Manual De Laboratorio De Parasitologia

UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIONALISIS

LABORATORIO DE PARASITOLOGIA

MANUAL DE PARASITOLOGIA

ALUMNAS: MAGDA ELENA HERNANDEZ HERNANDEZ SANDRA LUZ HERNANDEZ LOPEZ

* TOMA DE MUESTRA PARA EXAMEN COPROPARASITOSCOPICO

INTRODUCCION : Regularmente en el áreade Parasitologia , las muestras más analizadas para demostrar la presencia de parasitos intestinales del hombre son las heces fecales ; sin embargo , existen otros parásitos cuya presencia se puede evidenciar en muestras biológicas como : bilis, jugo duodenal, esputo, secreción , biopsia o frotis perianal , no obstante estas pruebas se harán tomando en cuenta los antecedentes clínicos específicos del paciente. A continuación , se hará referencia a los diversos aspectos con los cuales deberán proceder las muestras a analizar con fines parasitologicos para obtener resultados reproducibles y de esta manera ayudar eficazmente al médico en el diagnostico, pronostico , y tratamiento del paciente. HECES FECALES SOLIDAS:

✔ Condiciones del paciente :

Durante al menos tres días previos a la prueba el paciente deberá evitar tomar medicamentos

(antiparasitarios , antibióticos, antidiarreicos ,

laxantes o purgantes en caso de ser necesario deberán emplearse un purgante salino, como sulfato de sodio o fosfato y carbonato de sodio. Por ningún motivo deberán emplearse aceites minerales o compuestos de bismuto o magnesio, ya que las gotas o cristales procedentes de ellos pueden confundirse con algunos parásitos o enmascarar su presencia. ✔ Recipiente de recolección :

Frasco estéril de boca ancha , con tapa de rosca. ✔ Cantidad de muestra requerida : 3-6 grs

✔ Toma de muestra : La muestra deberá ser recolectada de la siguiente manera : •

Con una abatelenguas tome directamente de la cavidad anal un volumen de heces aprox. entre 3 -6 grs (equivalente al tamaño de una nuez )

NOTA: Evite la contaminación de la muestra con orina , papel higiénico. jabón , aguao tierra.

•

Transfiera las heces obtenidas al contenedor estéril.

•

Cierre el envase herméticamente de forma inmediata para evitar contaminaciones bacterianas

•

. A continuación identifique. el frasco con una etiqueta autoadhesiva llenándola claramente con su nombre, apellidos, edad y fecha y hr de recolección.

NOTA : Pegue la etiqueta al frasco NUNCA en la tapadera .

•

Finalmente lleve la muestra al laboratorio lo más pronto posible.

NOTA : Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o días , se recomienda adicionarle liquido fijador y/o conservador ( formalina al 10 % , por ejemplo ) NOTA :Para aumentar la eficacia de la prueba se recomienda que para estudios parasitoscoscopicos se recolecten un total de tres muestras en 3 dias consecutivos

ya que la expulsión de parásitos puede ser intermitente . ✔ Criterios de rechazo :



Que el paciente no haya tomado la muestra respectivamente de forma adecuada .



Que la muestra haya sido llevada al laboratorio con mas de 1 hr de haber sido tomada o no haya sido adecuadamente conservada.



Que el paciente este recibiendo tratamiento antiparasitario.

HECES FECALES DIARREICAS : Cantidad de muestra requerida : 10 ml (un volumen similar al de un cuchara sopera ) NOTA : Estas muestras deben procesarse de inmediato (30 minutos como máximo después de la deposición) en caso contrario se debe adicionarse algun conservador e indicarlo en la etiqueta de identificación pues de no rexaminarse dentro de un margen de tiempo prudencial pues al acidificarse muchos gérmenes patógenos se lisan .

RASPADO PERIANAL : ✔ Condiciones del paciente : La toma de muestras deberá realizarse preferentemente por la noche o a primera hora de la mañana antes de que el paciente orine, defeque o se bañe (lo ideal es hacer la toma antes de levantarse de la cama). NOTA : Es imprescindible el uso de guantes desechables durante la toma de la muestra y el avado cuidadoso de las manos tras su realización.

✔ Recipiente de recolección :

Portaobjetos con cinta adhesiva. ✔ Toma de muestra : 1.

