Manual_practicas_ig_2019.pdf

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT ÁREA DE CIENCIAS DE LA SALUD UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO ACADEMIA DE INMUNOBIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE DE INMUNOLOGÍA GENERAL

Responsables de la elaboración del manual Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián

Coordinador de la elaboración del manual Dr. Héctor Torres Larios

Ciudad de la Cultura “Amado Nervo”, Tepic Nayarit Octubre de 2016 Este documento cuenta con 78 páginas que contienen esquemas, dibujos y anexos

DIRECTORIO Rector M. en C. Ignacio Peña González

Secretaria de Docencia M.T.A. Norma Liliana Galván Meza

Coordinador del Área de Ciencias de la Salud M.O. Julio Cesar Rodríguez Arámbula

Directora de la Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y Farmacéuticas Q.F.B. Nadia Roxana Martínez Rubio

Coordinador de Programa M en C Isaac Espinoza Santana

Subdirectora Académica M. en C. Isabel Cristina Medina Carrillo

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ÍNDICE INTRODUCCIÓN COMPETENCIAS INTEGRADAS AL SISTEMA DE PRÁCTICAS ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS DENTRO DE LA PROFESIÓN CAMPO DE APLICACIÓN PROFESIONAL NIVELES DE DESEMPEÑO DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS PRÁCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD REGLAMENTO PARA USO DE LOS LABORATORIOS DE PRÁCTICAS DE LA UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT DISPOSICIONES DE ORDEN GENERAL REGLAMENTOS DE SEGURIDAD E HIGIENE NORMAS BÁSICAS DE COMPORTAMIENTO Y PROTECCIÓN PRÁCTICA No. 1 PIPETEO DE SOLUCIONES Introducción Competencia específica de la Práctica Criterios de desempeño

Página 4 5 5 6 7 7 8 8

12 12 14 16 17 18 19

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica

19

Cuadro de disposición de desechos

19

Normas oficiales mexicanas específicas de la práctica

20

Desarrollo de la práctica

20

Resultados esperados en relación con los criterios de desempeño

24

Criterios de calificación de la práctica

25

PRÁCTICA No. 2 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN Introducción Competencia específica de la Práctica Criterios de desempeño

26 27 28 28

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica

29

Cuadro de disposición de desechos

29

Normas oficiales mexicanas específicas de la práctica

30

Desarrollo de la práctica

31

Resultados esperados en relación con los criterios de desempeño

35

Criterios de calificación de la práctica

36

PRÁCTICA No. 3 REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN Introducción Competencia de la Práctica Criterios de desempeño

37 38 39 39

2

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica

39

Cuadro de disposición de desechos

40

Normas oficiales mexicanas específicas de la práctica

40

Desarrollo de la práctica

41

Resultados esperados en relación con los criterios de desempeño

43

Criterios de calificación de la práctica

43

PRÁCTICA No. 4 WESTERN-BLOT Introducción Competencia de la Práctica Criterios de desempeño

44 45 46 46

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica

46

Cuadro de disposición de desechos

47

Normas oficiales mexicanas específicas de la práctica

47

Desarrollo de la práctica

48

Resultados esperados en relación con los criterios de desempeño

55

Criterios de calificación de la práctica

56

PRÁCTICA No. 5 ELISA Introducción Competencia de la Práctica Criterios de desempeño

57 58 61 61

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica

62

Cuadro de disposición de desechos

62

Normas oficiales mexicanas específicas de la práctica

63

Desarrollo de la práctica

64

Resultados esperados en relación con los criterios de desempeño

67

Criterios de calificación de la práctica

68

CALIFICIÓN DE LAS PRÁCTICAS

69

CRITERIOS DE ACREDITACIÓN

69

ACERVOS DE CONSULTA

70

GLOSARIO DE TÉRMINOS

71

ANEXO (SOLUCIONES)

73

3

INTRODUCCIÓN La unidad de aprendizaje de Inmunología General incluye el desarrollo de métodos que pongan de manifiesto los procesos inmunológicos involucrados en el estado de salud y enfermedad de un individuo. En esta parte del curso-laboratorio, se desarrollan capacidades prácticas para la determinar células y moléculas del sistema inmune humano que tienen que ver con estados de salud-enfermedad y que coadyuvan con el diagnóstico médico. Los métodos que se utilizarán en el curso-Laboratorio son la base de aquellos utilizados en el diagnóstico clínico. Asimismo, se ponen en práctica las normas oficiales mexicanas que versan sobre el uso de disposición final de residuos peligrosos biológico-infecciosos (NOM86), la seguridad laboral, así como el fortalecimiento del trabajo en equipo. Esta unidad de aprendizaje utiliza los conocimientos adquiridos de Biología Celular, Bioquímica, Bioquímica avanzada, Microbiología, análisis Instrumental, morfofisiología. Asimismo, tiene relación con otras unidades de aprendizaje posteriores, sobre todo con aquella que tienen que ver con el diagnóstico de enfermedades, búsqueda de principios activos, y las relacionadas con la detección de metabolitos de interés clínico. Este manual está constituido por cinco prácticas, que pueden ser completadas en un tiempo de 3 horas semanales. En cada práctica de presente una breve introducción a la temática, los reactivos y métodos a utilizar, en forma de instrucciones numeradas que se complementan con figuras y esquemas. Asimismo, un espacio para la construcción de un diagrama de flujo, necesario para realizar la práctica.

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COMPETENCIAS INTEGRADAS AL SISTEMA DE PRÁCTICAS Al desarrollar las prácticas del Inmunología General serás competente para: 

Aplicar los métodos que pongan de manifiesto los diferentes procesos inmunológicos en un individuo.



Relacionar los datos obtenidos de la práctica con los fundamentos teóricos, que permitan interpretar los procesos inmunológicos involucrados.



Aplicar la normatividad involucrada en bioseguridad y buenas prácticas en el Laboratorio (NOM062, NOM086, ZOO 1999, reglamento de Laboratorio).



Desarrollar los aspectos éticos profesional-paciente

ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS DENTRO DE LA PROFESIÓN

Este manual te permitirá relacionar los aspectos teóricos de los procesos inmunológicos que tienen que ver con la reacción antígeno-anticuerpo, que son base para aquellas que se utilizan en el diagnóstico clínico. Asimismo, te permitirá interpretar resultados y relacionarlos con el estado de salud de un individuo.

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CAMPO DE APLICACIÓN PROFESIONAL CAMPO DE APLICACIÓN PROFESIONAL Necesidades de

Competencia

formación

integrada

Perfil profesional

Unidades de

Unidad de competencia

aprendizaje

profesional Aplica técnicas de análisis clínicos a las condiciones de cada paciente en todas sus fases Recolección de fluidos y excretas. Ejecuta métodos de laboratorio para análisis, determinaciones, control de calidad en los laboratorios implicados en su ejercicio profesional Separación y recolección de RPBI. Aplicación de legislación sanitaria Anatomía y funcionamiento del cuerpo humano

El conocimiento de las técnicas inmunológicas permitirá que el estudiante realice determinaciones de moléculas involucradas en los procesos de salud-enfermedad de un sujeto, con apego a la reglamentación sanitaria para la correcta disposición de residuos peligrosos biológico infeccioso y químicos.

El Químico Farmacobiólogo es el profesional del área de la salud que reúne los conocimientos, destrezas y actitudes que le permiten el uso de la ciencia básica y aplicada relacionada con sistemas químicos, biológicos y farmacéuticos desarrollando métodos, ejecutando procedimientos y evaluando resultados. Las habilidades del Químico Farmacobiólogo egresado de la Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y Farmacéuticas le permiten investigar, generar y mejorar recursos para aplicar, desarrollar, evaluar, analizar así como prestar tanto servicio como asesoría sobre las ciencias relacionadas con la salud a todos los niveles, que permitan prevenir y diagnosticar enfermedades, mantener y recuperar la salud en todas sus condiciones, por medio de métodos o procesos químicos, fisicoquímicos y biológicos. Su campo de acción es muy amplio, concentrándose en el campo de la salud, ciencias forenses, área farmacéutica y alimenticia, con gran capacidad de trabajo interdisciplinario dentro de un marco de ética, responsabilidad y compromiso hacia su entorno social, respondiendo de forma efectiva ante las grandes necesidades presentes y determinantes para su desarrollo. Respetando y aplicando en todo momento la normatividad vigente y aplicable.

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Inmunología General

Durante el desarrollo de la unidad de aprendizaje el estudiante será competente para conocer, identificar, describir y clasificar los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la respuesta inmunitaria, así como aplicar métodos que pongan de manifiesto los diferentes procesos inmunológicos para relacionar su participación con el estado de salud de un individuo, tomando en cuenta la normatividad vigente y los aspectos éticos profesional-paciente.

NIVELES DE DESEMPEÑO Con el sistema de prácticas que se aborda en este manual tú nivel de desempeño será 2, ya que se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo, variadas y aplicadas en diversos contextos. Algunas actividades son complejas y no rutinarias. Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonomía en las decisiones. A menudo requiere colaboración con otros y trabajo en equipo.

DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS COMPETENCIA ABORDADA

SEMANA

Control de la dispensación de

2-3

líquidos Identificación de Células del sistema

4-6

inmunológico

Evidenciar la interacción antígenoanticuerpo

7-8

PRÁCTICAS

Pipeteo de soluciones

Reacciones de precipitación Reacción de aglutinación

TIPO DE PRÁCTICA

BIBLIOGRAFÍA

Laboratorio

Básica

Laboratorio

Básica

Laboratorio

Básica

9-13

Western-blot

Laboratorio

Básica

14-17

ELISA

Laboratorio

Básica

PRÁCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD

REGLAMENTO PARA USO DE LOS LABORATORIOS DE PRÁCTICAS DE LA UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT

OBJETIVO GENERAL Que toda persona que haga uso de los laboratorios de prácticas de las unidades de aprendizaje de la unidad académica conozca y acate los lineamientos y normas a seguir en ellos, para mantener su buen funcionamiento, así como los derechos y obligaciones que como usuario de laboratorio tienen para salvaguardar la seguridad de todos los que en ellos trabajen. DISPOSICIONES GENERALES ARTÍCULO 1.- Las prácticas serán estrictamente supervisadas por el docente responsable. En caso contrario, estas no podrán realizarse debiendo ser reprogramadas de acuerdo con la disponibilidad del laboratorio. Excepcionalmente la dirección de la unidad académica podrá nombrar un suplente. ARTÍCULO 2.- Durante las sesiones, queda estrictamente prohibido hacer uso de juegos electrónicos, celulares, computadoras portátiles, reproductores de música y todo equipo ajeno a la práctica. El hacer caso omiso de esto, obligará a pedir la salida inmediata del laboratorio. En este caso se considerará inasistencia a la práctica correspondiente. ARTÍCULO 3.- Se prohíbe fumar y consumir alimentos y bebidas dentro del laboratorio. ARTÍCULO 4.- Es obligatorio traer uñas recortadas y cabello recogido. ARTÍCULO 5.- En caso de utilizar el microscopio queda estrictamente prohibido traer rímel en las pestañas, de lo contrario no podrá realizar la práctica. En este caso se considerará inasistencia a la práctica correspondiente.

