Material & Metode.docx

material dan metode  bahan Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA, M.W. = 40–75 kDa), poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-blockpoly(ethylene glycol) copolymer (PEG– PPG–PEG, M.W = 8.4 kDa) dan hewan uji pada tikus betina usia 4-5 minggu.  Persiapan nanopartikel PLGA RK ‑ 33 ioaded PLGA NPs berfungsi untuk menggabungkan RK-33 dengan menggunakan metode penguapan pelarut emulsi. 200 mg PLGA dan 10 mg RK-33 dilarutkan dalam 20 mL diklorometana dan ditambahkan sedikit demi sedikit larutan PBS yang mengandung 1% PVA, 0,2% PEG – PPG – PEG, dan 1% NaCl hingga 30 ml kemudian disonikasi selama 8 menit. Selanjutnya, diklorometana diuapkan, dan NP dicuci dengan air murni sebanyak lima kali, diliofilisasi (freeze drying), dan disimpan pada suhu -20 ° C sampai digunakan.  Karakterisasi partikel nano PLGA Untuk menentukan ukuran partikel, distribusi ukuran, dan zeta potensial dari PLGA NP, dynamic laser-light scattering(DLS) dilakukan pengukuran menggunakan alat Zetasizer Nano-ZS90 yang dioperasikan pada 633 nm, suhu 25 ± 1 °C, dan cahaya tersebar diukur pada sudut 90°. Untuk menentukan zeta

potensial NP

didispersikan dalam 10 mM NaCl.  Retensi in vivo 10 mg RK-33-PLGA NP (setara dengan 0,14 mg RK-33) diberikan secara intravena pada hewan uji tikus betina. Sebagai kelompok kontrol digunakan dosis standar 0,8 mg RK-33 yang diberikan secara intraperitoneal. 48 jam sesudah pemberian dosis, tikus terbunuh. kemudian diambil cuplikan darah tikus melalui intrakardial. Darah dikumpulkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah diberi heparin. Cuplikan darah dalam tabung disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 8000 rpm. larutan sampel 0,1 mL dari cuplikan darah tikus ditambahkan 1 mL kloroform /isopropanol dan campuran yang diperoleh dikocok kuat selama 3 menit dan disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan. Supernatan dipindahkan ke tabung

gelas dan diuapkan hingga kering pada suhu 37 ° C. Residu yang didapat dilarutkan dalam 100 μL asetonitril, dan hasilnya dianalisis dengan HPLC untuk menentukan RK-33 pada sampel.  Studi sitotoksisitas Viabilitas sel kanker ditentukan oleh uji MTS. Sel MCF-7 dibiakkan dalam 96-sumur plate, dan diobati dengan nanopartikel RK-33 pada konsentrasi tinggi dan untuk hari berikutnya konsentrasi nanopartikel diturunkan. Setelah inkubasi 72 jam, Pereaksi MTS ditambahkan ke dalam sel, dan diabsorbansi pada 490 nm setelah inkubasi 2 jam dengan Reagen MTS.