Se toma un abatelenguas cubierto de cinta adhesiva

transparente,

de

manera

que

la

superficie engomada quede expuesta hacia fuera.

2. A continuación , se coloca al paciente en posición genupectoral donde la región perianal quedara ampliamente expuesta para realizar varias aplicaciones con el abatelenguas alrededor

de esta zona ; con la fianlidad , de que los huevos qque se

encontrarab presentes queden adheridos a la superficie engomada.

3. Finalmente se pega la muestra la cinta adhesiva sobre una de las caras del porta objetos (con lo que se recolecto hacia abajo ) y se observa al microscopio.

JUGO DUODENAL Y YEYUNAL: Algunos parásitos colonizan el intestino delgado durante alguno de sus estadios, permaneciendo habitualmente en el área yeyunal y siendo infrecuentemente detectados en las heces durante estas fases. Este es el caso de los trofozoitos de Giardia lamblia y las larvas de Strongyloides sp. NOTA : Los conductos biliares desembocan en duodeno, por lo que también pueden hallarse huevos de parásitos procedentes del hígado o del árbol biliar en el jugo duodenal y yeyunal. ✔ Toma de muestra :

Las muestras de jugo duodenal y yeyunal suelen obtenerse mediante sonda gastrica o bien durante un procedimiento endoscópico, por el medico tratante , las cuales tras unas adecuada identificación, deberán ser enviadas rápidamente al laboratorio y procesadas inmediatamente . ✔ Recipiente de recolección :

Frasco estéril de boca ancha , con tapa de rosca. ✔ Cantidad de muestra requerida : 1-2 ml

ESPUTO : •

Condiciones del paciente :

El paciente deberá recolectar la muestra de esputo en ayunas a primera hora de la mañana ; para lo cual , deberá enjuagarse previamente la boca solamente con agua para eliminar bacterias que se encuentren en boca y lengua que pudieran ser parte de la flora normal. NOTA : Se recomienda que el paciente no este ingiriendo medicamentos. ✔ Recipiente de recolección :

Frasco estéril de boca ancha , con tapa de rosca. ✔ Toma de muestra : Para recolectar la muestra el paciente deberá toser profundamente (lo mas que pueda) y depositar el esputo obtenido en un recipiente estéril . NOTA: Si el paciente no puede expectorar , existen diversas técnicas encaminadas a favorecer la obtención del esputo; ✔ La inducción de la tos por inhalación con vaporizador. ✔ Lavado bronquial, aspiración mediante aguja transtorácica, o biopsia de pulmón.

✔ Cantidad de muestra requerida : 1- 2 ml ✔ Criterios de rechazo :



Que la muestra sea “saliva”.



Que la muestra tenga menos de 25 leucocitos, y mas de 10 células epiteliales por campo (aumento X 100) .(ya que indicaría que la muestra no fue adecuadamente tomada

ENVIO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

Las muestras deben mantenerse en un ambiente fresco y lejos de la luz solar , se deben evitar las temperaturas extremas o el desecamiento , deben contener cantidades optimas y estar en frascos o contenedores rotulados y en algunos casos necesarios en soluciones conservadoras. Condiciones de envio de la muestra según el tipo y tiempo de demora en llegar al laboratorio para el diagnostico parasitologico presuntivo de : TIEMPO QUE DEMORA EN LLEGAR AL LABORATORIO

TIPO DE MUESTRA

<24 HRS

> 24 HRS

AGENTES PARASITARIOS E. histoltyca, Giardia ,

HECES

T°

FORMADAS

ambiente

HECES

T°

DIARREICAS ESPUTO ,

ambiente

Formalina 10 % PAF; PVA

Criptosporidium , Isospora belli. ,

Medio de transp :

(no muy comúnes en personas inmunocompetentes)

Cary blair

SECRECIÓN BILIAR .

T° ambiente

CONTENIDO

T°

DUODENAL

ambiente

Quistes de Balantidium coli.

Formalina 10 %

Formalina 10 %

Trichuris.Ascaris,Necator,Ancylostoma etc Trofozoito de Balantidium coli etc. Pneumocistis , Paragonimus, Fasciola hepatica, ,Giardia. Giardia,

Formalina 10 %

Strongyloides,Paragonimus,Fasciola,Ancylostom a, Necator etc. Huevos de :

FROTIS PERIANAL

T° ambiente

Enterobius vermicularis

T° ambiente

Ascaris lumbricoides, Taenia sp. Hymenolepis nana.