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ARTÍCULO 6.- Durante el desarrollo de las prácticas, es obligatorio el uso de bata blanca debidamente cerrada, así como zapato cerrado y de piso. En caso de ser necesario, deberá usarse guantes, cubre boca y/o mascarilla, cofia, lentes de seguridad. ARTÍCULO 7.- Todas las sustancias, equipos y materiales deberán ser manejadas con el máximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de procedimiento, de seguridad y demás normas aplicables, según sea el caso. ARTÍCULO 8.- En caso de cualquier accidente personal, de equipo o material de trabajo; debe notificarse inmediatamente al maestro o al responsable. ARTÍCULO 9.- La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes y los Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos deberán tratarse de acuerdo a lo establecido en la norma NOM-087-ECOL-2002. ARTÍCULO 10.- En caso de requerir que algún equipo trabaje de manera continua, deberá dejarse en el interior del laboratorio correspondiente, la información acerca del tipo de reacción o proceso en desarrollo, las posibles fuentes de problema, la manera de controlar los eventuales accidentes y la forma de localizar al responsable de la unidad de aprendizaje. ARTÍCULO 11.- Se prohíbe realizar cualquier tipo de actividades ajenas al desarrollo de práctica. DEL RESPONSABLE DEL LABORATORIO ARTÍCULO 12.- El responsable del laboratorio tendrá las siguientes obligaciones: a) Leer íntegramente el presente reglamento en la primera sesión de trabajo de cualquier curso que se imparta en laboratorios. b) Llevar la agenda de uso del laboratorio. c) Atender a los diferentes grupos que tomen prácticas, independientemente del programa educativo o unidad de aprendizaje de que trate. d) Cuidar los equipos y materiales que en el laboratorio se encuentren. e) Asegurar que los reactivos y materiales para cada práctica se encuentren listos para el día y hora programada.

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f) Asegurar que los reactivos que se preparen se encuentren perfectamente etiquetados con el nombre de la sustancia a la que se refiere, fecha de preparación, caducidad, grupo y turno. Así como también especificar condiciones de almacenamiento. g) Al finalizar las actividades en el laboratorio, deberá verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, según sea el caso, apagados los equipos utilizados, luces, etc. h) Mantener actualizado el inventario de equipo, reactivos y material del laboratorio. i) Elaborar y /o actualizar el manual de procedimientos del laboratorio. j) Solicitar en tiempo los reactivos y consumibles que se requieren al responsable administrativo. k) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la Salud o Consejo de Programa Académico. DEL MAESTRO TITULAR DE LABORATORIO ARTÍCULO 13.- El maestro titular de laboratorio tendrá las siguientes obligaciones: a) Entregar con anterioridad el manual de práctica que se utilizará durante el curso al responsable del laboratorio, para la organización de las prácticas a realizarse. b) Presentarse de manera puntual, de preferencia 10 minutos antes del horario acordado. c) Dar a conocer el programa de prácticas en la primera sesión, así como formar equipos, para ser asignados el primer día del curso a una mesa de trabajo, para todo el semestre. d) Supervisar las actividades que se realicen en los laboratorios. e) Permanecer durante el desarrollo de la práctica y salir del laboratorio hasta que el último alumno haya concluido. f) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la Salud o Consejo de Programa Académico. DE LOS ALUMNOS ARTÍCULO 14.- Los alumnos tendrán las siguientes obligaciones:

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a) Ingresar al laboratorio a la hora indicada para la práctica y permanecer en el hasta el término de ella. b) Respetar la tolerancia máxima para entrar al laboratorio, que será de 10 minutos con respecto a la hora programada. Si se excede de este tiempo se considerará como inasistencia injustificada. c) En caso de inasistencia justificada con escrito de la Dirección, el alumno reprogramará la práctica con el maestro considerando la disponibilidad del laboratorio. d) Colocar mochilas o cualquier otro material ajeno a la práctica en el lugar establecido para ello. e) Responsabilizarse del material y equipo que utilicen en las diferentes actividades desarrolladas en los laboratorios. f) Hacer buen uso del material y equipo de laboratorio. Si por descuido, negligencia o uso indebido este es dañado por una persona, el importe de la reparación o sustitución del mismo será cubierto por el alumno o equipo correspondiente. g) El alumno que sustraiga material, sustancias y/o equipo de laboratorio se le prohibirá el ingreso al Laboratorio y se aplicarán las sanciones correspondientes establecidas en la Ley Orgánica Universitaria y el Estatuto de Gobierno. h) Si se requiere material adicional para realizar la práctica, deberá solicitarse al responsable del laboratorio. i) Al terminar las actividades desarrolladas deberán entregar su material limpio y dejar aseada el área de trabajo. j) Por ningún motivo deben permanecer los alumnos en el laboratorio después de la salida del maestro o responsable de laboratorio. k) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la Salud o Consejo de Programa Académico. Transitorios Primero. El presente reglamento entrará en vigor el día 06 del mes de agosto de 2007 y deroga todas las disposiciones anteriores.

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DISPOSICIONES DE ORDEN GENERAL Es este apartado se establecen los reglamentos y recomendaciones que deberás observar durante TODAS las prácticas y estancia en el laboratorio de Inmunología General. Es importante que sepas que la aplicación de estos preceptos serán evaluados en cada una de las prácticas y que es tu responsabilidad cumplirlos y dar evidencia de ello.

REGLAMENTOS DE SEGURIDAD E HIGIENE

CATEGORIA

Manejo de residuos peligrosos biológico infeccioso

CRITERIO MEDIO AMBIENTE En las áreas de generación de los establecimientos generadores, se deberán separar y envasar todos los residuos peligrosos biológicoinfecciosos, de acuerdo con sus características físicas y biológicas infecciosas

NOMBRE, NÚMERO Y PROCEDENCIA DE LA NORMA APLICABLE

NOM-087-ECOLSSA1-2002

Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas

Cumplir con las instrucciones de uso y mantenimiento del equipo de protección personal proporcionado por el patrón

NOM-005-STPS-1998

Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.

Conocer el grado de peligrosidad y los riesgos de las sustancias químicas peligrosas que se utilizan en el centro de trabajo Identificar los depósitos, recipientes y áreas que contengan sustancias químicas peligrosas o sus residuos

NOM-018-STPS-2000

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SISTEMA CONTRA INCENDIOS Contar con las instrucciones de seguridad aplicables en cada área del centro de Condiciones de trabajo y difundirlas entre los seguridad - prevención y trabajadores, contratistas y protección contra visitantes, según corresponda NOM-002-STPS-2010 incendios en los centros Cumplir con las condiciones de trabajo de prevención y protección contra incendios en el centro de trabajo EQUIPO DE PROTECCIÓN Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas

Cumplir con las instrucciones de uso y mantenimiento del equipo de protección personal proporcionado por el patrón

NOM-005-STPS-1998

Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo

Determinar el equipo de protección personal, que deben utilizar los trabajadores en función de los riegos de trabajo a los que puedan estar expuestos por las actividades que desarrollan o por las áreas en donde se encuentran

NOM-017-STPS-2008

Sistema para la administración del trabajo-seguridad en los procesos y equipo críticos que manejen sustancias químicas peligrosas

Observar los procedimientos relacionados con los procesos y equipos críticos que difunda el patrón

NOM-028-STPS-2012

Condiciones de iluminación en los centros de trabajo

PLANTA FÍSICA Contar con los niveles de iluminación en las áreas de trabajo

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NOM-025-STPS-2008

NORMAS BÁSICAS DE COMPORTAMIENTO Y PROTECCIÓN Deberás utilizar toalla o lienzo para limpieza en caso de requerirse, guantes y cubre bocas como protección, durante el tiempo de permanencia en el laboratorio. Pantalón y zapatos (no sandalias): Pantalón de mezclilla y zapatos cerrados. Necesarios, en caso de derrame de solución, evita el contacto con la piel. Debes conocer la ubicación exacta del botiquín de primeros auxilios, del extintor y también de la regadera de seguridad. En el laboratorio queda estrictamente prohibido comer, fumar y beber, así como jugar y hacer bromas a los compañeros de prácticas. Al entrar al laboratorio, debes hacerlo en forma ordenada. Cuando se realicen las prácticas, se prohibirá el ingreso de personas ajenas y la salida de alumnos. En caso de dañar material y/o equipo, deberá ser reemplazado en un máximo de una semana.

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CONTENIDO DE CADA PRÁCTICA

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

PRÁCTICA NÚMERO 1 PIPETEO DE SOLUCIONES

Responsables Q.F.B. Iris Celeste Tovar Ocampo Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza

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INTRODUCCIÓN La técnica del pipeteo abarca diferentes herramientas y medios que se requieren para pipetear. El empleo correcto de la técnica permite dosificar líquidos de forma rápida y sobretodo precisa, que es de suma importancia para el correcto desarrollo de las técnicas inmunológicas, que son altamente sensibles 1. La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científica Existen micropipetas de volumen fijo y volumen variable. Las de volumen variable a su vez están divididas por rangos de volumen, las más comunes van de 0.5-10 µL, de 10100 µL, y de 100-100 µL2. El pipeteo consiste en una práctica sencilla, ¿verdad? Sólo se trata de aspirar y dosificar líquidos. Aun así, pueden producirse errores con facilidad y repercutir directamente en la calidad de los resultados. A continuación se describen algunos consejos para el pipeteo 3: 

Profundidad de inmersión de la punta errónea: la correcta profundidad de inmersión de la punta puede mejorar la precisión en hasta un 5 %. La punta debe estar sumergida entre 1 y 2 mm en las pipetas de microvolumen y hasta de 3 a 6 mm en las pipetas de gran volumen, en función del tamaño de la punta. Si la punta se sumerge demasiado, el volumen de gas de la punta se comprime y provoca que se aspire demasiado líquido.



Ángulo de pipeteo erróneo: el ángulo de inmersión de la punta de la pipeta en la muestra debe ser lo más vertical posible y no debe desviarse más de 20 grados desde el ángulo vertical. Un ángulo más horizontal provoca que se introduzca demasiado líquido en la punta, lo que conlleva aspiraciones imprecisas. Por ejemplo, a un ángulo de 30 grados respecto al ángulo vertical, puede aspirarse hasta un 0,7 % de líquido en exceso.

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

Ritmo de pipeteo irregular: utilice un ritmo constante en el pipeteo entre muestras. Evite ir deprisa o realizar operaciones rápidas, y mantenga el ritmo para cada paso del ciclo de pipeteo.



