Medii De Cultura

3. MEDII DE CULTURĂ 3.1.

Noțiuni generale

Mediul de cultură (mediul nutritiv) reprezintă orice substrat (lichid sau solid, organic sau anorganic), obținut prin amestecarea mai multor substanțe cu proprietăți și compoziție specifice, ce poate asigura dezvoltarea și multiplicarea microorganismelor, în afara mediului lor natural. Mediile nutritive sunt utilizate la izolarea, creșterea, înmulțirea și conservarea timp îndelungat a microorganismelor, precum și pentru studierea proprietăților lor (caractere de cultură, proprietăți biochimice) în vederea identificării taxonomice (a se vedea Anexa 3). Pentru ca microorganismele să se poate dezvolta, mediile de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiții:  Să asigure microorganismelor cultivate cantitățile optime de apă și substanțe nutritive specifice, care pot avea rol de sursă de carbon și energie, sursă de azot, săruri minerale sau factori de creștere (tabel 4.1).  sursa de carbon și energie – este necesară reacțiilor de biosinteză, creșterii și multiplicării microorganismelor. Este reprezentată de compuși organici și anorganici: 1. monozaharide (arabinoza, glucoza sau dextroza, fructoza, galactoza, manoza, ramnoza, xiloza); 2. di- şi oligozaharide (celobioza, lactoza, maltoza, rafinoza, trehaloza, zaharoza sau sucroza); 3. polizaharide (amidon, celuloză, chitină, glicogen etc.); 4. acizi organici (citric, oxalic, tartric etc.); 5. lipide  sursa de azot - este necesară biosintezei de proteine și acizi nucleici. Microorganismele utilizează surse de azot organic și anorganic: 1. substanţe anorganice azotate (nitraţi, nitriţi, săruri de amoniu); 2. peptide şi proteine (peptonă, hidrolizat de cazeină, gelatină, keratină, ovalbumină); 3. aminoacizi (glicină, glutamină, histidină, triptofan etc.); 4. uree  sărurile minerale - sunt necesare în cantități mici și au rolul de a menține echilibrul ionic al celulei: - substanţe minerale (sub formă de săruri care să conţină Na, K, Mg, Ca, Fe, Cu, Zn, Co, P, S etc.)  factorii de creștere - sunt necesari în cantități mici acelor tulpini microbiene, numite tulpini auxotrofe, care sunt incapabile sa îi sintetizeze pornind de la substanțele cu rol de sursă de carbon sau azot 1. vitamine (tiamină, acid nicotinic, inozitol etc.); 2. acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (C12-C24), necesari pentru dezvoltarea levurilor lipodependente. Aceste substanțe trebuie să corespundă indicațiilor tehnice, să fie cântărite exact și să fie introduse în ordinea indicată în compoziția mediului respectiv. De asemenea, sterilizarea nu trebuie să altereze compoziția mediului; mediul trebuie să rămână steril până în momentul însămânțării.