SECRECION

T°

Frotis en

VAGINAL LCR. SANGRE BIOPSIA DE

ambiente

lamina

TEJIDOS

PROCEDIMIENTOS

Trichomona vaginalis. Naegleria, Acanthamoeba yBalamuthia Tripanosoma,Plasmodium,Leishmania

4°C

Formol 10 %

DE

LABORATORIO

PARASITOLOGICO-HECES, I. EXAMEN DIRECTO MACROSCOPICO:

Trichinella spiralis (triquinoscopia)

PARA

EL

DIAGNOSTICO

FUNDAMENTO : Permite observar directamente las características morfológicas de los parasitos adultos, enteros o fraccionados , asi como los cambios en las características organolépticas de las heces eliminadas(color, presencia de sangre y/o moco, consistencia etc). MATERIAL Suero fisiológico Aplicador Pinza de metal Coladera de plástico o malla metalica.

PROCEDIMIENTO :

1. Observar cuidadosamente las características organolépticas de la muestra

a analizar con la finalidad de determinar su : CONSISTENCIA: CONSISTENCIA: COLOR: OLOR:

Deber ser pastosa y dura Marrón oscuro ( *Ver Anexo) Característico ,puede mostrarse fétido (anomalía) La presencia de moco nos indica gastritis, ulcera o

MOCO: SANGRE

amibiasis. La sangre nos indica hemorragia intestinal por ulceras perforadas intoxicación con medicamentos o ácidos, hemorroides y en ocasiones amibiasis

2. Después de ello, es necesario agregar suero fisiológico a la muestra (en

cantidad suficiente ) para homogeneizarla. 3. Finalmente las heces deberán ser cuidadosamente pasadas a través de un

tamiz con la finalidad de aislar gusanos cilíndricos, anillados o aplanados que pudieran encontrarse en las heces, RESULTADOS . Se informará detalladamente aquellas características macroscópicas observadas durante el análisis coproparasitoscopico así como se deberá hacer referencia en su caso el aislamiento de algún gusano durante el tamizado especificando su especie .

TIEMPO QUE DEMORA EN LLEGAR AL LABORATORIO TIPOS DE EXAMNES

MUESTRA

<24 HRS

> 24 HRS

TECNICA

✔

EXAMEN DIRECTO EN FRESCO

COPRO

HECES

T°

FORMADAS

ambiente

Formalina 10 %

✔

FAUST (FLOTACION)

PAF; PVA

✔

RITCHIE (SEDIMENTACION)

Medio de transp : Cary blair

HECES

T°

DIARREICAS SECRECION

ambiente T°

VAGINAL ESPUTO

ambiente

SECRECIÓN SECRECIONES

BILIAR .

T° ambiente

Formalina 10 % Frotis en lamina

Formalina 10 %

AGENTES PARASITARIOS

DEMOSTRACION DE LARVAS:

✔

KATO

✔

STOLL

EXAMEN DIRECTO EN FRESCO EXAMEN DIRECTO EN FRESCO TINCION DE GRAM Y GIEMSA TINCION DE GRAM Y GIEMSA ✔ EXAMEN DIRECTO EN

E. histoltyca, Giardia , Quistes de Balantidium coli. Criptosporidium , Isospora belli. , (no muy comúnes en personas inmunocompetentes) Trichuris.Ascaris,Strongyloides,Necator,Ancylostoma etc Trofozoito de Balantidium coli etc. Trofozoitos Trichomona vaginalis. Pneumocistis ,

FRESCO

✔

FAUST Y RITCHIE

✔

CAPSULA DUODENAL DE

Fasciola hepatica, ,Giardia. Paragonimus,

BEAL

SANGRE

TEJIDOS

CONTENIDO

T°

DUODENAL

ambiente

Giardia, Formalina 10 %

FROTIS DIRECTO DE SANGRE, HEMOCULTIVO

4°C

(Strongyloides,Paragonimus,Fasciola,Ancylostoma, Necator etc. Hemoprotozooarios

SANGRE

BIOPSIA

CAPSULA DUODENAL DE BEAL

Formalina 10 %

Tripanosoma,(xenodiagnostico)

FROTE EN GOTA GRUESA DE SANGRE

Plasmodium, (Frote grueso)

TINCION DE GIEMSA

Leishmania Trichinella spiralis

TRIQUINOSCOPIA

Huevos de : EXAMENES

FROTIS

T°

ESPECIALES

PERIANAL

ambiente

T° ambiente

METODO DE GRAHAM (Raspado perianal)

Enterobius vermicularis Ascaris lumbricoides, Taenia sp. Hymenolepis nana.