Dosificación irregular: para lograr una precisión y una reproducibilidad superior entre muestras, asegúrese de dosificar hasta la última gota de la muestra, sin que quede nada adherido en el extremo de la punta. Para la mayoría de las aplicaciones, se recomienda la dosificación con el extremo de la punta apoyada contra la pared del recipiente, ya que así se reduce o se elimina la cantidad de muestra que queda en la punta. Esta técnica puede aumentar la precisión en un 1 % o más.



Preenjuague inadecuado o inexistente: La dosificación del líquido de una pipeta deja un recubrimiento del líquido en la punta, lo que provoca que el volumen expulsado sea ligeramente inferior de lo que debería ser. Preenjuagar una nueva punta dos veces, como mínimo, con el líquido que se va a utilizar acondicionará su interior.

1

http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Manejo_Liquidos&opc=tecnicas&idap=48

2

http://www.pce-iberica.es/instrumentos-de-medida/instrumentos-laboratorios/tecnicapipeteo.htm 3

http://www.mt.com/mx/es/home/supportive_content/news/po/pipe/pipetting-techniques.html

COMPETENCIA ESPECÍFICA DE LA PRÁCTICA

El estudiante será competente para la Identificación de componentes, manejo adecuado y uso de los componentes de ajuste de volumen, aspirado y expulsión de líquidos de micropipetas de volumen variable

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CRITERIOS DE DESEMPEÑO Identifica los componentes de las micropipetas Describe el funcionamiento de los componentes de ajuste de volumen, aspirado y expulsión de líquidos Maneja de manera adecuado las micropipetas de volumen variable Realiza mediciones de volumen con una precisión ≤ 10% Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica TIPO DE RIESGO

Reactivos mal cerrados (salpicadura en la piel)

COMO PROCEDER EN CASO DE UN ACCIDENTE

COMO EVITARLOS Supervisar que los reactivos estén colocados de acuerdo a su grado de toxicidad.

Que los frascos permanezcan cerrados y ventilados.

Lavar inmediatamente con agua abundante, es conveniente retirar la ropa para evitar que el corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.

Cuadro de disposición de desechos TIPO DE DESECHOS

COMO DESCARTARLOS

Vidrios

En depósitos de basura

Guantes, cubrebocas

En depósitos de basura

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TIPO DE CONTENEDOR Depositarlos en contenedores marcado como “Basura Común”. Depositarlos en contenedores y en bolsas negras, “Basura común”.

Normas Oficiales Mexicanas específicas de la práctica NOMBRE, NÚMERO Y CATEGORÍA

CRITERIO

PROCEDENCIA DE LA NORMA

Equipo

de

protección

personal

Equipo de protección personal acorde con

NOM-113-STPS-2009

sus características y dimensiones físicas, así como con los agentes de riesgo.

Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.

Cumplir con las instrucciones de uso y mantenimiento del equipo de protección personal proporcionado por el patrón

Conocer el grado de peligrosidad y los riesgos de las sustancias químicas peligrosas que se utilizan en el centro de trabajo Identificar los depósitos, recipientes y áreas que contengan sustancias químicas peligrosas o sus residuos

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

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NOM-005-STPS-1998

NOM-018-STPS-2000

RECURSOS MATERIALES Y EQUIPO Micropipeta 1-10 µL Micropipeta 10-100 µL Puntas blancas (0.5-10 µL) Puntas amarillas (10-200 µL) Tubos de ensaye de 13x100 Espectrofotómetro visible Celda para espectrofotómetro Agua destilada Solución de azul de metileno al 0.1% Solución de azul de metileno al 0.01% Material que debe traer el alumno Marcador indeleble Franela

PAUTAS GENERALES 

Revisar la pipeta al inicio del día de trabajo para retirar suciedad y polvo



Ajustar el volumen en el rango especificado para la pipeta



Sujetar la pipeta de forma que el reposamanos de la pipeta descanse sobre el dedo índice



Para maximizar exactitud, la pipeta, la punta y el líquido deben estar a la misma temperatura



Comprobar que las puntas son las adecuadas para la pipeta



Usar las puntas una sola vez

21



Enjuagar la punta varias veces en el líquido a pipetear antes del pipeteo para mejorar la exactitud, de acuerdo con la siguiente figura:



No volver la pipeta del revés, de forma que el líquido de la punta afecte al interior de la pipeta



Evitar contaminaciones de las puntas usando el eyector y los guantes

DESCRIPCIÓN DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

A) USO MICROPIPETA 1-10 MICROLITROS

1. Preparar 10 tubos de ensaye de 13x100 con 3 mL de agua corriente cada uno 2. Regular el volumen a 2 µL y presionar el émbolo hasta el primer tope 3. Introducir verticalmente la punta 1 mm en el líquido (solución de azul de metileno al 0.1%) 4. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial. Sacar la punta del líquido tocando las paredes del recipiente para dejar los excesos de líquido del exterior de la punta 5. Introducir verticalmente la punta 1 mm en el agua contenida en uno de los tubos de ensaye de 13x100 6. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el embolo hasta el primer tope y después hasta el segundo. De esta forma vaciamos totalmente la punta

22

7. Sacar la punta del recipiente tocando las paredes y dejamos el émbolo en su posición inicial 8. Repetir los pasos 2-7 para cada uno de los tubos preparados en el punto 1 9. Mezclar vigorosamente la solución de agua con colorante 10. Leer la absorbancia de cada tubo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 650 nm Repetir el proceso al menos 5 veces

B) USO MICROPIPETA 10-100 MICROLITROS

1. Preparar 10 tubos de ensaye de 13x100 con 3 mL de agua cada uno 2. Regular el volumen a 20 µL y presionar el émbolo hasta el primer tope 3. Introducir verticalmente la punta 2-3 mm en el líquido (solución de azul de metileno al 0.01%) 4. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial. Sacar la punta del líquido tocando las paredes del recipiente para dejar los excesos de líquido del exterior de la punta 5. Introducir verticalmente la punta 2-3 mm en el agua contenida en uno de los tubos de ensaye de 13x100 6. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el embolo hasta el primer tope y después hasta el segundo. De esta forma vaciamos totalmente la punta 7. Sacar la punta del recipiente tocando las paredes y dejamos el émbolo en su posición inicial 8. Repetir los pasos 2-7 para cada uno de los tubos preparados en el punto 1 9. Mezclar vigorosamente la solución de agua con colorante 10. Leer la absorbancia de cada tubo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 650 nm Repetir el proceso al menos 5 veces

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ANÁLISIS DE DATOS Obtener la media de las absorbancias ± la desviación estándar para los datos obtenidos en el inciso A) y el B) para cada una de las repeticiones. Cálculos:

Las lecturas de las absorbancias deben ser mayores a 0.1 Sacar el promedio de las lecturas, de este promedio se obtiene la desviación estar y se aplica la fórmula para sacar el porcentaje. Fórmula para porcentaje de desviación estándar. % 𝐷𝑆 =

𝑥 100

24

RESULTADOS

ESPERADOS

EN

RELACIÓN

CON

LOS

CRITERIOS

DESEMPEÑO EVIDENCIAS DE APRENDIZAJE

Lista

de

cotejo

sobre

CRITERIOS DE DESEMPEÑO

los Debes conocer cada uno de los componentes de las micropipetas

componentes de las micropipetas

Lista de cotejo sobre la descripción Debes conocer la función de cada uno de los del

funcionamiento

de

los componentes de las micropipetas

componentes de ajuste de volumen, aspirado y expulsión de líquidos de la micropipeta Tabla

de

resultados

de

10 Debes tener una precisión ≤10%, determinado

mediciones de volumen, promedio y como la desviación estándar de las 10 desviación estándar

mediciones con respecto al promedio de ellas.

Lista de cotejo sobre conocimiento Debes

conocer

las

normas

mexicanas

y aplicación de las normas de aplicables a la práctica (NOM-113-STPS-2009, seguridad

y

reglamentos NOM-005-STPS-1998 y NOM-018-STPS-2000)

respectivos.

25

DE

CRITERIOS DE CALIFICACIÓN DE LA PRÁCTICA las

10%

Lista de cotejo sobre la descripción del funcionamiento

20%

Lista

de

cotejo

sobre

los

componentes

de

micropipetas de los componentes de ajuste de volumen, aspirado y expulsión de líquidos de la micropipeta Lista de cotejo sobre el manejo de la micropipeta de

10%

volumen variable Tabla de resultados de 10 mediciones de volumen,

DS ≤10% -------- 50%

promedio y desviación estándar

20%≥DS>10%--30% DS>20% -----------0%

Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las normas de seguridad y reglamentos respectivos. DS= Desviación estándar

26

10%

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

PRÁCTICA NÚMERO 2 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN

Responsables Q.F.B. Iris Celeste Tovar Ocampo Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián

27

Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza INTRODUCCIÓN Los antígenos y anticuerpos interactúan por complementariedad espacial y no por uniones covalentes. La asociación específica del antígeno y el anticuerpo es dependiente de los puentes de hidrógeno, fuerzas electrostáticas, fuerzas de Van der Waals y el efecto hidrofóbico; todas ellas consideradas fuerzas débiles, aunque la suma de estas interacciones entre antígeno y anticuerpo pueden ser bastante fuerte. Al igual que los anticuerpos, los antígenos pueden ser multivalentes, es decir, contienen múltiples copias del mismo epítope, o a través de la presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos. Las interacciones multivalentes pueden producir mayor estabilidad en los complejos antígeno-anticuerpo, sin embargo la multivalencia puede también resultar en dificultades estéricas, lo que podría reducir la posibilidad de unión. Los complejos antígeno–anticuerpo insolubles forman una red tridimensional que debe ser voluminosa para que pueda observarse a simple vista, asimismo, los reactantes han de estar en proporciones adecuadas, ya que el exceso de cualquiera de ellos conducen a un cierto grado de solubilización del agregado molecular; debido a que la reacción antígeno–anticuerpo está sujeta a la ley de acción de masas. Es posible utilizar esta reacción In vitro para evidenciar la reacción antígenoanticuerpo, esta reacción se puede llevar a cabo en fase líquida o en soportes semisólidos y es visible de mejor manera cuando los complejos formados son de gran tamaño. Cuando un antígeno en solución se agrega de manera progresiva a un antisuero potente, se forman precipitados del complejo antígeno-anticuerpo. El entrecruzamiento de antígenos y anticuerpos da origen a estructuras enrejadas tridimensionales para formar grandes agregados que precipitan. A medida que se agregan más y más antígeno se alcanza un óptimo (zona de equivalencia) después del cual, de modo uniforme, se forma menos precipitado.

28

Tipos: 1. Inmunoprecipitación en medio líquido. 2. Inmunoprecipitación en medio sólido 3. Inmunodifusión Simple en tubo 4. Inmunodifusión Doble en placa 5. Inmunodifusión Simple en placa

COMPETENCIA ESPECÍFICA DE LA PRÁCTICA

El estudiante será competente para realizar reacciones de precipitación en medio líquido y sólido, así como interpretar los resultados obtenidos.

