Manual De Procedimientos Simplate Hecho En Mty

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS LISTA DE MATERIAL NECESARIO: Frascos estériles o bolsas desechables estériles NASCO Cucharas o espatulas estériles. Mechero Desinfectantes (alcohol 70%, etc..) **Todo este material debe estar envuelto en forma individual previamente esterilizado e identificado. Además el muestreador deberá de utilizar cubrebocas y bata. La toma de muestra con fines de análisis microbiológicos se realiza en condiciones asépticas evitando así, que se produzca contaminación durante la obtención. A)TOMA DE MUESTRA: Alimentos líquidos: se deberán agitar o mezclar, hasta conseguir homogenizar y después hacer la toma de muestra asepticamente. • Alimentos sólidos: pueden muestrearse con ayuda de tubos estériles utilizados como sacabocados o bien usar, cucharas, tenedores y cuchillos todo previamente estérilizado. • Alimentos envasados: es preciso abrirlos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar contaminación. • Alimentos a granel: En productos a granel, tomar la muestra a partir de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa. •

La cantidad de producto muestreado varia, así que enseguida se mencionan algunos y su cantidad a muestrear: Producto Carnes crudas Ensaladas de frutas Ensaladas rusas o mixtas Salsas crudas Salsas cocidas Quesos frescos Cremas Alimentos cocinados Salsas a base de leche Bocadillos Agua Hielo potable Nieve

Cantidad a muestrear 250 g 200 g 200 g 100 g 100 g 250 g 200 g 250 g 100 g 100 g 100 ml 500 g 250 ml

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B) IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA: 1.-La información que deberá identificar a la muestra es fecha, lugar de muestreo, descripción de la muestra, iniciales de la persona que muestreo. C) PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LA MUESTRA: Los alimentos lìquidos poco espesos y poco contaminados se pueden trabajar directamente sin dilución ya que método Simplate se obtendrá un rango de conteo de <2 a >738 UFC/ml. En el caso que su muestra tuviera un conteo mas elelvado a 738 UFC/ml se tendrá que hacer diluciones para aumentar el rango de conteo. *Los alimento sólidos se tendran que preparar en la dilución 1:10. Dilución 1:10. Tomar 10 ml de muestra con una pipeta serologica estéril de 10 ml. (Muestras líquidas) o en muestras sólidas pesar asépticamente 10 g de muestra. Homogenizar en 90 ml de Buffer de Fosfatos estéril. Con el método Simplate se podrá tener un rango de conteo con dilución 1:10 de <20 UFC/ml hasta 7380 UFC/ml. Dilución 1:100 Tomar 1 ml de la dilución 1:10 Homogenizar en un tubo de ensayo con 9 ml de buffer de fosfatos estéril. Con el método Simplate se podrá tener un rango de conteo con dilución 1:100 de <200 UFC/ml hasta 73800 UFC/ml. Y así sucesivamente usted podrá aumentar 10 veces el rango de conteo en cada dilución pasando solamente 1 ml de la dilución anterior a 9 ml de buffer de fosfatos estéril. *Estas diluciones aplican a las 3 determinaciones de Simplate, solamente variará el grado de dilución de la muestra para el tipo de determinación microbiologica (generalmente la dilución que se maneja mas alta es para cuenta total ya que esta abarca todos los microorganismos que pueden crecer a 35ºC). Pero todo dependerá de la contaminación del producto y de los límites que se manejen para el tipo de alimento.

PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO RÁPIDO SIMPLATE

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CUENTA TOTAL Color Indicator o Fluorescente

FUNDAMENTO: Este método esta basado en tecnología de enzimas múltiples en donde un buffet de sustratos que es proporcionado por el reactivo hacen un enlace enzima-sustrato con las enzimas que contienen la bacteria mesófilica. Produciendo así después de 24 horas de incubación una flourescencia debido a la reacción enzima-sustrato de la cual el sustrato desprende una molécula de color la cual es la 4-metil umbeliferona (MUG).

Procedimiento: A-1)Reactivo Cuenta Total prueba múltiple (para 10 muestras): Este reactivo se disuelve en 100 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en refrigeración.