TIPOS DE EXAMENES PARASITOLOGICOS: PARASITOLOGICOS:

SIGNIFICADO CLINICO DEL COLOR DE LAS HECES: El color de las heces proporciona una significativa información al químico clínico , ya que con solo realizar un detallado análisis macroscópico de estas , le puede orientar en gran parte para detectar alguna patología, disfuncion orgánica, hemorragia, o bien hacer de su conocimiento el tipo de alimentación o ingestión de algún medicamento que este presentando el paciente en ese momento . El color anormal ayuda al médico a seleccionar las pruebas tanto químicas como microbiológicas necesarias para llegar finalmente a extender un buen diagnostico , pronostico y plan de tratamiento adecuados para el paciente. A continuación se hará referencia a los colores más comunes que pueden presentar las heces fecales ya sea por alguna patología o bien por algún otro factor externo :

COLOR AMARILLO VERDOSO AMARILLENTAS

YEMA DE HUEVO

BLANQUECINAS O GRISACEAS GRISACEAS (ACOLIA)

VERDOSAS

SIGNIFICADO

Diarrea abundante. Se presentan en las "diarreas de fermentación" y en las “ esteatorreas .” Heces procedentes de un tránsito acelerado a partir de las partes más altas del intestino delgado. Heces características de las ictericias obstructivas y de la fase aguda de las hepáticas,.

NOTA : La ingestión de papilla de bario puede producir el mismo efecto.

Diarrea abundante. Tambien se presentan en las diarreas duodenales . Por otra parte se pueden presentar por una ingestión excesiva de vegetales clorofílicos los cuales darán un tono verdoso a las heces, En los lactantes son frecuentes las diarreas verdes, pero es normal que en los niños criados al pecho las deposiciones se tornen verdes al contacto del aire.

NEGRO

ARCILLA MARRON INTENSO

Heces que proceden generalmente de una hemorragia del aparto gastrointestinal alto (>100 ml de sangre). Sin embargo también se pueden presentar cuando se ingirió una elevada proporción de carnes en la dieta , cerezas, o alimentos con colorante artificial. Heces características de un bloqueo del conducto biliar común. Probable hemorragia del aparato gastrointestinal bajo ( por ejemplo: tumores, hemorroides, fisuras, procesos inflamatorios).

ROJIZA (MELENA)

Rojizas, irregularmente, son las deposiciones que contienen sangre no transformada, de origen bajo (hemorroides, tumores de colon distal, etc.). Unas heces rojizas también pueden presentarse por la ingestión abundante de betabel o tomate .

MEDICAMENTOS QUE PROVOCAN CAMBIOS EN LA COLORACIÓN DE LAS HECES : •

Negro: Sales de hierro, Sales de bismuto, carbón.

•

Verde: cloruro de mercurio, indiometicina, calomel.

•

Verde a azul: ditiazanina.

•

Marrón: antraquinonas.

•

Rojo: fenolftaleína, pamoato de pirivino, tetraciclinas em jarabe, bromosulfaleína.

•

Amarillo: santonina, antibióticos.

•

Claro a blancuzco: bário, antiácidos.

•

Naranja rojizo: fenazopiridina.

•

Rosa a rojo a negro: anticoagulantes dosis excesivas, salicilatos.

Como se pude observar la historia clínica del paciente , los antecedentes dietéticos y el tratamiento bajo el cual se encuentre el paciente , son aspedctos sumamente importantes que debe saber el Qumico clínico para poder distinguir anormalidades importantes en las heces fecales de simples interferencias.