CRITERIOS DE DESEMPEÑO 

Realiza la reacción de precipitación en medio líquido



Identifica las diferentes zonas de la curva de precipitación



Realiza la cuantificación de un antígeno por Mancini



Describe el funcionamiento de los gradientes de concentración para la prueba de Mancini



Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos

29

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica COMO EVITARLOS

COMO PROCEDER EN CASO DE UN ACCIDENTE

Trabajar apegado al protocolo de la práctica

Detener el sangrado y hacer curación en caso de no requerir atención médica

TIPO DE RIESGO

Cortaduras

Reactivos mal cerrados (salpicadura en la piel)

Supervisar que los reactivos estén colocados de acuerdo a su grado de toxicidad.

Que los frascos permanezcan cerrados y ventilados.

Lavar inmediatamente con agua abundante, es conveniente retirar la ropa para evitar que el corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.

Cuadro de disposición de desechos TIPO DE DESECHOS

COMO DESCARTARLOS

TIPO DE CONTENEDOR

Depositarlos en contenedores y/o Materia orgánica

En depósitos de basura

bolsas rojas con la leyenda desechos biológicos según corresponda. Depositarlos en contenedores y

Basura común

En depósitos de basura

en bolsas negras, “Basura común”.

30

Normas Oficiales Mexicanas específicas de la práctica NOMBRE, NÚMERO Y CATEGORÍA

PROCEDENCIA DE LA

CRITERIO

NORMA Equipo

de

protección

Equipo de protección personal

NOM-113-STPS-2009

acorde con sus características y

personal

dimensiones físicas, así como con los agentes de riesgo. Se deberán separar y envasar Manejo peligrosos

de

residuos

todos

biológico

biológico-infecciosos, de acuerdo

infeccioso

los

residuos

peligrosos NOM-087-ECOL-SSA1-2002

con sus características físicas y biológicas infecciosas

Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas

Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.

Cumplir con las instrucciones de uso y mantenimiento del equipo de protección personal proporcionado por el patrón

NOM-005-STPS-1998

Conocer el grado de peligrosidad y los riesgos de las sustancias químicas peligrosas que se utilizan en el centro de trabajo NOM-018-STPS-2000 Identificar los depósitos, recipientes y áreas que contengan sustancias químicas peligrosas o sus residuos

31

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO A) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO

B) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO (Mancini)

32

RECURSOS MATERIALES Y EQUIPO A) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO 16 tubos capilares 14 copas de 1 mL Gradilla Micropipeta de 20 a 200 µL Puntillas para micropipetas Pipetas serológicas de 1 mL Solución salina Antígeno soluble 50 mg/mL Antisuero de conejo anti-BSA Material que debe traer el alumno Plastilina Papel absorbente o papel rollo Regla graduada en milímetros Marcador indeleble Franela

B) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO (Mancini)

Portaobjetos limpios y desengrasados Horadador de 3 mm de diámetro Pipetas serológicas de 10 mL, de punta ancha Pipetas serológicas de 1 mL

33

Pipetas Pasteur Matraz Erlenmeyer y /o vasos de precipitado de 50 a 100 mL Agarosa tipo II, medio EEO al 1% en SSF Agarosa tipo II, medio EEO al 0.1% en SSF Solución salina fisiológica Solución de timerosal al 1% Antisuero Solución de antígeno a diferentes concentraciones (inicial 1 mg/mL) Material que debe traer el alumno Papel absorbente o papel rollo Regla graduada en mm Molde de plástico de 10 x 8 cm Marcador indeleble Franela

DESCRIPCIÓN DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA A) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO 1. Haga 14 diluciones dobles seriadas del antígeno, en copas de 2 mL, con un volumen final de 0.2 mL 2. Divida los tubos capilares en tres partes iguales, utilizando un marcador indeleble 3. Llene el tubo capilar con antisuero hasta la primera marca y limpie el exterior del tubo con papel absorbente, para eliminar el antisuero adherido al exterior del mismo. 4. Invierta el tubo capilar, y haga descender el antisuero hasta el borde de extremo contrario. 5. Tome un volumen de antígeno, de tal manera que el líquido dentro del capilar llegue hasta la segunda marca. No debe haber burbujas en la interfase entre el antisuero y el antígeno. Limpie la parte externa del capilar con papel absorbente.

34

6. Mezcle el contenido por rotación y por inversión del capilar y centre. Tapar uno de los extremos del capilar con el dedo índice e introduzca el extremo contrario en plastilina. 7. Repita los pasos 3, 4, 5 y 6 para cada una de las diluciones del antígeno. 8. Utilice como controles un tubo capilar en el que reemplace el antígeno por solución salina y otro en el que reemplace el antisuero por solución salina. 9. Mantenga los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24 a 48 h. 10. Mida la cantidad de precipitado en cada uno de los tubos, con la ayuda de una regla. Llene la tabla que se muestra a continuación y haga una gráfica con los datos obtenidos, colocando en las abscisas la concentración de antígeno y en las ordenadas la cantidad de precipitado en mm y localice las tres zonas de la curva de precipitación.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Dilución BSA ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 1/8192 1/16384

Concentración BSA

Mm precipitado

B) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO (MANCINI)

1. Prepare los portaobjetos barnizados con agarosa al 0.1% 2. Toma 4 mL de agarosa al 1% en un vaso de precipitado. Deje enfriar hasta una temperatura aproximada de 45°C, y añadir 3% (V/V), del antisuero, mezclando perfectamente. Adicione solución de timerosal hasta una concentración de 0.01%.

35

3. Coloque los portaobjetos barnizados, sobre una superficie completamente horizontal y con una pipeta serológica de punta ancha, colocar 4 mL de la solución de agarosa preparada en el punto anterior. Deje gelificar a temperatura ambiente y coloque los portaobjetos en cámara húmeda hasta su uso. 4. Haga 5 perforaciones de 3 mm de diámetro. Remueva la agarosa del interior de las perforaciones. 5. Llene 4 pozos con 10 µL de las soluciones de antígeno, a concentraciones conocidas (1mg/mL, 0.75 mg/mL, 0.50mg/m, 0.25 mg/mL). Llene el quinto pozo con la solución problema de antígeno. 6. Mantenga las placas en cámara húmeda a temperatura ambiente, durante 24-48 h. 7. Mida el diámetro de los halos de precipitación formados. Haga una gráfica en Excel colocando la concentración de antígeno en el eje de las abscisas y el cuadrado del halo de precipitación en el eje de las ordenadas. Interpole el valor del diámetro encontrado con la solución problema para determinar su concentración.

RESULTADOS

ESPERADOS

EN

RELACIÓN

CON

LOS

CRITERIOS

DESEMPEÑO EVIDENCIAS DE APRENDIZAJE

CRITERIOS DE DESEMPEÑO

Lista de cotejo sobre la realización de Debes preparar correctamente los tubos la reacción de precipitación en medio capilares para la determinación de la líquido

reacción de precipitación en medio líquido

Rúbrica sobre el gráfico sobre la curva Debes realizar el gráfico y entregarlo en hoja de precipitación

blanca, en el que se indiquen los nombres de los ejes y las diferentes zonas de la curva de precipitación. Deberás incluir una portada para tu trabajo

Lista de cotejo sobre la realización de Debes

preparar

correctamente

los

la reacción de precipitación en medio portaobjetos para la determinación de la sólido

reacción de precipitación en medio sólido

Rúbrica sobre el gráfico para la Debes realizar el gráfico y entregarlo en una determinación de la concentración de hoja blanca, en el que se indiquen los BSA de la muestra problema

nombres de los ejes, la ecuación de la recta,

36

DE

obtenida mediante el método de mínimos cuadrados y reportar la concentración de la solución problema de antígeno. Deberás incluir una portada para tu trabajo.

Lista de cotejo sobre la función de los Debes explicar la función de cada uno de los componentes de las reacciones de componentes precipitación realizadas.

de

las

reacciones

de

precipitación realizadas.

Lista de cotejo sobre conocimiento y Debes conocer las normas mexicanas aplicación de las normas de seguridad aplicables a la práctica (NOM-113-STPSy reglamentos respectivos.

2009, NOM-087-ECOL-SSA1-2002, NOM005-STPS-1998 y NOM-018-STPS-2000)

CRITERIOS DE CALIFICACIÓN DE LA PRÁCTICA Lista de cotejo sobre la preparación de diluciones dobles seriadas Lista de cotejo sobre la realización de la reacción de precipitación en

10% 5%

medio líquido Gráfico sobre la curva de precipitación

20%

Lista de cotejo sobre la realización de la reacción de precipitación en medio sólido Gráfico para la determinación de la concentración de antígeno de la muestra problema Lista de cotejo sobre la función de los componentes de las reacciones de precipitación realizadas. Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las normas de seguridad y reglamentos respectivos.

37

10%

30%

15%

10%

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

PRÁCTICA NÚMERO 3

REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN

Responsables Q.F.B. Iris Celeste Tovar Ocampo Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza

38

INTRODUCCIÓN La interacción antígeno-anticuerpo es una relación bimolecular parecida a la interacción enzima-sustrato, con una diferencia importante: no conduce a una alteración química irreversible en el anticuerpo ni en el antígeno. La relación entre un anticuerpo y un antígeno incluye varias interacciones no covalentes entre el determinante antigénico, o epítopo, del antígeno y el dominio de región variable de la molécula del anticuerpo, en particular las regiones hipervariables, o regiones determinantes de complementariedad (Kuby et al, 2007). La minuciosa especificidad de las interacciones antígeno-anticuerpo condujo al desarrollo de una diversidad de pruebas inmunológicas, que pueden utilizarse para detectar la presencia de anticuerpo o de antígeno. Los inmunoensayos han sido de vital importancia en el diagnóstico de enfermedades, la vigilancia del grado de respuesta inmunitaria humoral y la identificación de moléculas de interés biológico o médico. Estas valoraciones difieren en su rapidez y sensibilidad; algunas son estrictamente cualitativas, otras son cuantitativas (Kuby et al, 2007). La interacción entre el anticuerpo y un antígeno particulado resulta en un agrupamiento visible llamado aglutinación. Los anticuerpos que producen estas reacciones se denominan aglutininas. Del mismo modo en que un exceso de anticuerpo inhibe las reacciones de precipitación, este exceso también puede inhibir las reacciones de aglutinación; tal inhibición se denomina efecto prozona. Ya que los efectos prozona pueden encontrarse en muchos tipos de inmunoensayos, comprender la base de este fenómeno tiene importancia general (Kuby et al, 2007). La estimulación antigénica de linfocitos B, junto con las señales brindadas por los linfocitos T, llevan a la activación y diferenciación en células plasmáticas, que son las que responsable de la producción d anticuerpos que encontramos en el suero de un individuo. Los anticuerpos producidos son específicos para el antígeno que indujo su producción, por lo que evidenciar la presencia de anticuerpos contra un antígeno determinado en un individuo, nos permite confirmar que dicho sujeto estuvo en contacto con el antígeno en cuestión.