 Să ofere condiții optime de aerobioză / anaerobioză corespunzătoare microorganismului de analizat;  Să asigure un grad de umiditate optim microorganismului cultivat;  Să aibă un anumit grad de alcalinitate sau aciditate corespunzător necesităților microorganismului cultivat;  Să fie repartizat în recipiente care să asigure menținerea sterilității și protecția față de lumină;  Să fie cât mai limpede pentru a putea fi studiate cât mai ușor caracterele microorganismului aflat în cultură. Tabel 4.1. Câteva ingrediente utilizate frecvent la prepararea mediilor nutritive Ingrediente Obținere Compoziție/Utilizare Peptona - prin hidroliza cărnii cu ajutorul - proteine cu greutate moleculară mare pepsică pepsinei conținute de mucoasa gastrică de porc, la 45-55ºC și la pH acid = 1,7-2,2 Peptona - prin acțiunea tripsinei extrase la - amestec de oligolipide și aminoacizi tripsică 37-40ºC și la pH = 7-8, timp de 12- (în proporție mai mică decât în 24 ore peptona pepsică) Peptona - prin acțiunea pancreatinei - amestec de oligolipide și aminoacizi pancreatică (tripsină+lipază+amilază ) Peptona - din soia - conținut ridicat de vitamine și papainică de aminoacizi soia - pentru cultivarea fungilor și germenilor pretențioși - nu se recomandă pentru studiul fermentației Sânge - se recoltează în condiții aseptice - se poate păstra la frigider la 4°C timp de la animale sănătoase (berbec, de 2-3 săptămâni cal, iepure) - se adaugă ca ingredient în într-un balon cu perle de sticlă proporție de 5-10 %, într-un mediu pentru defibrinare agarizat (lichefiat în prealabil și răcit la 45-50ºC) Serul - prin decantarea sângelui defibrinat - se folosește ca ingredient de și apoi sterilizare prin filtrare sau îmbogățire a unor medii de cultură tindalizare timp de 5-8 zile Bila de bou - prin puncție din vezica biliară și - are acțiune selectivă față de apoi sterilizare la 100ºC, timp de Salmonella sp. 30 min., 3 zile la rând Gelatina - prin hidroliza colagenului din os - agent solidificator al mediilor de și piele cultură Agarul - extras din algele marine - agent solidificator al mediilor de cultură (se adaugă 1,5-2%) Extract de - sursă de aminoacizi și vitamine drojdie - studiul drojdiilor și bacteriilor - de porumb - cultivarea bacteriilor și ciupercilor fitopatogene Extracte - de fasole - cultivarea bacteriilor din genul vegetale Rhizobium - de cartof - cultivarea mucegaiurilor

4.2. Pregătirea şi sterilizarea mediilor Prepararea mediilor este o etapă extrem de importantă, care condiţionează creșterea și multiplicarea, precum și exprimarea fenotipică a tuturor caracterelor culturale ale microorganismelor. Calitatea ingredientelor și modul de solubilizare a acestora, succesiunea adăugării lor, ajustarea pH-ului şi repartizarea mediilor în vederea sterilizării, metoda de sterilizare aplicată sunt factori importanți în reușita unui experiment. La prepararea unui mediu de cultură se parcurg următoarele etape: 1. Cântărirea ingredientelor conform rețetei (cu ajutorul balanței analitice și farmaceutice), dizolvarea completă și omogenizarea acestora în jumătate din cantitatea de apă, după care se adaugă restul de apă până la volumul dorit. În unele cazuri, substanțele se dizolvă prin încălzire; 2. Determinarea pH-ului și corectarea acestuia în funcție de specia ce urmează a fi cultivată. pH-ul se poate determina: o prin metoda colorimetrică (cu ajutorul substanțelor-indicator: albastru bromtimol, metil-orange, roșu de metil, fenolftaleină) sau hârtia de pH (impregnată cu indicatori de diferite culori): o prin metoda electrometrică utilizând pH-metrul (măsoară diferența de potențial electric generat de diferența de concentrație a ionilor de hidrogen între cei doi electrozi) 3. Filtrarea mediului de cultură pentru a îndepărta eventualele precipitate și recorectarea pHului (dacă este cazul); 4. Sterilizarea se realizează în funcție de compoziția mediului pentru a evita degradarea anumitor componente. Pentru majoritatea mediilor, sterilizarea se realizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15-20 minute. În cazul mediilor ce conțin zaharuri, sterilizarea se realizează prin autoclavare la 110°C, timp de 10-15 minute sau prin filtrare sterilizantă sau soluțiile conținând glucide se introduc separat prin filtrare cu ajutorul filtrelor Puradisc. În cazul mediilor conținând substanțe termolabile (ser, sânge, lapte, must, vitamine etc.), sterilizarea se realizează prin tindalizare sau filtrare sterilizantă; 5. Reajustarea pH-ului, dacă este cazul (în general după autoclavare, pH-ul scade cu aproximativ 0,3 uniăți); 6. Repartizarea mediului nutritiv în recipienți sterili (eprubete, tuburi Weinberg, tuburi Roux, flacoane Erlenmeyer sau plăci Petri) se face în preajma becului de gaz sau în hota cu flux laminar, în condiții aseptice, dar numai după ce mediul a fost deja sterilizat. Mediul de cultură steril poate fi păstrat câteva săptămâni la 4°C. 7. Înainte de folosirea mediilor, controlul sterilității se realizează prin incubare la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de ore.