I EXAMENES PARASITOLOGICOS : * EXAMEN MACROSCOPICO :

CARACT. DE LAS HECES :

✔

Consistencia

TAMIZADO

✔

Color

✔

Mucus,

✔

Sangre

(Nematodos adultos y huevos de Taenia)

✔ Especímenes SOLUCION SALINA: Trofozoitos y Quistes al natural

LUGOL :

ideal para buscar trofozoitos móviles ó larvas

Estructuras internas , núcleos y vacuolas . Huevos y lavas

FAUST (ZnSO4)

FLOTACION

MUESTRA: ✔

Heces

✔

Esputo ,

✔

Contenido

II

* EXAMEN MICROSCOPICO :

(Útil para quistes y huevos)

POR SEDIMENTACION -FLOTACION

DE CONCENTRACION

RITCHIE

(Útil para quistes ooquistes y huevos)

COPA

duodenal ✔

TUBO

METODOS

BAERMAN (Útil para

larvas de Strongyloides Necator y Ancylostoma)

Secreción biliar

III

* EXAMEN CUANTITATIVO (Recuento de huevos )

STOLL

POR DILUCIÓN

Ideal para huevos de Ancylostoma y Necator

FROTIS GRUESO

KATO Ideal para huevos de helmintos

GRAHAM Útil para huevos de Enterobius ,Ascaris,Trichuris,Hymenolepis,y Taenia CÁPSULA DUODENAL DE BEAL(Útil para trofozoitos de Giardia, larvas de Strongyloides IV

huevos de Uncinarias)

EXAMENES ESPECIALES:

HARADA MORI HEMOCULTIVO

METODO DIRECTO

(Útil para Uncinarias y Strongyloides) Hemoflagelados

Tripanosomiasis.

*DIAGRAMA DE FLUJO DE UNA :

Coccidios **TROFOZOITOS: Larvas Trofozoito Strongyloides de Entamoeba FROTIS CENTRIFUGAR BAERMAN SIN CON POSITIVO NEGATIVO SEDIMENTO ZIEHL-NEELSEN EXAMEN HEMATOXILINA MEZCLAR MOCO DIARREICAS LIQUIDAS DEL EN SEDIMENTO FRESCO *MOCO MUESTRA FRESCA DE Útil para Ooquistes de E.histolytica Quistes de G,lamblia FERRICA Y HECES O I, belli Giardia lamblia

**

CENTRIFUGAR TRICROMICA :

Balantidium coli QUISTES Balantidium coli Giardia lamblia OOQUISTES:

Cryptosporidium I. belli B, hominis Cyclosporidium LARVAS: S, stercolaris HUEVOS : H, nana

* TAMIZADO GENERALIDADES: La técnica de tamizado Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados. tal es el caso de los helmintos: Taenia solium y T. saginata

Es un parásito importante del hombre en aquellos lugares donde el consumo frecuente de la carne de cerdo y de res cruda o insuficientemente cocida, ya que la carne de estos animales puede contener las fases larvarias de las tenias mencionadas, las cuales se denominan metacéstodos o cisticercos. Fases de desarrollo: Adulto (de T. solium.) Mide de 2 a 7 metros de longitud y posee escólex o cabeza cuadrangular de aproximadamente 1 mm de diámetro, con cuatro ventosas musculares grandes en forma de copa que miden 0.5 mm de diámetro y rostelo prominente, redondeado y armado con una doble corona de ganchos en número de 22 a 32. Luego sigue el cuello y la cadena estrobilar compuesta por unos 1,000 a 2,000 segmentos o proglótidos. Metacéstodo, cisticerco, etc. Existen dos tipos fundamentales el de T. solium, también denominado Cysticercus cellulosae, el cual es una vesícula blanquecina de 0.5 a 1.5 cm de ancho, con escólex invaginado y armado con doble corona de ganchos, al igual que el adulto, y el de T. saginata, denominado Cysticercus bovis, más o menos con las mismas características que el anterior, pero sin corona de ganchos en el escólex. Huevos: Los huevos que producen los adultos de ambas especies de Taeniason semejantes e indistinguibles al examen microscópico. Son esféricos, miden de 30 a 45 micras de diámetro y poseen una cápsula gruesa radiada y una membrana hialina de origen embrionario. En su interior, se encuentra el embrión (oncosfera o embrión hexacanto) que generalmente posee tres pares de ganchos.