39

COMPETENCIA ESPECÍFICA DE LA PRÁCTICA El estudiante será competente para realizar e interpretar reacciones e aglutinación. CRITERIOS DE DESEMPEÑO 

Prepara diluciones dobles seriadas



Realiza reacciones de aglutinación



Interpreta las reacciones de aglutinación



Describe los conceptos de título, dilución, prozona



Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos.

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica TIPO DE RIESGO

COMO EVITARLOS

COMO PROCEDER EN CASO DE UN ACCIDENTE

Cortaduras

Trabajar apegado al protocolo de la práctica

Detener el sangrado y hacer curación en caso de no requerir atención médica

Reactivos mal cerrados (salpicadura en la piel)

Supervisar que los reactivos estén colocados de acuerdo a su grado de toxicidad.

Que los frascos permanezcan cerrados y ventilados.

40

Lavar inmediatamente con agua abundante, es conveniente retirar la ropa para evitar que el corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.

Cuadro de disposición de desechos TIPO DE DESECHOS

COMO DESCARTARLOS

Vidrios, y jeringas

En depósitos de basura

Agujas

En depósitos de basura para RPBI

TIPO DE CONTENEDOR

Depositarlos en contenedores marcado como “Basura Común”. Depositarlos en contenedor rojo, marcado como “RPBI”. Depositarlos en contenedores y/o

Materia orgánica

bolsas rojas con la leyenda

En depósitos de basura

desechos biológicos según corresponda.

Basura común

Depositarlos en contenedores y en

En depósitos de basura

bolsas negras, “Basura común”.

Normas Oficiales Mexicanas específicas de la práctica NOMBRE, NÚMERO Y CATEGORÍA

PROCEDENCIA DE LA

CRITERIO

NORMA Equipo

de

protección

Equipo de protección personal acorde

NOM-113-STPS-2009

con sus características y dimensiones

personal

físicas, así como con los agentes de riesgo. Se deberán separar y envasar todos los Manejo peligrosos

de

residuos

residuos

peligrosos

biológico-

biológico

infecciosos,

de

con

infeccioso

características

acuerdo físicas

y

sus

biológicas

NOM-087-ECOL-SSA12002

infecciosas Condiciones de seguridad e higiene en los centros de

Cumplir con las instrucciones de uso y mantenimiento del equipo de protección

41

NOM-005-STPS-1998

trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas

Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.

personal proporcionado por el patrón

Conocer el grado de peligrosidad y los riesgos de las sustancias químicas peligrosas que se utilizan en el centro de trabajo. Identificar los depósitos, recipientes y áreas que contengan sustancias químicas peligrosas o sus residuos

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

42

NOM-018-STPS-2000

RECURSOS MATERIALES Y EQUIPO 

Baño María ajustado a 37ºC



Gradilla



Tubos de ensaye de 13 x 100



Pipetas serológicas de 1 mL



TBS-Gelatina al 0.05% (TBS-G)



Suero anti-glóbulos rojos descomplementado (calentado a 56°C durante 30 minutos).



Glóbulos rojos de humanos en suspensión al 0.5% en TBS-G.

Material que debe traer el alumno  

Marcador indeleble Franela

DESCRIPCIÓN DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA AGLUTINACIÓN DIRECTA Titulación de un suero anti-glóbulos rojos 1. Marque 11 tubos de 13x100 del 1 al 11 2. Prepare 10 diluciones dobles seriadas del suero anti-glóbulos rojos de carnero, utilizando TBS-G como diluyente (Tubos 1 al 11). Considere un volumen final de 0.2 mL de cada dilución. 3. En el tubo 11 adicione 0.2 mL de TBS-G 4. Adicione 0.2 mL de glóbulos rojos a cada uno de los 11 tubos preparados, mezcle suavemente. 5. Incube en Baño María a 37 °C durante 1 h. 6. Centrifugue durante 1 minuto a 3000 rpm. 7. Mezcle suavemente los tubos a contraluz y observe la presencia de aglutinación (grumos). Verificar que no exista aglutinación en el tubo 11 (control). 8. Reporte el título del suero, que es el inverso de la dilución máxima en la cual aún se observa aglutinación de eritrocitos.

43

RESULTADOS

ESPERADOS

EN

RELACIÓN

CON

LOS

CRITERIOS

DESEMPEÑO EVIDENCIAS DE APRENDIZAJE Lista

de

cotejo

sobre

CRITERIOS DE DESEMPEÑO

la Debes preparar correctamente las diluciones

preparación de diluciones dobles requeridas para la determinación del título de la seriadas Lista

reacción de aglutinación

de

cotejo

desarrollo

de

la

sobre técnica

aglutinación

el Debes

realizar correctamente la mezcla de

de reactivos para lleva a cabo la reacción de aglutinación

Lista de cotejo sobre conceptos Debes conocer los conceptos de título, dilución y los de título, dilución, prozona

prozona

Determinación del título de la Debes proporcionar el título de la reacción de reacción de aglutinación Lista

de

cotejo

aglutinación sobre Debes conocer las normas mexicanas aplicables a

conocimiento y aplicación de las la normas

de

seguridad

reglamentos respectivos.

práctica

(NOM-113-STPS-2009,

NOM-087-

y ECOL-SSA1-2002, NOM-005-STPS-1998 y NOM018-STPS-2000)

CRITERIOS DE CALIFICACIÓN DE LA PRÁCTICA Lista de cotejo sobre el desarrollo de la técnica de aglutinación

40%

Lista de cotejo sobre conceptos de título, dilución, prozona

20%

Determinación del título de la reacción de aglutinación

30%

Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las normas de 10% seguridad y reglamentos respectivos.

44

DE

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

PRÁCTICA NÚMERO 4

WESTERN-BLOT

Responsables Q.F.B. Iris celeste Tovar Ocampo Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza

45

INTRODUCCIÓN Es posible la identificación de una proteína específica en una mezcla compleja de proteínas mediante una técnica conocida como “Western blot”, así denominada por su similitud con “Southern-blot”, que detecta fragmentos de DNA, y con “Northern-blot”, que detecta mRNA. En el “Western-blot”, una mezcla de proteínas es separada en un gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Las bandas de proteínas se transfieren entonces a una membrana de nitrocelulosa, utilizando corriente eléctrica para ello, para realizar posteriormente la inmunodetección. Los complejos Ag-Ab que se forman en la banda que contiene la proteína reconocida por el anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radiactivo se unió a la proteína de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot) exponiendo una placa de rayos X a la membrana, un procedimiento que se conoce como autorradiografía. Sin embargo, en los procedimientos de detección que más se usan suelen emplearse anticuerpos contra la proteína conjugados a una enzima. Tras la unión del conjugado de enzima y anticuerpo, la adición de un sustrato cromógeno que produce un producto de color intenso e insoluble origina la aparición de una banda de color en el sitio del antígeno blanco. Puede lograrse una sensibilidad mucho más alta si se usa un compuesto quimioluminiscente aunado a agentes de realce adecuados para producir luz en el sitio del antígeno. La aplicación más amplia de este procedimiento es como prueba de confirmación de VIH, donde el Western blot se utiliza para determinar si el paciente tiene anticuerpos que reaccionan con una o más proteínas víricas. Tomado de: Kindt, T. J., Goldsby, R. A. O., Kuby, B. A., Kindt, J. T. J., Goldsby, R. A., & Osborne, B. A. (2007). Inmunología de Kuby (No. Sirsi) i9789701064542).

46

COMPETENCIA ESPECÍFICA DE LA PRÁCTICA El estudiante será competente para realizar la separación electroforética de proteínas y poner de manifiesto la presencia de anticuerpos específicos, mediante la técnica de western-blot. CRITERIOS DE DESEMPEÑO 

Realiza la separación electroforética de proteínas



Realiza la transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa



Realiza la inmunodetección de anticuerpos específicos



Describe los conceptos de movilidad relativa (Rf), electroforesis, anticuerpo primario, anticuerpo secundario, cromógeno



Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos.

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica TIPO DE RIESGO

Cortaduras

Reactivos mal cerrados (salpicadura en la piel)

COMO EVITARLOS

COMO PROCEDER EN CASO DE UN ACCIDENTE

Trabajar apegado al protocolo de la práctica

Detener el sangrado y hacer curación en caso de no requerir atención médica

Supervisar que los reactivos estén colocados de acuerdo a su grado de toxicidad.

Que los frascos permanezcan cerrados y ventilados.

47

Lavar inmediatamente con agua abundante, es conveniente retirar la ropa para evitar que el corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.

Cuadro de disposición de desechos TIPO DE DESECHOS

COMO DESCARTARLOS

Vidrios, y jeringas

En depósitos de basura

Agujas

En depósitos de basura para RPBI

TIPO DE CONTENEDOR

Depositarlos en contenedores marcado como “Basura Común”. Depositarlos en contenedor rojo, marcado como “RPBI”. Depositarlos en contenedores y/o bolsas

Materia orgánica

En depósitos de basura

rojas con la leyenda desechos biológicos según corresponda.

Basura común

En depósitos de basura

Depositarlos en contenedores y en bolsas negras, “Basura común”.

Normas Oficiales Mexicanas específicas de la práctica NOMBRE, NÚMERO Y CATEGORÍA

CRITERIO

PROCEDENCIA DE LA NORMA

Equipo

de

protección

Equipo de protección personal acorde con sus

NOM-113-STPS-2009

características y dimensiones físicas, así como

personal

con los agentes de riesgo.

Manejo peligrosos

de

residuos biológico

infeccioso

Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas

Se deberán separar y envasar todos los residuos peligrosos biológico-infecciosos, de

NOM-087-ECOL-SSA1-

acuerdo con sus características físicas y

2002

biológicas infecciosas

Cumplir con las instrucciones de uso y mantenimiento del equipo de protección personal proporcionado por el patrón

48

NOM-005-STPS-1998

peligrosas Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.

Conocer el grado de peligrosidad y los riesgos de las sustancias químicas peligrosas que se utilizan en el centro de trabajo. NOM-018-STPS-2000 Identificar los depósitos, recipientes y áreas que contengan sustancias químicas peligrosas o sus residuos

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

49

RECURSOS MATERIALES Y EQUIPO 

Micropipetas



Puntas para micropipetas



Tubos cónicos de 50 mL



Tubos cónicos de 2 mL



Sistema de electroforesis Miniprotean III (Biorad)



Fuente de poder EC250



Centrífuga para tubos tipo Eppendorf ®



Placa de calentamiento para tubos de 2 mL



Papel filtro

Material que debe traer el alumno    

Marcador indeleble Franela Guantes Molde de plástico de 10 x 8 cm



Molde de plástico de 10 x 2 cm



Guantes de látex

Reactivos para electroforesis en gel de poliacrilamida 

Solución de Acrilamida-Bis-Acrilamida



Solución de Tris-HCl 1.5 M pH 8.8



Solución de Tris-HCl 0.5 M pH 6.8



Agua destilada



Solución de SDS al 10%



Solución de Persulfato de amonio al 10%



TEMED



Regulador de muestra 2X



Regulador de corrimiento



Solución de trabajo para tinción de proteínas con azul de Coomassie



Solución decolorante para geles de Poliacrilamida

50



Solución de ácido acético al 10%



Solución de BSA 1 mg/mL



Marcadores de peso molecular preteñidos

Reactivos para transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa 

Sistema de electrotransferencia (Mini Trans-Blot®Cell. BIORAD)



Regulador de Transferencia



Membrana de nitrocelulosa

Reactivos para Inmunodetección 

Contenedor plástico para incubación de tiras de nitrocelulosa.