4.3. Clasificarea mediilor de cultură Diversitatea compoziției mediilor de cultură impune realizarea unei clasificări care să țină cont de mai multe criterii: 1. După proveniență  Medii naturale : medii care conțin produse de origine:

vegetală (fragmente de tulpină, must de malț, tuberculi, rădăcini etc.);  animală (bilă, lapte etc).  Medii sintetice: medii care au o compoziție chimică bine definită (de exemplu mediul Czapek-Dox).  Medii artificiale: medii care conțin ingrediente cu compoziție chimică nedefinită (de exemplu: extracte de drojdii, extracte vegetale sau animale). 2. După consistență  Medii lichide  Medii semisolide  Medii solide - se subclasifică în:  Medii solide propriu-zise, care prin însăși compoziția lor sunt în stare solidă, (Exemplu: cele preparate din semințe, fragmente de tulpină, tuberculi, rădăcini etc).  Medii solidificate cu ajutorul gelatinei, silicagelului sau agarului. Agarul este cel mai utilizat agent de solidificare a mediilor, deoarece nu este metabolizat de către microorganisme, nu modifică pH-ul mediului și are proprietatea că la 40°C se prezintă sub formă de gel, iar la 100°C sub formă lichidă; 

3. După compoziție  Medii minimale: sunt utilizate la cultivarea microorganismelor cu necesități nutriționale scăzute.  Medii complexe: sunt folosite la cultivarea și conservarea germenilor care necesită numeroși factori de creștere (în această categorie intră majoritatea mediilor de cultivare a germenilor patogeni)  Solidificate: geloză-sânge, geloză-ser;  Lichide: bulion-sânge, bulion-ser, bulion-lichid de ascită 4. După scopul utilizării  Medii uzuale simple: sunt folosite în mod curent în laborator pentru cultivarea unui număr mare de microorganisme. Exemple: bulion nutritiv, apa peptonată, geloza simplă).  Medii speciale: prin compoziția lor complexă permit creșterea preferențială a unor anumite specii dintr-un amestec heterogen de microorganisme sau punerea în evidență a unor anumitor caractere metabolice ale microorganismelor. Din categoria mediilor speciale fac parte:  Mediile de îmbogățire: favorizează dezvoltarea unei specii de microorganisme dintrun amestec heterogen în care numărul germenilor este redus. Ele nu conțin substanțe bacteriostatice, dar prin compoziția lor asigură condiții preferențiale de creștere pentru anumite specii bacteriene, care se pot înmulți și dezvolta mai rapid decât microorganismele din asociație. Exemplu: mediul cu ou (mediu Löwenstein) favorizează dezvoltarea speciei de Mycobacterium tuberculosis. Există mai multe procedee care favorizează creșterea numărului de celule din specia de interes, cum ar fi: tratamentele termice, pH-ul selectiv al mediului, anumite substanțe nutritive din mediu, etc.  Mediile selective: conțin unul sau mai mulți agenți inhibitori (coloranți, antibiotice, săruri biliare etc.) . Scopul acestor inhibitori este de a limita multiplicarea anumitor microorganisme dintr-un amestec și favorizarea creșterii altor specii microbiene față de care nu au efect agenții inhibitori respectivi. Exemple: un mediu ce conține cristal