A-2) Reactivo Cuenta Total prueba sencilla ( para una muestra): Este reactivo se disuelve en 9 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en refrigeración.

B) Preparación e inoculación de la muestra: 1) Se coloca 1 ml de muestra en el centro de la placa SIMPLATE. 2) Posteriormente se le agregan 9 ml del reactivo Cuenta Total. 3) Se homogeniza con movimientos circulares de la placa y golpeando un poco para eliminar las burbujas que se pudieron haber formado. 4) Se retira el exceso de la placa y se invierte, incubando posteriormente a 35ºC por 24 hrs.

C) Lectura: 1) Después de 24 hrs de incubación se incide la luz UV en cada una de las placas contando los pocillos fluorescentes refiriendo este número a una tabla de NMP proporcionada por su distribuidor multiplicando este número por la dilución que se halla hecho. Por ejemplo: si en mi placa 1:10 cuento 1 pocillo fluorescente el NMP correspondiente es de 2 multiplicando por la dilución x 10= 20 UFC/g.

COLIFORMES Y E. COLI

FUNDAMENTO:

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Este método esta basado en tecnología de sustrato definido, el cual tiene la ventaja de poder contar coliformes totales y E. Coli con cuentas separadas. En Coliformes totales ocurre la reacción de B-d-glucuronidasa (enzima proveniente de los coliformes totales) y el sustrato (aportado por el reactivo) es B-d-glucuronido-rojo de cloro fenilo; de tal manera que al ocurrir la reacción enzima-sustrato se desprendera la molécula de color la cual es el rojo de cloro fenilo (RCPG ) (puede tener totalidades desde un rosa tenue hasta un rojo carmin). En E. Coli ocurre la reacción de B-d-glucuronidasa (enzima proveniente de E. Coli ) y el sustrato (aportado por el reactivo) el cual es B-d-glucuronido-4-metil umbeliferona; de tal manera que al ocurrir la reacción enzimasustrato se desprendera la molécula de color la cual es 4-metil umbeliferona (MUG)la cual con la insidencia de la luz UV da flourescencia (puede ser variable desde un azul fuerte hasta un azul tenue .

Procedimiento: A-1)Reactivo Coliformes y E. Coli prueba múltiple (para 10 muestras): Este reactivo se disuelve en 100 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en refrigeración.

A-2) Reactivo Cuenta Total prueba sencilla ( para una muestra): Este reactivo se disuelve en 9 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en refrigeración.

C) Preparación e inoculación de la muestra: 1)Se coloca 1 ml de muestra en el centro de la placa SIMPLATE. 2)Posteriormente se le agregan 9 ml del reactivo de Coliformes y E. Coli. 3)Se homogeniza con movimientos circulares de la placa y golpeando un poco para eliminar las burbujas que se pudieron haber formado. 4)Se retira el exceso de la placa y se invierte, incubando posteriormente a 35ºC por 24 hrs.

C)Lectura: Después de 24 hrs de incubación podremos ver a simple vista ya que los pocillos positivos dan un tono de rosa a rojo (esos corresponden a Coliformes totales) y este número de refiere a una tabla de NMP reportando como Coliformes UFC/g o ml y posteriormente se incide la luz UV en cada una de las placas contando los pocillos fluorescentes (estos corresponderán a E. Coli) refiriendo este número a una tabla de NMP proporcionada por su distribuidor multiplicando este número por la dilución que se halla hecho, reportando el nùmero de E. Coli UFC/g o ml de muestra. .Por ejemplo: si en mi placa 1:10 cuento 1 pocillo positivo el NMP correspondiente es de 2 multiplicando por la dilución x 10=Reportare 20 UFC/g

HONGOS Y LEVADURAS Fluorescente ó Color Indicator

FUNDAMENTO: Este método esta basado en tecnología de enzimas múltiples en donde un buffet de sustratos que es proporcionado por el reactivo hacen un enlace enzima-sustrato con las enzimas que contienen la bacteria mesófilica. Produciendo así después de 48 horas de incubación (30 ºc) una flourescencia debido a la reacción enzima-sustrato de la cual el sustrato desprende una Soporte Técnico Serco Comercial, S.A. de C.V. 4

molécula de color la cual es la 4-metil umbeliferona (MUG ) ó la reducción respectiva de la resarzurina en colores de tonalidades melón, rojizo, café, rosa y blanco.