Solución PBS-Tween20 al 0.25% (TBS-T)



Solución bloqueadora (PBS-G) (PBS-T 0.1% con gelatina al 0.3%)



Suero de conejo inmunizado con BSA



Anticuerpos anti-Ig’s totales de conejo producidos en cabra y conjugados a peroxidasa.



Solución reveladora (western-blot)



Colorante Rojo Poceau 0.2% en ácido acético al 1%



Solución ácido acético al 1%

DESCRIPCIÓN DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Tomar en cuenta la siguiente imagen para la realización de la práctica:

51

PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA 1. Limpie los cristales (2) con etanol al 70%. 2. Coloque los cristales en el receptáculo fijador (4) ajustándolos perfectamente. 3. Empotre el receptáculo fijador armado en el punto anterior, en el módulo de llenado (5). 4. Prepare la mezcla para el gel separador al 12 % en un tubo cónico de 50 mL, de acuerdo con lo establecido en la tabla 1. 5. Con ayuda de una pipeta Pasteur, coloque, entre los cristales ensamblados anteriormente, aproximadamente 3.7 mL de la mezcla preparada, cuidando de no formar burbujas. 6. Enseguida coloque aproximadamente un mL de agua sobre la mezcla, cuidando que no se mezcle. Espere hasta que polimerice el gel. 7. Una vez formado el gel separador, retire el agua invirtiendo el módulo para que ésta escurra. Retire el exceso de agua con ayuda de papel filtro o algodón. 8. Prepare a la mezcla para el gel concentrador de acuerdo con lo indicado en la tabla 1. Viértala sobre el gel separador, hasta llenar completamente. 9. Coloque a un gel el peine de 10 pocillos y en el otro se coloca el peine ciego (1), cuidando que no se formen burbujas y espere a que polimerice la mezcla. Enseguida retire los peines. 10. Enjuague con agua destilada el carril para la muestra Tabla 1. Reactivos para el gel separador y gel concentrador (2 geles) GEL SEPARADOR

GEL CONCENTRADOR

(12%)

(4%)

4 mL

670 µL

Tris 1.5 M pH 8.8

2.6 mL

----------

Tris 1.5 pH 6.8

----------

1.25 mL

SDS 10%

100 µL

50 µL

Agua destilada

3.2 mL

3 mL

Persulfato de amonio al 10%

100 µL

50 µL

TEMED

10 µL

6 µL

REACTIVOS

Acrilamida-Bisacrilamida (30-0.8%)

52

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 1. Prepare 4 diluciones dobles seriadas de la solución de BSA, utilizando PBS como diluyente. El volumen final de cada dilución deberá ser de 100 μL. 2. En un tubo cónico de 1.7 mL coloque 100 μL de cada dilución de BSA y adicione 50 μL del amortiguador de muestra. 3. Para preparar el gel para la inmunotransferencia coloque en un quinto tubo 100 μL de la solución de BSA a 1 mg/mL y adicione 50 μL del amortiguador de muestra. 4. Caliente las mezclas anteriores 10 minutos a 100°C. Dejar enfriar hasta su uso. ARMADO DE LA CÁMARA DE ELECTROFORESIS 1. Coloque los cristales que contienen el gel preparado en el módulo de corrimiento (7). 2. Introduzca el módulo de corrimiento en la tina de electroforesis (6) y llene ambos compartimientos de amortiguador de corrimiento. 3. Con ayuda de una micropipeta y de las guías de plástico del equipo (3), coloque 10 μL de cada una de las muestras preparadas, de acuerdo con la siguiente tabla:

Carril

Muestra

Carril

Muestra

1

Marcadores de peso molecular

6

-

2

Dilución 1

7

Dilución 1

3

Dilución 2

8

Dilución 2

4

Dilución 3

9

Dilución 3

5

Dilución 4

10

Dilución 4

Peine Ciego 1

100 µL

4. Tape la tina de electroforesis y conéctela a la fuente de poder, ajustando a 100 el voltaje. 5. Una vez que el frente de corrimiento llegue al gel separador, aumentar el voltaje a 200. 6. Cuando el frente de corrimiento llegue al final del gel, detenga el corrimiento. Apague y desconecte la fuente d poder. 7. Desmonte el equipo y separe los cristales que contienen el gel, con ayuda de la espátula proporcionada para tal efecto.

53

8. Corte el gel en dos porciones, de manera vertical, por el centro del carril 6. 9. Sumerja una mitad del gel en la solución de azul de Coomassie. Incube 2-3 horas a 37°C o18 horas a temperatura ambiente. 10. Retire el colorante y lave el gel con agua corriente. 11. Adicione solución decolorante y mantenga en agitación constante a temperatura ambiente. 12. Cambie la solución decolorante las veces que sea necesario, hasta que las bandas proteínicas sean visibles nítidamente. 13. Almacene el gel en ácido acético al 10%

TRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS A MEMBRANA DE NITROCELULOSA 1. Humedezca la membrana de nitrocelulosa, papel filtro, esponjas, proporcionadas para la trasferencia, en solución amortiguadora de transferencia. 2. Coloque los materiales en casete de transferencia en el siguiente orden: papel filtro, la mitad no teñida del gel, membrana de nitrocelulosa y nuevamente un papel filtro. Evite la formación de burbujas. 3. Coloque el casete de geles en la cámara (el gel hacia el ánodo) y llénela completamente con amortiguador de transferencia. 4. Aplique una corriente de 240 miliamperes o 100 volts durante una hora. 5. Desmonte el equipo. Enjugue la membrana con agua destilada.

INMUNODETECCIÓN 1. Tiña la membrana de nitrocelulosa obtenida en el paso anterior, con solución de rojo Ponceau durante 2 a 3 min. Posteriormente destiña PBS -T hasta que las bandas proteínicas sean visibles. Documente fotográficamente la membrana teñida. 2. Lave exhaustivamente la membrana de nitrocelulosa con PBS-T hasta eliminar por completo el rojo Ponceau. 3. Sumerja la membrana de nitrocelulosa en solución bloqueadora (PBS-G) e incube 30 minutos a temperatura ambiente.

54

4. Elimine la solución bloqueadora, y adicione 3 mL del suero de conejo inmunizado con BSA diluido 1:100 en PBS-T. Incube durante 30 min a temperatura ambiente. Enseguida decante la solución. 5. Lave 5 veces la membrana de nitrocelulosa adicionando de 3 a 1 mL de PBS-T en cada lavado, durante 3 minutos cada lavado en agitación. 6. Adicione 3 mL de anticuerpo conjugado (anti-Ig’s totales de conejo producidos en cabra y conjugados a peroxidasa) diluido 1:10,000 en PBS-G-T Incube

30 minutos

a

temperatura ambiente. Enseguida decante la solución. 7. Repita el paso 5 8. Lave la membrana una vez con PBS 1X 9. Adicione 3 mL de solución reveladora (3,3’-Diaminobencidina al 0.02%, H2O2 al 0.01% en PBS, preparada en el momento) e incube a temperatura ambiente 5 minutos. Revise constantemente y detenga la reacción cuando aparezcan bandas nítidas, antes de que la membrana de nitrocelulosa se torne completamente roja. 10. Detenga la reacción lavando la membrana con agua corriente.

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR.

Determine la movilidad electroforética (Rf) de BSA y de cada uno de los marcadores de peso molecular, en el gel teñido con azul de Coomasie. Para ello, mida la distancia (en mm) del origen del gel separador a cada una de las bandas proteínicas y la distancia del origen del gel separador al frente de corrimiento. El Rf se calcula con la siguiente fórmula:

𝑅𝑓 =

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛 𝑎 𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑎 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜

55

Complete la siguiente tabla: MARCADOR DE PESO MOLECULAR 1

PESO MOLECULAR (KDa)

LOG PESO MOLECULAR

Rf

2 3 4 5 6 7 8 BSA

¿?

Grafique el Log de PM vs Rf. Realice la regresión lineal y obtenga la ecuación de la recta. Con la ecuación obtenida, determine el peso molecular de BSA. Repita el análisis, para las bandas detectadas en la inmunodetección.

RESULTADOS

ESPERADOS

EN

RELACIÓN

CON

LOS

CRITERIOS

DE

DESEMPEÑO

EVIDENCIAS DE APRENDIZAJE

CRITERIOS DE DESEMPEÑO

Lista de cotejo de demostración de Debes conocer el nombre de cada uno de los los componentes de la cámara de componentes electroforesis y transferencia

del

sistema

de

electroforesis

y

transferencia

Lista de cotejo de descripción de los Debes conocer la función de cada uno de los componentes

de

la

cámara

de componentes

electroforesis y transferencia

transferencia

Lista de cotejo de manejo y ensamble

Debes

demostrar

de la cámara de electroforesis y correctamente transferencia

del

transferencia

56

el

sistema que sistema

de

electroforesis

sabes de

y

ensamblar

electroforesis

y

Lista de cotejo sobre el desarrollo de Debes demostrar que puedes realizar e interpretar la inmunodetección

una inmunodetección por western-blot Deberás realizar un reporte de la práctica en que se incluya: portada, título de la práctica, unidad de

Reporte de práctica

competencia de la práctica, resultados obtenidos, conclusiones y cuestionario

Fundamentos sobre la función de la Debes solución

bloqueadora,

reveladora,

conoce

los

conceptos

de

solución

solución bloqueadora, solución reveladora, electroforesis de

electroforesis

de proteínas, transferencia de proteínas, anticuerpo

proteínas, transferencia de proteínas,

conjugado, Rf.

anticuerpo conjugado, Rf, Lista de cotejo sobre conocimiento y Debes conocer las normas mexicanas aplicables a la aplicación

de

las

normas

de práctica

seguridad y reglamentos respectivos.

(NOM-113-STPS-2009,

SSA1-2002,

NOM-087-ECOL-

NOM-005-STPS-1998

y

STPS-2000)

CRITERIOS DE CALIFICACIÓN DE LA PRÁCTICA Lista de cotejo de demostración de los componentes de la cámara de 10% electroforesis y transferencia Lista de cotejo de descripción de los componentes de la cámara de 10% electroforesis y transferencia Lista de cotejo de manejo y ensamble de la cámara de electroforesis 20% y transferencia Lista de cotejo sobre el desarrollo de la inmunodetección

20

Reporte de práctica

20%

Interrogación directa sobre la función de la solución bloqueadora, 10% solución reveladora, electroforesis de proteínas, transferencia de proteínas, anticuerpo conjugado, Rf, Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las normas de 10% seguridad y reglamentos respectivos.