violet (1:500.000) sau penicilină (50 UI/mL mediu) inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram-pozitive. Azida de sodiu sau teluritul de potasiu inhibă creșterea bacteriilor Gram-negative și permite dezvoltarea celor Gram-pozitive. Sărurile biliare inhibă microorganismele cu excepția bacteriilor coliforme. Mediile elective: nu conțin inhibitori de creștere, dar prin compoziția lor specifică satisfac necesitățile minime ale unei anumite specii microbiene. Exemplu: mediul Loeffler este folosit pentru izolarea speciei de Corynebacterium diphteriae. Mediile de conservare sau de menținere: sunt destinate conservării timp îndelungat a microorganismelor. Ele trebuie să asigure o bună viabilitate a microorganismelor cultivate pentru un timp mai îndelungat. Exemple: mediul geloză simplă pentru bacterii, mediul YPG- Yeast Peptone Glucose pentru drojdii și mediile Sabouraud și Czapek-Dox pentru fungi. Mediile de transport: permit supraviețuirea tulpinilor microbiene ce nu pot fi însămânțate imediat după recoltare. Exemplu: mediul Carry-Blair pentru vibrionul holerei. Mediile de diagnostic preferențial: prin compoziția lor, evidențiază anumite particularități metabolice, caracteristice unei specii de microorganisme. Exemple: speciile de drojdii care fermentează substratul glucidic se recunosc prin acidifierea mediului, evidențiată cu ajutorul unei substanțe-indicator de pH și prin producerea de gaz. Pe geloza MacConkey (conține lactoză și roșu neutru), coloniile unor specii care fermentează lactoza se coloreză în roșu sau roz. Ele se diferențiază de cele care nu fermentează lactoza și rămân necolorate.

5. După prezența sau absența oxigenului  Medii pentru cultivarea microorganismelor aerobe  Medii pentru cultivarea microorganismelor anaerobe  pot avea aceeași compoziție ca și mediile pentru aerobi, dar li se adaugă substanțe cu efect reducător (acid ascorbic, cisteină, fragmente proaspete de organe vegetale sau animale, boabe de orez în curs de germinare, boabe de strugure, bucăți de ridiche, ficat, splină);  Pentru eliminarea aerului dizolvat în ele, mediile din această categorie trebuie fierte înainte de însămânțare;  Pentru cultivarea microorganismelor anaerobe pe medii lichide, după însămânțare se adaugă la suprafață un strat de ulei de parafină;  Pentru cultivarea microorganismelor anaerobe pe medii solide, acestea se repartizează în coloană pentru a evita difuzia oxigenului.

EXEMPLE - Medii de cultură pentru bacterii Bulion nutritiv Peptonă 10,0 g Extract de carne 10,0 g NaCl 5g Apă distilată 1000 mL Ingredientele se dizolvă la cald, iar după răcire pH-ul se ajustează la 7,6 cu NaOH. Mediul se filtrează prin hârtie și se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Mediul geloză simplă Bulion nutritiv 1000 mL Agar 20 g Amestecul se încălzește pe baie de apă până la dizolvarea agarului și se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 30 minute. Pentru a izola bacteriile acetice se folosește mediul geloză simplă, la care se adaugă pentru fiecare 10 mL de mediu câte 0,1 mL soluție de penicilină 0,25% și 0,2 mL soluție de natamicină 0,25%. Mediul se autoclavează timp de 1015 minute la 110°C sau se filtrează prin membrană sterilizantă. Mediul Luria-Bertani – cultivarea și conservarea bacteriilor Extract de drojdie Difco 5g Peptonă Difco 10 g Glucoză 20 g Agar 20 g Apă distilată 1000 mL pH = 7,0 Mediul se autoclavează la 120°C, timp de 15 minute. Apă peptonată Peptonă 10-20 g NaCl 5g Apă distilată 1000 mL Mediul se autoclavează la 121°C, timp de 30 minute.

