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Métodos y técnicas de cultivo. CRECIMIENTO MICROBIANO Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una población. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y será tratada al final de este capítulo. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis de componentes celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble de la inicial y su división por bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población. Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrónicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están creciendo, otras que están iniciando la división celular, etc. En un cultivo sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas. Microbiología General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. 2 Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes números en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microorganismos es en la mayoría de los casos depende de su número, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

MEDIOS DE CULTIVO Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autótrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterótrofos si utilizan carbono orgánico. La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgánico para los heterótrofos y como CO2 para los autótrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o de NO2 - o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO4 3-, el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4 2-, etc. Además, en ciertos casos, es necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más concreta es: C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056 esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo. Microbiología General Tema 2.Cultivo de microorganismos. 3 Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún agente solidificante que no sea consumible por

los microorganismos (normalmente agar). En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño.

MÉTODOS DE AISLAMIENTO El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos específicos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo). Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos de enriquecimiento del número de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el número de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento.

CONCEPTO DE CULTIVO PURO Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros son Microbiología General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. 4 esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiología de los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros.

Se realizó un análisis de varianza para evaluar el efecto de las técnicas de siembra con respecto al rendimiento utilizando el programa infoStat y una prueba de comparación de medias para evaluar el efecto de los tratamientos en las variables botánicas medidas. Todos los análisis se realizaron con un nivel de significancia de P<0,05. Resultado y Discusión: Altura de Planta: El análisis de varianza para altura de planta a la madurez fisiológica (Gráfico 1 y cuadro 1) indica que existe diferencia significativa entre trasplante, golpe cada 10cm, chorrillo y golpe cada 10 cm; pero solo hay diferencia mínima entre las dos últimas técnicas mencionadas. Si bien la técnica de trasplante resulto ser las alta, se debe mencionar que luego del trasplante, estas plantas durante la primera semana mostraron poco crecimiento, debido al cambio de condiciones ambientales y de suelo, una vez iniciado el desarrollo de sus raíces crecieron paulatinamente hasta alcanzar su altura total.

Longitud de Panoja: El análisis de varianza para el tamaño de panoja a la madurez fisiológica (Gráfico 2; cuadro 2) indica que existe diferencia significativa entre las técnicas de siembra y con una diferencia mínima entre chorrillo y golpe cada 10 cm. Gráfico 2: Longitud de panoja en función de las técnicas de siembra.

Panoja por Planta: El análisis de varianza para el tamaño de panoja a la madurez fisiológica (Gráfico 3; cuadro 3) indica que existe diferencia significativas entre las técnicas de siembra; sin embargo en relación a la técnica golpe solo hay diferencia minima de acuerdo a la distancia entre plantas. Gráfico 3: Numero de panoja por planta en función del las técnicas de siembra.

En el cuadro 4 podemos relacionar con lo anteriormente expuesto de acuerdo al ciclo del cultivo, donde la técnica de trasplante tiene mayor cantidad de días a cosecha siguiéndole la técnica de chorrillo y por último la técnica a Golpe. Haciendo referencia al rendimiento se observa aquí que Chorrillo supera a la técnica del trasplante por menos de 300 gramos debido al tener una mayor cantidad de plantas y al ser más pareja su producción. Podemos decir que estas dos técnicas mencionadas superan ampliamente a la técnica de golpe donde se obtuvo 2700 a 2800 kg/ha. Concluyendo señalamos que los caracteres agronómicos: altura de planta, longitud de panoja de la quinua están influenciadas por el carácter genotipo-ambiente (Velazco, 1995 y Wall, 1994). Asimismo los resultados obtenidos van corroborados por Burgasi 1990 en la que indica que para que la siembra de quinua tenga éxito en el crecimiento deben tomar en cuenta el poder germinativo, pureza varietal y la semilla debe estar libre de impurezas.