EXAMENES DE LABORATORIO: Después de la expulsión espontánea de proglótidos, estos se pueden recuperar por medio de la técnica de TAMIZADO en heces expulsadas durante 24 horas. En caso de obtenerse proglótidos, deben comprimirse entre dos portaobjetos y observarlos a contraluz o en un microscopio estereoscópico. Hay que estudiar los proglótidos grávidos y contar el número de ramas uterinas, ya que en caso de pertenecer a la especie T. solium son poco numerosas (8 a 12), y si se trata de T. saginata, generalmente son numerosas (12 a 24). Mediante el TAMIZADO de las heces también es posible recuperar el escólex, sobre todo después de los tratamientos, el cual se observará bajo el microscopio para determinar sus características morfológicas. Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Taenia sp. por los exámenes coproparasitoscópicos de flotación como el Faust, Ferreira, etc, o de sedimentación, como el Ritchie, o a buscar huevos de Enterobius vermicularis mediante el método de Graham. Es importante decir, que el hallazgo de los huevos de Taenia sp. por cualquiera de los métodos empleados de ninguna manera permiten realizar el

diagnóstico de una "huevos de Taenia sp."

especie

de

tenia,

y

sólo

se

informan

como

Recientemente, se ha desarrollado la detección de coproantígenos de Taenia; pero tampoco permiten discriminar la especie.

II. EXAMEN MICROSCÓPICO:

* COPROPARASITOSCOPICO DIRECTO FUNDAMENTO : Este método permite buscar principalmente en muestras frescas , la presencia de formas evolutivas móviles de parásitos de tamaño microscópico ( trofozoitos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica,Giardia lamblia (duodenalis) ,Balantidium coli etc, así como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercolaris, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Paragonimus,Fasciola etc) MATERIALy EQUIPO Aplicadores de madera Portaobjetos de 25 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Solución salina isotónica Lugol Microscopio

METODO: a) En un portaobjetos limpio y desengrasado, se colocan separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol. b) Con el aplicador de madera se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces 8 en muestras con sangre y moco elegir esa parte para estudiar) y se mezcla con la solución, con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos, procurando hacer una suspensión no un frotis. c) Colocar el cubreobjetos. d) Repetir estas operaciones en la gota de lugol. e) Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. No es recomendable usar objetivo de inmersión (100 x) , pues se puede ensuciar el microscopio. Recorrerla lamina siguiendo un sentido direccional , ejemplo :de derecha a izquierda , o de arriba abajo. NOTA:Con el suero fisiológico, los trofozoitos y quistes de los protozooarios se observan en forma natural , y con lugol , las estructuras internas , núcleos y vacuolas.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: Se informará detalladamente la presencia de alguna forma parasitaria observada durante el análisis coproparasitoscopico , indicando su especie y estado evolutivo (trofozoito, quiste en caso de un protozoo) ó (huevo , larva en caso de un helminto)

* COPROPARASITOSCÓPICO MEDIATO O INMEDIATO CON COLORANTES VITALES

FUNDAMENTO: Este método nos permite diferenciar correctamente los diferentes protozoos basándose en las características morfológicas de cada uno de ellos observando sus núcleos, endosomas, etc .mediante la utilización de los colorantes vitales ( azul de metileno, rojo congo, eosina, verde de malaquita, verde de Janus, Safranina)

MATERIALy EQUIPO Aplicadores de madera Portaobjetos de 25 X 76 mm

Puente de tinción Lámpara de alcohol Azul de metileno al 3.5% Agua destilada Microscopio

METODO: a) En un portaobjetos se coloca una gota de azul de metileno al 3.5% b) Se toma una porción pequeña de heces fecales con un aplicador y se realiza una suspensión homogénea con el colorante. c) Se deja actuar el colorante por 3 minutos o bien se flamea pero sin que hierva la muestra, sólo hasta la emisión de vapores. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberáanotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* MÉTODO DE CONCENTRACIÓN

POR FLOTACION

FAUST

FUNDAMENTO: Se basa en que los quistes y/o huevos de los parásitos flotan en la superficie por ser de menor densidad que el sulfato de zinc a 33,3%, cuya

densidad es 1180. Es útil para la búsqueda de quistesy/o huevos de parásitos y excepcionalmente se observan larvas. Se recomienda controlar la densidad del sulfato de zinc y usar agua filtrada para el lavado previo de la muestra. MATERIALy EQUIPO Vaso de precipitado de 50 ml Tubos de ensaye de 15 X 100 mm Gradilla Embudo de polietileno Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado Portaobjetos de 76 X 26 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Aplicadores de madera Asa de alambre terminada en círculo de 3 a 5 mm de diámetro y formando ángulo recto con el resto del alambre. Solución de Sulfato de Zinc 1.180° Baumé Lugol Microscopio Centrífuga