EXEMPLE - Medii de cultură pentru fungi Mediul YPG – cultivarea și conservarea drojdiilor Extract de drojdie Difco 5-10 g Peptonă Difco 10 g Glucoză 20 g Agar 20 g Apă distilată 1000 mL Mediul se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Mediul Czapek-Dox – pentru cultivarea fungilor saprobionte Sucroză 30,0 g NaNO3 3, 0 g K2HPO4 0,35 g MgSO4 0,5 g KCl 0,5 g Sulfat feros 0,01 g Apă distilată 1000 mL pH = 7,3 Mediul se autoclavează la 121°C, timp de 15 minute. Mediul Czapek-pentru recoltarea fungilor Glucoză Extract de drojdie

30,0 g 5,0 g

NaNO3 3,0 g MgSO4 x 7H2O 1,0 g KCl 0,5 g Sulfat feros 0,01 g Agar 20,0 g Apă distilată 1000 mL pH = 6,0 Dacă se adaugă 40µg streptomicină/mL de mediu răcit la 45-50°C, mediul devine selectiv pentru mucegaiuri și drojdii. Mediul se sterilizează prin autoclavare, la temperatura de 121°C, timp de 15 minute. Mediul nutritiv cu amidon Amidon solubil Extract de drojdie Agar Agar nutritiv (geloză Martin) Mediul se sterilizează la 121°C, timp de 15 minute.

40 g 5g 20 g 1000 mL

Mediu cartof- glucoză-agar Infuzie de cartofi 200 g Glucoză 20 g Agar 15 g Apă distilată 1000 mL Componentele se pun în suspensie și se amestecă cu grijă. Se încălzește suspensia până la fierbere, agitând continuu. Se repartizează în flacoane și se sterilizează în autoclavă la 118°C timp de 15 minute.

4. PRELEVAREA ȘI PREPARAREA PROBELOR PENTRU TESTAREA MICROBIOLOGICĂ 4.1.  

Prelevarea probelor

Orice probă destinată testării microbiologice trebuie să îndeplinească anumite condiții: Proba repezentativă trebuie să reprezinte caracteristicile generale ale lotului din care a fost prelevată, motiv pentru care aceasta trebuie prelevată atât din profunzime, cât și de la suprafață; Stabilirea punctelor de prelevare a probelor se face în funcție de configurația lotului, recoltând în zig-zag, în diagonală sau în alte moduri care să asigure uniformitatea recoltării (figura 5.1).

Figura 5.1. Mod de recoltare a probelor în zig-zag (A) sau în diagonală (B) (sursa www.alcedoltd.ro)   

Prelevarea trebuie să se facă în condiții aseptice, în apropierea flăcării unei spirtiere, în recipienți și cu ustensile sterile (care pot fi flambate pe loc sau sunt sterilizate în prealabil prin autoclavare: bisturie, scalpere, pense, spatule inox). Etichetarea corectă a probei permite identificarea ușoară a acesteia. În unele cazuri se completează o fișă de prelevare. Se vor nota lotul din care a fost prelevată, locul, data, numărul probei, precum și alte caracteristici particulare utile testării microbiologice. Transportul probelor în recipienți izotermi și depozitarea acestora în frigider (0-4°C) au ca scop conservarea tuturor caracteristicilor probei, în principal a microflorei prezente în produs la momentul recoltării probei (atât din punct de vedere calitativ cât și cantitativ), până la efectuarea analizelor ce se impun (cât mai rapid posibil).

În continuare sunt prezentate câteva exemple referitoare la modul în care se poate face recoltarea probelor.  Prelevarea probelor de sol  se face în fiole de sticlă sau altfel de recipienți prevăzuți cu o bună închidere (inclusiv pungi) sterile;  se folosesc spatule care se flambează la flacăra unei spirtiere în momentul recoltării probei, atunci când proba provine de la mică adâncime sau sonde special destinate extragerii de la diferite adâncimi (figura 5.2).

