Oksydoreduktazy Pytania

26. Przedstaw podział i scharakteryzuj enzymy należące do klasy oksydoreduktaz. Oksydoreduktazy stanowiące w klasyfikacji enzymów klasę pierwszą, katalizują procesy utleniania lub redukcji substratu. Ze względu na mechanizm działania oksydoreduktazy dzieli się na następujące grupy: − oksydazy, − oksygenazy, − hydroksylazy, − dehydrogenazy, − peroksydazy. Oksydazy aktywują cząsteczkę tlenu dwoma lub czterema elektronami i katalizują przyłączenie protonów do powstałych jonów tlenkowych, przy czym powstaje woda lub nadtlenek wodoru. Ze względu na produkt końcowy wyróżnia się dwa typy oksydaz: Oksydazy I zespołu, np. oksydaza askorbinianowa. Enzymy te zawierają w swej cząsteczce atom metalu, np. miedzi. Schemat działania oksydaz I zespołu można przedstawić w następujący sposób: Oksydazy I zespołu aktywują cząsteczkę tlenu czterema elektronami i katalizują powstanie wody. Oksydazy II zespołu, to głównie enzymy flawinowe zawierające jako koenzym dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD). Do tej grupy oksydaz należą między innymi oksydazy L- i D-aminokwasowe,. Schemat działania oksydaz II zespołu: Oksydazy II zespołu aktywują cząsteczkę tlenu dwoma elektronami i katalizują powstawanie nadtlenku wodoru. Oksygenazy katalizują bezpośrednie włączenie tlenu cząsteczkowego do związków organicznych. Przykładem tych enzymów może być lipooksygenaza, katalizująca utlenienie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Oksygenazy odgrywają ważną rolę w metabolizmie związków aromatycznych. Hydroksylazy katalizują bezpośrednie włączenie połowy cząsteczki tlenu (atomu tlenu) do związków organicznych, przy czym wymagają obecności dodatkowo donora atomów wodoru. Drugi atom tlenu jest wiązany z udziałem czynnika redukującego (zredukowane NAD lub NADP) w cząsteczkę wody. Przykładem hydroksylaz jest 4-hydroksylaza fenyloalaninowa katalizująca utlenienie fenyloalaniny do tyrozyny. Dehydrogenazy katalizują reakcje przenoszenia atomów wodoru z substratu na koenzymy lub inne akceptory. Enzymy te współdziałają z koenzymami nikotynamidoadeninowymi i flawinowymi. Do współdziałających z NAD należy np. dehydrogenaza mleczanowa, z NADP dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, zaś typowa dehydrogenaza flawinowa to np. dehydrogenaza bursztynianowa. Peroksydazy katalizują reakcje rozkładu nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru jest silnym inhibitorem enzymów i dlatego komórki wyposażone są w mechanizmy, dzięki którym związek ten jest rozkładany. Rozkład nadtlenku wodoru katalizują: peroksydaza i katalaza. Peroksydaza (oksydoreduktaza donor:H2O2) jest to enzym występujący głównie w roślinach, choć spotyka się go także w niektórych organizmach zwierzęcych. Istnieje kilka peroksydaz - większość z nich jest niespecyficzna, ale są i peroksydazy specyficzne w stosunku do donora wodoru, np. peroksydaza cytochromowa czy peroksydaza glutationowa. Do peroksydaz niespecyficznych należy m. in. najlepiej poznana peroksydaza z chrzanu.

Katalaza (oksydoreduktaza H2O2:H2O2) jest enzymem rozpowszechnionym w świecie zwierzęcym (wątroba, nerki), występuje jednak również w niektórych roślinach oraz we wszystkich bakteriach tlenowych. Katalaza, podobnie jak peroksydazą, jest hemoproteina. Cząsteczka katalazy składa się z czterech podjednostek, z których każda zawiera jedną cząsteczkę protohemu.

Oksydoreduktazy stanowiące w klasyfikacji enzymów klasę pierwszą, katalizują procesy utleniania lub redukcji substratu. Utlenianie polega na oderwaniu elektronów od substratu (substancja utleniana, donor elektronów), a redukcja na przyłączeniu ich do substancji redukowanej (akceptor elektronów). Procesy te mogą przebiegać różnymi drogami, najczęściej jest to redukcja typu: kiedy następuje utlenienie substratu przez usunięcie atomów wodoru lub elektronów za pomocą akceptora B w postaci koenzymów, takich jak np. NAD+, NADP+. Inny typ reakcji utleniania i redukcji to również usunięcie wodoru lub elektronów, lecz w reakcji bierze udział tlen, na który zostają przeniesione atomy wodoru lub elektrony:

W obu tych reakcjach bierze również udział nie zaznaczony tutaj koenzym. Pozostałe typy reakcji utleniania i redukcji polegają na utlenianiu substratu przez włączenie w jego cząsteczkę atomów tlenu, przy czym różnice między poszczególnymi rodzajami reakcji polegają na tym, że inne jest źródło tlenu. Źródłem tlenu może być: − woda − nadtlenek wodoru − tlen cząsteczkowy