METODO: a) Se hace una suspensión homogénea con 1 g de materia fecal y 10 ml de agua. b) Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, colectando el filtrado directamente en el tubo. c) Se centrifugan los tubos a 2000 rpm durante 1 min. d) Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con agua. Se centrífuga nuevamente, repitiendo la misma operación hasta que el sobrenadante se observe limpio. e) Se decanta el último sobrenadante, se resuspende el sedimento y se agrega Sulfato de Zinc 1.180° Baumé y se centrífuga a 2000 rpm durante 1 min. f) Con el asa se recoge la muestra de la película superficial que se encuentra en el menisco, dos o tres ocasiones y se deposita sobre el portaobjetos; se añade una gota de lugol, se mezcla con el ángulo del cubreobjetos y se cubre con el mismo. g) Se observa la preparación con objetivos de 10 X y 40 X.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* METODO DE CONCENTRACION POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE

FUNDAMENTO: Se basa en la concentración de los quistes y huevos por sedimentación mediante la centrifugación, con la ayuda de formol y éter para separar y visualizar los elementos parasitarios. Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia. MATERIALy EQUIPO Centrífuga Tubos de ensaye cónicos de 15 ml Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado Embudos de polietileno Vasos de precipitado de 50 ml Aplicadores de madera Pipetas Pasteur con bulbo Portaobjetos de 26 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Solución salina isotónica Solución de formaldehido al 10% Microscopio

METODO a) Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitado, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza. b) Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico. c) Se centrífuga la suspensión durante 1 min a 2000 rpm. d) Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro. e) Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min. f) 6.- Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos. g) Se centrífuga durante 2 minutos a 1500 rpm. h) Después de centrifugar se observan 4 capas: ➢ ➢ ➢ ➢

éter en la superficial, un tapón de restos fecales, formaldehído, sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

i) Se introduce la pipeta Pasteur hasta la capa d, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos. j) Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el mismo. k) Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

III. EXAMEN CUALITATIVO :

* MÉTODO DE DILUCION

DE STOLL

FUNDAMENTO: Este método se basa en los principios de saponificación, homogenización y aclaración. El NaOH 0.1 N al ponerse en contacto con las grasas de las heces se saponifica, hace que los huevos de los parásitos sean menos pegajosos, desinfecta y deodoriza la muestra. MATERIALy EQUIPO Probeta graduada de 100 ml con tapón esmerilado Pipetas de Stoll o graduadas de 2 ml en 0.01 ml. Varilla de vidrio de 20 cm de longitud Perlas de vidrio Portaobjetos de 74 X 38 mm NaOH 0.1 N Microscopio

METODO: a) Se coloca en la probeta Hidróxido de Sodio 0.1 N hasta la marca de 56 ml. b) Con la varilla de vidrio, se añade materia fecal hasta aforar a 60 ml. c) Si las heces son duras, se espera un tiempo a que se reblandezcan. d) Se añaden 15 perlas de vidrio, se tapa la probeta, se agita fuertemente, de arriba abajo, durante 1 minuto, hasta formarse una suspensión homogénea. e) Los huevos y restos empiezan a precipitar en cuanto cesa la agitación. Con la pipeta se toma inmediatamente 0.075 o 0.15 ml del centro de la suspensión. Se recomienda el segundo volumen, que da una muestra mayor para el recuento. Llevando la punta de la pipeta al centro del matraz, el error debido a la precipitación de los huevos disminuye. f) Se pasa la totalidad del contenido de la pipeta a un portaobjetos y se cubre la gota con el cubreobjetos. g) Se examina la preparación sistemáticamente con el objetivo seco débil y se cuentan todos los huevos y larvas presentes cuidando no contar dos veces la misma estructura. CALCULOS: El número de huevos y larvas contados se multiplica por:  100, si la materia fecal es dura.  200, si la materia fecal es pastosa.  400, si la materia fecal es líquida. NOTA: •