57

NOM-018-

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

PRÁCTICA NÚMERO 5

ELISA

Responsables Q.F.B. Iris celeste Tovar Ocampo Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza

58

INTRODUCCIÓN El ensayo inmunoenzimático (EIA), también denominado ELISA por sus siglas en inglés (“enzyme-linked immunosorbent assay”), es una técnica de análisis en placa diseñada para detectar y cuantificar sustancias como proteínas, péptidos, hormonas y anticuerpos. En un ELISA, un antígeno debe ser inmovilizado a una fase sólida y ahí puede ser reconocido por un anticuerpo, que está conjugado a una enzima. La detección se logra mediante la actividad de la enzima, que actúa sobre un sustrato y producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro. El elemento más crucial de esta estrategia de detección es tener una interacción antígeno-anticuerpo altamente específica 1. Existes diferentes tipos de ELISA: •

ELISA directo

•

ELISA Indirecto

•

ELISA tipo sándwich

•

ELISA tipo doble sándwich

•

ELISA competitivo

El ELISA se realiza típicamente en placas de poliestireno de 96 pocillos, al que pasivamente se adsorben los anticuerpos o las proteínas (antígenos). La inmovilización de los reactivos en la superficie de los pocillos permite eliminar fácilmente todo el material que es ajeno a la interacción antígeno-anticuerpo durante el ensayo 1

1

Traducido

de

https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein-biology-

learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html)

59

Las enzimas más utilizadas son peroxidasa de rábano (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Aunque otras enzimas como β-galactosidasa, la acetilcolinesterasa y la catalasa se han utilizado también, pero no tienen gran aceptación debido a que las opciones de sustrato son limitadas. La elección del sustrato depende de la sensibilidad requerida del ensayo y de los equipos de medición disponible para detección de señales (espectrofotómetro, Fluorímetro o luminómetro)1. El ELISA es una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Además, por su fácil estandarización, manejo y variedad de antígenos disponibles, ha desplazado notablemente a otras técnicas como el radioinmunoensayo para la detección de anticuerpos anti-DNAcd (conocido también como prueba de Farr), ya que no utiliza radionucleótidos, lo que hace que sea una técnica accesible y de bajo riesgo. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el más utilizado en el laboratorio de diagnóstico es el ELISA indirecto, el cual se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos específicos presentes en las muestras de los pacientes, mediante un anticuerpo dirigido contra la región Fc humana de cualquier isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2). Los anticuerpos anti-Fc están unidos a enzimas como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Los antígenos utilizados en las placas de ELISA pueden ser nativos, recombinantes (antígeno completo o epítopo específico) o sintéticos (epítopo específico)2.

1

Traducido

de

https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein-biology-

learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html) 2

Ramírez, D. F. H., & Cabiedes, J. (2010). Técnicas inmunológicas que apoyan el diagnóstico de las

enfermedades autoinmunes. Reumatología Clínica,6(3), 173-177

60

Después de permitir la interacción de los anticuerpos de las muestras de los pacientes con el antígeno adsorbido a la placa de ELISA, se realizan lavados para eliminar los anticuerpos inespecíficos y se agrega el anticuerpo anti-inmunoglobulina humana conjugado a una enzima, permitiendo la interacción por un tiempo determinado. Posteriormente, se adiciona la solución que contiene el sustrato-cromogénico específico de la enzima (por ejemplo -fenilendiamina, 3, 3′, 5, 5′-Tetrametilbenzidina [TMB] para la peroxidasa o p-nitrofenilfosfato para la fosfatasa alcalina) el cual cambiará de color en función de la cantidad de anticuerpos conjugados con la enzima y cuya cantidad depende de la cantidad de

anticuerpos del sujeto de estudio que reconocieron al

antígeno pegado a la placa. En otras palabras, la intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo del sujeto unido al antígeno 2

Figura 1 La placa de 96 pozos se recubre con antígenos específico, los cuales son reconocidos por los anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes. La unión se revela cuando se adiciona un anticuerpo anti-Fc humana conjugado con una enzima. Al agregar el sustrato de la enzima cambia de color el medio

2

2

Ramírez, D. F. H., & Cabiedes, J. (2010). Técnicas inmunológicas que apoyan el diagnóstico de las

enfermedades autoinmunes. Reumatología Clínica,6(3), 173-177.

61

Ventajas y desventajas del ELISA indirecto1 •

Se cuenta con una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados.

•

Versatilidad, ya que muchos anticuerpos primarios se pueden hacer en una especie y utilizar así un mismo anticuerpo secundario.

•

La Máxima inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene porque no está conjugado.

•

La sensibilidad aumenta ya que cada anticuerpo primario contiene varios epítopos que pueden ser reconocidos por el anticuerpo secundario (conjugado), lo que permite la amplificación de la señal.

La principal desventaja es que puede haber reacción cruzada con el anticuerpo secundario, dando por resultado la señal inespecífica, lo que puede ser eliminado con los controles adecuados1. 1

Traducido

de

https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein-biology-

learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html)

COMPETENCIA ESPECÍFICA DE LA PRÁCTICA El estudiante será competente para determinar cuantitativamente (título) la presencia de anticuerpos dirigidos contra un antígeno específico, utilizando la técnica de ELISA indirecto CRITERIOS DE DESEMPEÑO 

Prepara las diluciones de antígeno necesarias para la determinación de anticuerpos



Realiza la detección de anticuerpos anti-BSA utilizando la técnica de ELISA



Realiza los cálculos necesarios para determinar el título de anticuerpos



Describe los conceptos de adsorción, cromógeno, sustrato



Establece las diferencias entre ELISA y Western-blot



Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos.

62

Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica TIPO DE RIESGO

COMO EVITARLOS

COMO PROCEDER EN CASO DE UN ACCIDENTE

Cortaduras

Trabajar apegado al protocolo de la práctica

Detener el sangrado y hacer curación en caso de no requerir atención médica

Reactivos mal cerrados (salpicadura en la piel)

Supervisar que los reactivos estén colocados de acuerdo a su grado de toxicidad.

Que los frascos permanezcan cerrados y ventilados.

Lavar inmediatamente con agua abundante, es conveniente retirar la ropa para evitar que el corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.

Cuadro de disposición de desechos TIPO DE DESECHOS

COMO DESCARTARLOS

Vidrios, y jeringas

En depósitos de basura

Agujas

En depósitos de basura para RPBI

TIPO DE CONTENEDOR

Depositarlos en contenedores marcado como “Basura Común”. Depositarlos en contenedor rojo, marcado como “RPBI”. Depositarlos en contenedores y/o

Materia orgánica

En depósitos de basura

bolsas rojas con la leyenda desechos biológicos según corresponda.

Basura común

En depósitos de basura

63

Depositarlos en contenedores y en bolsas negras, “Basura común”.

Normas Oficiales Mexicanas específicas de la práctica NOMBRE, NÚMERO Y CATEGORÍA

CRITERIO

PROCEDENCIA DE LA NORMA

Equipo

de

protección

Equipo de protección personal acorde con

NOM-113-STPS-2009

sus características y dimensiones físicas,

personal

así como con los agentes de riesgo.

Manejo peligrosos

de

residuos biológico

infeccioso

Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.

Se deberán separar y envasar todos los residuos peligrosos biológico-infecciosos,

NOM-087-ECOL-SSA1-

de acuerdo con sus características físicas y

2002

biológicas infecciosas

Cumplir con las instrucciones de uso y mantenimiento del equipo de protección personal proporcionado por el patrón

Conocer el grado de peligrosidad y los riesgos de las sustancias químicas peligrosas que se utilizan en el centro de trabajo. Identificar los depósitos, recipientes y áreas que contengan sustancias químicas peligrosas o sus residuos

64

NOM-005-STPS-1998

NOM-018-STPS-2000

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

RECURSOS MATERIALES Y EQUIPO 

Micropipetas.



Puntas para micropipetas.



Microplaca de poliestireno de 96 pozos con fondo plano.



Lector de microplacas marca Biorad Modelo 550.



Solución de BSA en Solución de carbonatos a una concentración de 25 µL /mL.



Suero de conejo inmunizado con BSA.



Regulador carbonato/bicarbonato 0.1 M pH 9.6.

65



Papel parafilm.



Solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) con Tween al 0.05% (PBS-T)



Solución de PBS-gelatina al 0.3% (PBS-G)



Anticuerpos anti-Ig’s totales de conejo producidos en cabra y conjugados a peroxidasa.



Solución reveladora (ELISA)



Ácido sulfúrico 8 N.

DESCRIPCIÓN DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Sensibilice la placa o tiras con 100 μL del antígeno de BSA en regulador de carbonatos pH 9.6. 2. Tape la placa con cinta e incube durante 30 minutos 37°C o 18 a 24 horas en refrigeración. 3. Deseche las soluciones de la placa, invirtiendo la placa. Golpee sobre papel absorbente para eliminar el exceso de líquido. 4. Lave la placa 2 veces con 250 μL/ pozo de PBS-T. 5. Coloque en cada uno de los pozos 300 μL de PBS-G e incube 40 minutos a 37°C. 6. Realice las diluciones dobles seriadas del suero de conejo inmunizado con BSA, comenzando con una dilución 1:5,000 utilizando PBS-G como diluyente. El volumen final de cada dilución es de 1 mL. (varía según el esquema por sesión ) 7. Incube 30 minutos a 37°C. 8. Deseche las soluciones de la placa, invirtiendo la placa. Golpee sobre papel absorbente para eliminar el exceso de líquido y Lave la placa 5 veces con 250 μL/ pozo de PBS-T 9. Coloque en cada uno de los pozos 100 μL de anticuerpos anti-inmunoglobulinas de conejo-conjugado a peroxidasa diluido 1:40,000 en PBS-G, excepto los marcados como blanco, en los que deberá colocar 100 μL PBS-G. 10. Incube 40 minutos a 37° C. 11. Repita el paso 8 12. Adicione a cada uno de los pozos 100 µL de solución reveladora e incube 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. 13. Detenga la reacción, adicionando una gota de H2SO4 8 N a cada pozo. 14. Lea la absorbancia, en el espectrofotómetro para microplacas, utilizando el filtro de 490 nm.