28. Jakiego typu reakcje katalizują peroksydazy? Opisz metodę oznaczania aktywności jednego ze znanych ci enzymów należących do tej grupy. Peroksydazy katalizują reakcje rozkładu nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru jest silnym inhibitorem enzymów i dlatego komórki wyposażone są w mechanizmy, dzięki którym związek ten jest rozkładany. Rozkład nadtlenku wodoru katalizują: peroksydaza i katalaza. Oba wymienione enzymy wchodzą w skład systemów ochronnych zabezpieczających komórkę przed szkodliwym działaniem nadtlenku wodoru. Jeden z takich systemów funkcjonuje w erytrocytach. Enzymy te służą do zabezpieczenia hemoglobiny i innych białek, które dla pełnienia swoich funkcji muszą zawierać grupy -SH w postaci zredukowanej. Mechanizm rozkładu nadtlenku wodoru katalizowanego przez oba enzymy jest różny. Peroksydaza (oksydoreduktaza donor:H2O2) jest to enzym występujący głównie w roślinach, choć spotyka się go także w niektórych organizmach zwierzęcych. Istnieje kilka peroksydaz - większość z nich jest niespecyficzna, ale są i peroksydazy specyficzne w stosunku do donora wodoru, np. peroksydaza cytochromowa czy peroksydaza glutationowa. Do peroksydaz niespecyficznych należy m. in. najlepiej poznana peroksydaza z chrzanu.

Jest to przeniesienie atomów wodoru z organicznego substratu na nadtlenek wodoru. Substratem, a więc donorem wodoru mogą być fenole i aminy aromatyczne, np. o-toluidyna, gwajakol, pirogalol, di-o-anizydyna. Katalaza (oksydoreduktaza H2O2:H2O2) jest enzymem rozpowszechnionym w świecie zwierzęcym (wątroba, nerki), występuje jednak również w niektórych roślinach oraz we wszystkich bakteriach tlenowych. Katalaza, podobnie jak peroksydazą, jest hemoproteina. Cząsteczka katalazy składa się z czterech podjednostek, z których każda zawiera jedną cząsteczkę protohemu. Jest to rozkład nadtlenku wodoru bez udziału dodatkowego substratu, polegający na przeniesieniu atomów wodoru z jednej cząsteczki H2O2 na drugą. W pewnych warunkach (niskie stężenie nadtlenku wodoru, duże stężenie odpowiednich donorów wodoru) katalaza może ujawniać aktywność peroksydazową, tzn. katalizować przeniesienie atomów wodoru z donorów wodoru, takich jak np. alkohol etylowy, fenole. Oba omawiane enzymy katalizujące rozkład nadtlenku wodoru odgrywają dużą rolę w przemyśle spożywczym. W mleczarstwie oznaczanie aktywności peroksydazy jest ważnym wskaźnikiem skuteczności pasteryzacji mleka. Podobnie w procesie blanszowania owoców i warzyw na podstawie aktywności peroksydazy można sądzić o prawidłowości tego procesu. W analityce peroksydaza wraz z oksydazą glukozową ma zastosowanie do oznaczania glukozy w niektórych produktach spożywczych, m.in. w napojach. Katalaza jest stosowana również z oksydazą glukozową do usuwania glukozy lub tlenu z pewnych produktów spożywczych w celu zapobieżenia ich ciemnieniu i procesom oksydacyjnym. W krajach, w których dozwolona jest tzw. zimna pasteryzacja mleka (czyli pasteryzacja przy pomocy H2O2), katalaza jest stosowana do rozkładu nadtlenku wodoru w mleku przeznaczonym do przetwórstwa. Poza tym stwierdzenie obecności katalazy w mleku jest wskaźnikiem jego zakażenia.

Aktywność katalazy oznacza się przez pomiar szybkości spadku stężenia nadtlenku wodoru lub wzrostu stężenia tlenu. Najczęściej stosowana w biochemii, a także w chemii klinicznej, jest metoda spektrofotometryczna. Polega ona na tym, że szybkość spadku stężenia nadtlenku wodoru obserwuje się, mierząc spadek absorbancji przy długości fali 240 nm. Metodę tę można stosować wtedy, kiedy badany roztwór zawierający oznaczany enzym jest przezroczysty i bezbarwny. Jeżeli nie, to stosuje się metody miareczkowe, wśród nich najpopularniejsze jest miareczkowanie manganometryczne. Ilość powstającego w reakcji tlenu można określić manometrycznie, polarograficznie, a obecnie najczęściej za pomocą elektrody tlenowej Clarka. Aktywność katalazy oznacza się na podstawie ilości nadtlenku wodoru rozłożonego w ciągu 15 minut działania enzymu. Ilość H2O2 oznacza się manganometrycznie. Źródłem katalazy jest wyciąg z mąki. W zastosowanej metodzie aktywność katalazy wyraża się jako różnicę ilości cm3 0,1 N roztworu nadmanganianu potasowego zużytych w próbie ślepej i właściwej oraz wagowo jako ilość mg nadtlenku wodoru rozłożonego pod wpływem katalazy, przyjmując że 1 cm3 0,1 N roztworu nadmanganianu odpowiada 1,7 mg nadtlenku wodoru.