Procedimiento: A-1)Reactivo Hongos y Levaduras prueba múltiple (para 10 muestras): Este reactivo se disuelve en 100 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 1 semana en refrigeración.

A-2) Reactivo Hongos y Levaduras prueba sencilla ( para una muestra): Este reactivo se disuelve en 9 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 1 semana en refrigeración.

C) Preparación e inoculación de la muestra: 1)Se coloca 1 ml de muestra en el centro de la placa SIMPLATE. 2)Posteriormente se le agregan 9 ml del reactivo de Hongos y Levaduras 3)Se homogeniza con movimientos circulares de la placa y golpeando un poco para eliminar las burbujas que se pudieron haber formado. 4)Se retira el exceso de la placa y no se invierte, incubando posteriormente a 30ºC por 48 hrs o a 25 ºC por 72 hrs.

C)Lectura:

1) Después de 48 o 72 hrs de incubación se incide la luz UV en cada una de las placas contando los pocillos fluorescentes refiriendo este número a una tabla de NMP proporcionada por su distribuidor multiplicando este número por la dilución que se halla hecho. 2) En el formato color indicator, todas los pocillos que cambien a un color diferente en tonalidad al púrpura-violeta de inicio, son tomados como positivos (tonalidades comunes: blanco, melón, café, rojizo) Por ejemplo: si en mi placa 1:10 cuento 1 pocillo fluorescente el NMP correspondiente es de 2 multiplicando por la dilución x 10= 20 UFC

PROCEDIMIENTOS PRODUCTOS IDEXX COLILERT (Presencia/Ausencia) USO.se utiliza para detección simultanea, identificación y confirmación de resultados para coliformes totales y E. Coli en agua. PRINCIPIO.-

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Utiliza la tecnologia de sustrato definido (DST). El sistema es una formulación diseñada especificamente que optimiza el pH y el ambiente químico de crecimiento, esto permite favorecer el crecimiento de los microorganismos mas rápidamente posible para lo cual fue diseñado. PERMITIENDO suprimir los microorganismos QUE NO CONTIENEN ESTA ENZIMA necesaria y no LOGRAN DIGERIR el nutriente indicador y por lo tanto no pueden tener crecimiento. La formulación de colilert es especifica para optimizar el crecimiento de coliformes totales y E. Coli en agua. El nutriente indicador que contiene, correspondiente al microorganismo que se desea analizar. Los microorganismos objetivos tienen afinidad por el nutriente indicador que corresponde con su metabolismo y que puede usar como una fuente importante de carbono. Los nutrientes indicadores específicos de colilert, el orto-nitrofenil-b-d-galactopiranoside (ONPG) y el 4 metil-umbeliferil-b-dglucuronido (MUG) corresponden a las enzimas constitutivas que siempre están presentes en las bacterias y que solo existen en las coliformes y E. Coli las bacterias coliformes tienen la enzima Bgalactosidasa y si existe una bacteria coliformes tienen la enzima B-galactosidasa y si existe una bacteria coliforme en la muestra metabolizada el ONPG dará una coloración amarilla. E.Coli contiene la enzima B-Glucuronidasa y si esta se encuentra en la muestra metabolizada el MUG producirá fluorescencia. PROCEDIMIENTO.1.- Agregue el reactivo a 100 ml de agua (muestra). 2.- Incube a 35º C +/- 0.5º C por 24 hrs. 3.- Leer resultados INTERPRETACIÓN: INCOLORO.- Negativo a coliformes y E. Coli AMARILLO SIN FLUORESCENCIA (a la incidencia de Luz UV 365 nm).-positivo a Coliformes totales y negativo a E. Coli AMARILLO CON FLUORESCENCIA (a la incidencia de Luz UV 365).-positivo a Coliformes totales y positivo a E. coli.

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