66

Esquema No. 1 Para una tira con 8 pozos:

A B C D E F G H

Blanco Blanco C1 Ag C1 Ag C2 Ab C2 Ab Reacción Reacción Incubación

Sensibilización --Ag Ag s/Ag s/Ag Ag Ag 30 min/ 37° C

Bloqueo

1er Ab

2do Ab

---

---

---

PBS - G PBS - G PBS - G PBS - G PBS - G PBS - G 40 min/37°C

PBS - G PBS - G Ac (1:5000) Ac (1:5000) Ac (1:5000) Ac (1:5000)

1:40,000 1:40,000 1:40,000 1:40,000 1:40,000 1:40,000 40 min/37°C

67

30 min/ 37° C

Revelado Sln Reveladora Sln Reveladora Sln Reveladora Sln Reveladora Sln Reveladora Sln Reveladora Sln Reveladora Sln Reveladora 15 min, T Ambiente

Esquema No. 2 Para tres tiras (24 pozos):

F A B C D E F G H

A B C D E F G H T/T

Sensibilización [Ag] Tira No. 1 2 3 Blanco ---Blanco ---C1 Ag Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 C1 Ag Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 C2 Ab Dil 1:2 Dil 1:4 C2 Ab Dil 1:2 Dil 1:4 C3 Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 C3 Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 Incubación 30 min/ 37° C

Bloqueo Tira No. 1

2

3

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

PBS-G

40 min/37°C

Dilución 1er Ab

Dilución 2do Ab

Tira No.

Tira No.

Revelado

1

2

3

1

2

3

---

Dil 1:2,500

Dil 1:2,500

1:40,000

1:40,000

1:2

1:2

---

Toda las tiras Sln Rev

1:40,000

1:40,000

Sln Rev

PBS-G

1:4

1:4

1:40,000

1:40,000

1:40,000

Sln Rev

PBS-G

1:8

1:8

1:40,000

1:40,000

1:40,000

Sln Rev

1:5000

1:16

1:16

1:40,000

1:40,000

1:40,000

Sln Rev

1:5000

1:32

1:32

1:40,000

1:40,000

1:40,000

Sln Rev

1:2,500

1:64

1:64

1:40,000

1:40,000

1:40,000

Sln Rev

1:2,500

1:128

1:128

1:40,000

1:40,000

1:40,000

Sln Rev 15 min, T Ambiente

30 min/ 37° C

40 min/37°C

68

Esquema No. Para la evaluación (48 pozos):

A B C D E F G H

Descripción Blanco Blanco C1 Ag C1 Ag C2 Ab C2 Ab C3 C3

Sensibilización 1

2

3

4

5

6

Bloqueo 1

2

3

4

5

6

A B C D E F G H

1er Ab 1

2

3

4

A B C D E F G H

69

5

6

2do Ab 1

Revelado 2

3

4

A B C D E F G H

70

5

6

Todo

ANÁLISIS DE DATOS 1. Determine la ecuación de la recta (mediante regresión lineal) para cada una de las concentraciones de Ag utilizadas, utilizando los datos de absorbancia vs concentración de BSA 2. Utilizando la ecuación de la recta, calcule la dilución del suero de conejo necesario para obtener el 50% de la unión con el Ag, con respecto al control 3. 3. Determine el título del suero, definido como el promedio del inverso dela dilución del suero de conejo necesario para obtener el 50% de la unión con el Ag. Nota: Deberá utilizar los dos valores más cercanos entre sí obtenidos por interpolación.

RESULTADOS

ESPERADOS

EN

RELACIÓN

CON

LOS

CRITERIOS

DE

DESEMPEÑO EVIDENCIAS DE

CRITERIOS DE DESEMPEÑO

APRENDIZAJE Lista de cotejo de demostración

Debes conocer el nombre de cada uno de los

de los reactivos del método de

reactivos del método de ELISA indirecto

ELISA indirecto Lista de cotejo de descripción de

Debes conocer la función de cada uno de los

los componentes del método de

reactivos del método de ELISA indirecto

ELISA indirecto Lista

de

cotejo

sobre

el Debes realizar correctamente la determinación de

desarrollo de la técnica de ELISA

anticuerpos de conejo anti-BSA por ELISA. Deberás realizar un reporte de la práctica en que

Reporte de práctica

se incluya: portada, título de la práctica, unidad de competencia de la práctica, resultados obtenidos, conclusiones

Lista de cotejo sobre

Debes conocer las normas mexicanas aplicables a

conocimiento y aplicación de las

la

normas de seguridad y

ECOL-SSA1-2002, NOM-005-STPS-1998 y NOM-

reglamentos respectivos.

018-STPS-2000)

práctica

71

(NOM-113-STPS-2009,

NOM-087-

CRITERIOS DE CALIFICACIÓN DE LA PRÁCTICA Lista de cotejo de demostración de los reactivos del método de ELISA

10%

indirecto Lista de cotejo de descripción de los componentes del método de ELISA

30%

indirecto Lista de cotejo sobre el desarrollo de la técnica de ELISA

30

Reporte de práctica.

20%

Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las normas de 10% seguridad y reglamentos respectivos.

72

CALIFICACIÓN DE LAS PRÁCTICAS Pipeteo de soluciones

10%

Reacciones de precipitación

15%

Reacción aglutinación

15%

Western-blot

30%

ELISA

30% Total

100%

CITERIOS DE ACREDITACIÓN 

Obtener calificación mínima de 60 en cada una de las prácticas



Asistencia al 100% de las prácticas



Realizar de manera individual el 100% de las prácticas



Entrega formal y oportuna del 100% de los productos de aprendizaje de las prácticas

El valor de las prácticas es del 25% de la calificación de la Unidad de Aprendizaje.

73

ACERVOS DE CONSULTA 

Owen JA, Punt J, Stranford SA, Jones PP, Kuby J. (2013) Kuby Inmunología. 7ma. edición. Editorial McGraw-Hill education. México.



Abbas, K. A., Lichtman, H. A., & Pober, S. J. (2010). Inmunología celular y molecular , 43–44Madrid.



http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Manejo_Liquidos&opc=tecnicas&i dap=48



http://www.pce-iberica.es/instrumentos-de-medida/instrumentos-laboratorios/tecnicapipeteo.htm



http://www.mt.com/mx/es/home/supportive_content/news/po/pipe/pipettingtechniques.html



https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein-biologylearning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overviewelisa.html



Ramírez, D. F. H., & Cabiedes, J. (2010). Técnicas inmunológicas que apoyan el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes. Reumatología Clínica,6(3), 173-177



http://asinom.stps.gob.mx:8145/Centro/ConsultaNoms.aspx



http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nomssa.html

74

GLOSARIO DE TÉRMINOS

75

76

ANEXO (SOLUCIONES) I.

Solución Salina Amortiguada con Fosfatos (PBS) 0.1 M pH 7.4. 10X Cloruro de sodio

40 g

Fosfato dibásico de potasio

0.2 g

Cloruro de potasio

2.9 g

Agua destilada

900 mL

Ajustar el pH a 7.4 y aforar a un litro con agua destilada. II.

III.

solución azul tripán al 0.4% Azul tripan

0.4 g

PBS qsp

100 mL

TBS-Gelatina a. Solución A Trizma base

6.05 g

NaCl

8.76 g

Agua destilada

700 mL

Ajustar el pH a 7.6 con HCl 1M b. Solución A Gelatina

0.5 g

Agua destilada

100 mL

Calentar el agua y disolver la gelatina Mezclar la solución A y B y aforar a un litro con agua destilada. IV.

Solución de Acrilamida-Bisacrilamida Acrilamida

30 g

Bisacrilamida

0.8 g

77

H2O destilada hasta

100 mL

Filtrar en papel Whatman1 y guardar a la obscuridad a 4ºC. V.

Solución Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8 Trizma Base

18.15 g

H2O destilada

90 mL

Ajustar el pH 8.8 primero con HCl concentrado y posteriormente con HCl 1N. Aforar a 100 mL con agua destilada. Filtrar en papel Whatman1 y guardar a 4ºC. VI.

Solución Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 Trizma Base

3g

H2O destilada

35 mL

Ajustar el pH 6.8 con HCl concentrado y posteriormente con HCl 1N Aforar a 50 mL con agua destilada. Filtrar en papel Whatman1 y guardar a 4ºC. VII.

Solución de persulfato de amonio al 10% Persulfato de amonio

100 mg

H2O destilada

1 mL

Se prepara en el momento de usarse VIII.

Regulador de Muestra 2x Tris 0.5M, pH 6.8

8 mL

SDS al 10%

10 mL

Glicerol

5 mL

2-Mercaptoetanol

2.5 mL

Azul de Bromofenol al 1%

1.0 mL

78

H2O destilada IX.

32.5 mL

Regulador de corrimiento (Tris 0.025 M, Glicina 0.192M, SDS al 0.1%, pH 8.3) Trizma Base

3g

Glicina

14.4 g

SDS al 10%

10 mL

H2O destilada qbp

1000 mL

No se ajusta el pH X.

XI.

Solución Madre para Tinción de proteínas Azul de Coomassie R250

2g

H2O destilada qbp

200 mL

Solución de trabajo para tinción de proteínas con azul de Coomassie Solución de Azul de Coomassie R250

62.5 mL

Metanol absoluto

250 mL

Ácido acético glacial

50 mL

H2O destilada

137.5 mL

Filtrar en papel Whatman 1 XII.

XIII.

Solución decolorante para geles de Poliacrilamida Metanol absoluto

500 mL

Ácido acético glacial

100 mL

H2O destilada

400 mL

Solución de ácido acético al 10% Ácido acético glacial

10 mL

H2O destilada

100 mL

79

XIV.

Regulador de Transferencia (Tris 0.025 M, Glicina 0.192 M, pH 8.3 metanol 20% v/v)

XV.

XVI.

Trisma Base

9.07 g

Glicina

43.2 g

Metanol

600mL

H2O destilada

2400 mL

Regulador de Carbonato/bicarbonato pH 9.6 Carbonato de sodio

1.5 g

Bicarbonato de sodio

2.93 g

Agua destilada qbp

1000 mL

Regulador de Citrato/Fosfato, pH 5.0 Solución de ácido cítrico 0.1 M

24.3 mL

Solución de fosfato dibásico de sodio 0.2 M

25.7 mL

Agua destilada qbp XVII.

50 mL

PBS-Tween20 al 0.1% PBS 10x

100mL

Tween 20

1 mL

H2O destilada qsp

1000 mL

XVIII. PBS-Tween20 al 0.05%

XIX.

PBS 10x

100mL

Tween 20

0.5 mL

H2O destilada qsp

1000 mL

Solución reveladora (Western-blot) 3,3’ diaminobencidina

3 mg

PBS 1x

6 mL

80

H2O2 AL 30% XX.

XXI.

20 µl

Solución reveladora (ELISA) o-fenilendiamina

10 mg

Regulador citrato/fosfto pH 5.0

25 mL

H2O2 AL 30%

10 µl

Solución amortiguada Tris-Salina (TBS) 1x Trisma base

6.05 g

NaCl

8.76 g

H2O

qsp

1L

Disolver el 800 mL de H2O, ajustar el pH a 7.5 con HCl y aforar a 1 L. Almacenar a 4°C

81