Figura 5.2. Sonde destinate prelevării probelor de sol (sursa www.multilab.ro) 

Prelevarea probelor de apă  Din rețeaua de apă potabilă (de la robinet)  se folosesc sticle de 100-150 mL, cu dop rodat sau de cauciuc sterile;  se deschide robinetul şi se lasă să curgă în jet puternic, timp de 5-10 min., după care se închide robinetul şi se flambează;  se deschide din nou robinetul şi se reglează debitul apei, astfel încât să se formeze o coloană de apă continuă de maxim 1 cm diametru.  se scoate dopul flaconului, se aşează vertical sub coloana de apă, se umple şi se acoperă cu dopul.  Din râuri, lacuri, bazine, de acumulare sau alte surse de adâncime  se folosesc recipienți speciali, fixați pe tije sau prevăzuți cu dispozitive de scufundare (figura 5.3) Pentru examen microbiologic, probele de apă recoltate vor avea un volum minim de 500 mL, iar flacoanele vor fi umplute pâna la aproximativ 2 cm sub dop.

Figura 5.3. Sonde de prelevare manuală/automată a apelor de suprafață și subterane/de adâncime (sursa www.multilab.ro)

 Analiza aerului (determinarea aeroflorei) Aceasta are drept scop îndeplinirea şi realizarea criteriilor de igienă şi a criteriilor de siguranţă a alimentelor din diverse spaţii de procesare, transport şi comercializare, destinate industriei alimentare, farmaceutice, localurilor publice și mediului spitalicesc. O metodă clasică cu minimum de dotare reprezintă metoda Koch. Această metodă constă în expunerea la aer timp de 10 min. a unor cutii Petri conținând mediu nutritiv și astfel, colectarea pe suprafața acestuia a particulelor microbiene care se depun gravitațional, urmată de incubarea materialului. În funcție de dimensiunile încăperii, numărul cutiilor Petri utilizate poate să varieze între 7-12. Plăcile se aşează astfel: - repartizarea lor în încăpere trebuie să fie cât mai uniformă; - la o distanță de 1-1,5m față de pereți și de 2 m unele față de altele; - în încaperile de lucru – la nivelul suprafeţelor de lucru; - în depozite: - la înălţimea de 0,8 – 1,0 m. Dupa 10 min., plăcile se acoperă cu capacele lor și se incubează imediat la 37°C, timp de 48 de ore). În prezent se folosesc tot mai des aparate care aspiră un volum determinat de aer din incinta de analizat pe suprafața unui mediu de cultură solid care, după incubare va face posibilă aprecierea numărului de unități formatoare de colonii (UFC), adică a germenilor viabili din volumul de aer aspirat (figura 5.4).

Figura 5.4. Aparate pentru prelevarea probelor de aer (sursa www.multilab.ro)  Prelevarea probelor de lichide, solide și pulberi industriale Activitățile industriale îmbracă forme foarte variate, iar volumul produselor (materii prime și finite) care trebuie controlat este foarte mare, motiv pentru care, în prezent, tehnicile de prelevare a eșantioanelor destinate controlului sunt extrem de performante și foarte bine adaptate situațiilor (figura 5.5).

Figura 5.5. Instrumente pentru recoltarea probelor lichide, solide și pulberi industriale (sursa www.multilab.ro)