29. Przedstaw mechanizm działania peroksydazy i opisz metodę oznaczania jej aktywności. Peroksydaza (oksydoreduktaza donor:H2O2) jest to enzym występujący głównie w roślinach, choć spotyka się go także w niektórych organizmach zwierzęcych. Istnieje kilka peroksydaz - większość z nich jest niespecyficzna, ale są i peroksydazy specyficzne w stosunku do donora wodoru, np. peroksydaza cytochromowa czy peroksydaza glutationowa. Do peroksydaz niespecyficznych należy m. in. najlepiej poznana peroksydaza z chrzanu. Peroksydaza katalizuje reakcję typu: Jest to przeniesienie atomów wodoru z organicznego substratu na nadtlenek wodoru. Substratem, a więc donorem wodoru mogą być fenole i aminy aromatyczne, np. o-toluidyna, gwajakol, pirogalol, di-o-anizydyna. Aktywność peroksydazy oznacza się przez pomiar spadku stężenia nadtlenku wodoru lub donora atomów wodoru, względnie pomiar wzrostu stężenia utlenionej formy donora. Najczęściej stosuje się tę ostatnią metodę przy użyciu różnych donorów, między innymi gwajakolu, o-toluidyny, pirogalolu, dio-anizydyny. W opisanej niżej metodzie aktywność peroksydazy oznacza się przy użyciu di-o-anizydyny, która po odwodorowaniu w obecności nadtlenku wodoru i peroksydazy przechodzi w formę barwną. Intensywność powstałego zabarwienia jest proporcjonalna do aktywności enzymu.

Mieszanina reakcyjna zawiera nadtlenek wodoru i di-o-anizydynę. Po dodaniu wyciągu peroksydazy z roślin reakcję prowadzi się przez określony czas, po czym hamuje działanie enzymu przez dodanie kwasu solnego. Intensywność powstałego żółtego zabarwienia roztworu ocenia się poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 400 nm. Aktywność peroksydazy oblicza się w jednostkach międzynarodowych (J) na gram produktu. Na podstawie średniej pomiarów absorbancji badanych prób z krzywej wzorcowej odczytuje się ilość mikro gramów nadtlenku wodoru, jaka została rozłożona w 1 cm3 mieszaniny reakcyjnej w wyniku działania peroksydazy. Odczytane z krzywej wzorcowej dane podstawia się do wzoru i oblicza aktywność peroksydazy w 1 g badanego produktu.

27. Przedstaw mechanizm działania katalazy i opisz metodę oznaczania jej aktywności. Katalaza (oksydoreduktaza H2O2:H2O2) jest enzymem rozpowszechnionym w świecie zwierzęcym (wątroba, nerki), występuje jednak również w niektórych roślinach oraz we wszystkich bakteriach tlenowych. Katalaza, podobnie jak peroksydazą, jest hemoproteina. Cząsteczka katalazy składa się z czterech podjednostek, z których każda zawiera jedną cząsteczkę protohemu. Katalaza katalizuje reakcję typu: Jest to rozkład nadtlenku wodoru bez udziału dodatkowego substratu, polegający na przeniesieniu atomów wodoru z jednej cząsteczki H2O2 na drugą. W pewnych warunkach (niskie stężenie nadtlenku wodoru, duże stężenie odpowiednich donorów wodoru) katalaza może ujawniać aktywność peroksydazową, tzn. katalizować przeniesienie atomów wodoru z donorów wodoru, takich jak np. alkohol etylowy, fenole. Aktywność katalazy oznacza się przez pomiar szybkości spadku stężenia nadtlenku wodoru lub wzrostu stężenia tlenu. Najczęściej stosowana w biochemii, a także w chemii klinicznej, jest metoda spektrofotometryczna. Polega ona na tym, że szybkość spadku stężenia nadtlenku wodoru obserwuje się, mierząc spadek absorbancji przy długości fali 240 nm. Metodę tę można stosować wtedy, kiedy badany roztwór zawierający oznaczany enzym jest przezroczysty i bezbarwny. Jeżeli nie, to stosuje się metody miareczkowe, wśród nich najpopularniejsze jest miareczkowanie manganometryczne. Ilość powstającego w reakcji tlenu można określić manometrycznie, polarograficznie, a obecnie najczęściej za pomocą elektrody tlenowej Clarka. Aktywność katalazy oznacza się na podstawie ilości nadtlenku wodoru rozłożonego w ciągu 15 minut działania enzymu. Ilość H2O2 oznacza się manganometrycznie. Źródłem katalazy jest wyciąg z mąki. W zastosowanej metodzie aktywność katalazy wyraża się jako różnicę ilości cm3 0,1 N roztworu nadmanganianu potasowego zużytych w próbie ślepej i właściwej oraz wagowo jako ilość mg nadtlenku wodoru rozłożonego pod wpływem katalazy, przyjmując że 1 cm3 0,1 N roztworu nadmanganianu odpowiada 1,7 mg nadtlenku wodoru.