligandbindende domenet. • Punktmutasjon: en G er byttet ut med en A på posisjon 1 av intron 3. • Dette er en del av spleise setet sekvensen og fører mest sannsynlig til at intron 3 ikke spleises ut av mRNA. • Resultat: null allel, et protein som forventes å være non-funksjonelt. • Homozygoter for FH Elverum er reseptornegative. • Denne mutasjonen ble funnet ved hjelp av PCR-metoden, sammen med FH Svartor (utskiftning av cytosin til guanin i exon 3) Kilde: Leren T, m.fl, 1994 Atherosclerosis,Dec;111(2):175-82.