 Prelevarea probelor pentru determinarea microflorei de pe fructe, legume Se recoltează fructele de analizat în pungi de plastic sterile, se trec apoi în baloane cu apă distilată sterilă, fie întregi, fie bucăți, în cazul celor mai mari. Prin agitarea lor în balon, microorganismele trec în suspensie în apa distilată sterilă din balon, din ea urmând a se recolta probe, în fiole sterile, cu ajutorul unor pipete sterile.  Prelevarea produselor patologice (sânge, spută, urină, materii fecale, secreții și exudate etc.) se realizează conform unor tehnici care presupun anumite reguli stricte pentru fiecare categorie de produs în parte și o anumită pregătire medicală. o prelevarea unei probe provenind din organe și țesuturi: - cauterizarea suprafeței organului cu o spatulă special destinată acestui scop; - aspirarea lichidului cu o pipetă Pasteur sterilă, înțepând ușor organul de analizat; - însămânțarea probei pe un mediu de cultură adecvat, steril, prin una dintre metodele prezentate mai sus. o prelevarea unor probe din produse patologice fluide: - recoltarea sângelui cu o pipetă Pasteur prin puncții cu instrumente (ace, seringi) sterile, la nivelul cordului pentru animalele mici sau prin puncții venoase la cele mari; - recoltarea exudatelor (puroi, lichid pleural, peritoneal etc) cu acul sau pipeta Pasteur prin puncții sterile ale cavității respective; - recoltarea secrețiilor și excrețiilor cu sonde sterile; - însămânțarea probelor pe medii de cultură adecvate, sterile, prin una dintre metodele prezentate mai sus. o prelevarea unei probe provenind de pe suprafața mucoaselor: - recoltarea cu tampoane sterile, urmând însămânțarea directă cu tamponul pe suprafața mediului sau diluarea probei într-un lichid diluant (soluție fiziologică sterilă) și apoi etalarea suspensiei obținute prin una din tehnicile descrise anterior. Abordarea aprofundată a acestor metode face obiectul unei discipline de microbiologie specială (Microbiologie medicală).

4.2.

Pregătirea probelor prelevate

Determinarea încărcăturii microbiene a unui eșantion se poate analiza atât din punct de vedere calitativ, cât și cantitativ. În majoritatea cazurilor, analiza microbiologică a oricărui produs se realizează pornind de la suspensii obținute din eșantionul respectiv. Pregătirea probelor se face în condiții aseptice:  se ia tarra recipientului steril și se cântărește;  se cântârește aseptic o cantitate din proba de analizat, astfel încât rezultatele numărătorilor să se raporteze la greutatea produsului de analizat (echivalent per gram sau per mL);  se adaugă diluantul stabilit prin calcul, astfel încât să obținem soluția mamă cu titrul determinat 1/5, 1/10, 1/15 etc., în funcție de cât se presupune că este încărcată microbian proba respectivă. masa eșantionului din proba de analizat volumul total (eșantion + diluant)

Exemplu Dacă am cântărit 5 g dintr-un produs, atunci pentru a obține o soluție mamă de 1/10 se adaugă de 10 ori mai mult diluant. Aceasta înseamnă:

Atunci când se cuantifică încărcătura microbiană a unui gram de produs se realizează prin înmulțirea rezultatului obținut în urma analizei microbiologice a 1 mL soluție mamă cu 10. Diluantul utilizat la obținerea de suspensii este apa distilată sterilă sau soluție fiziologică sterilă (0,9% NaCl). El trebuie să asigure supraviețuirea tuturor microorgansimelor și nu trebuie să influențeze cantitativ sau calitativ microflora prezentă în produsul de analizat. În plus, pentru trecerea microorganismelor de pe suprafața produsului de analizat în diluant sau pentru cele care au un conținut ridicat de grăsimi se recomandă adăugarea la diluant a unui agent tensioactiv (de exemplu, Tween 80), fără efect microbiocid. Omogenizarea probei cu diluantul trebuie să se realizeze fără distrugerea microorganismelor prezente, astfel încât suspensia rezultată să fie cât mai limpede, fără particule de produs. După pregătirea eșantionului conform tehnicii prezentate mai sus, se trece la efectuarea unor diluții și la însămânțarea pe medii de cultură solide în vederea determinării U.F.C. (unități formatoare de colonii), folosind una dintre metodele prezentate la capitolul 8.