• •

Estos factores dependen de la cantidad de agua que las muestras contengan. El resultado se expresa en huevos o larvas por ml de heces ( H.ml.H) Los quistes únicamente se reportan, sin cuantificarse.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su

estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* METODO CUANTITATIVO DE FROTIS GRUESO KATO FUNDAMENTO: Es un método cuantitativo de helmintos. El cual se basa en la acción que tiene la glicerina como aclarador de los huevos de helmintos y el verde de malaquita como colorante de contraste. MATERIAL y EQUIPO Aplicadores de madera Malla de alambre Papel celofán de grosor medio, no resistente a la humedad recortado en cuadros de 22 X 40 ó 22 X 30 mm Recipiente conteniendo glicerol Verde de malaquita al 3% Microscopio

METODO: a) Con un abatelenguas, pasar 50- 60 mg de materia fecal a un portaobjetos a través de la malla metálica. b) Cubrir la muestra con el cubreobjetos de celofán embebido en la solución de verde de malaquita y glicerol. Invertir la preparación, presionar sobre una hoja de papel filtro contra la superficie de la mesa de trabajo, para lograr la extensión de la muestra hasta cubrir un área de 20 a 25 mm de diámetro. c) Dejar reposar la preparación con el cubreobjetos de papel celofán hacia arriba durante una hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 34-40°C. Esto motivará el aclaración de las heces, sin que se aclaren los huevos de helmintos. d) Observar al microscopio, hacer el conteo de los huevos que se encuentren en la preparación. Para obtener la cifre total, cada cuenta alcanzada, multiplicarla por el factor correspondiente para expresarla en huevos por gramo de heces (h.g.h) Si se pesaron 50 mg , multiplicar por 20 que es un factor constante y el producto será la cifra a reportar. e) Debe evitarse exceder el tiempo de aclaración porque esto dificultaría la observación de los huevos de helmintos. Si fuese necesario demorar la observación puede detenerse el proceso de aclaración invirtiendo la preparación es decir colocarla con el papel celofán hacia abajo hasta el momento que se vaya a observar. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

IV.

EXAMENES ESPECIALES :

* METODO DE GRAHAM (RASPADO PERIANAL) FUNDAMENTO: Esta técnica se basa en que la hembra adulta de Enterobius vermicularis habitualmente no deposita sus huevos en el interior del intestino, sino que por lo general emigra durante la noche, hacia las márgenes del ano, depositando los huevos en los pliegues perianales. Es por esto que la toma debe efectuarse en la mañana indicando que debe ir a defecar y no debe bañarse. Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Ascaris umbricoides, Trichuris trichiura, Hymenolepis nana, Taenia sp.

MATERIALy EQUIPO Portaobjetos De 26 X 76 mm Abatelenguas Cinta de celulosa Scotch Microscopio

METODO: a) Sobre un extremo del abatelenguas se coloca la cinta Scotch con la parte adherente hacia fuera, sujetándola con los dedos pulgar e índice. b) Se presiona la superficie sobre la región perianal hacia uno y otro lado, finalmente se hace un frote perianal. c) Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y adherirlo sobre un portaobjetos. d) Observar con objetivo de 10X.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* MÉTODO DE HARADA MORI FUNDAMENTO: este método permite Realizar un cultivo de huevos para obtener desarrollo de larvas y así poder precisar la especie. MATERIAL Y EQUIPO: Agua Destilada Tubos de ensaye de punta cónica de 15 ml Gradilla Abatelenguas o aplicadores de madera

Tiras de papel filtro de 13 X 120 mm Portaobjetos de 26 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Pipetas Pasteur con bulbo Sol. De lugol o ácido acético al 20% Microscopio METODO: a) Se extiende una fina película de heces ( de 1 a 2 mm) en un lado del tercio medio de una tira de papel filtro. b) Se coloca el papel en un tubo de ensaye con 3 ml de agua destilada forzando la tira hasta aproximadamente el nivel de 1 cm y presionando el lado limpio contra la pared del tubo. c) Se conserva el cultivo a temperatura ambiente (24-28°C) en la oscuridad durante un periodo de 1-5 días añadiendo agua según se vaya necesitando para mantener el nivel bastante por encima del extremo inferior del papel filtro. d) El flujo capilar del agua que sube a través del papel y la película fecal mantiene húmedas las heces y transporta sus elementos solubles hacia la parte superior del papel, donde se evaporan o acumulan en un depósito oscuro. e) Al alcanzar la fase infecciosa, las larvas migran hacia abajo contra la corriente del flujo del agua, y al alcanzar el nivel de ésta se sumergen hacia el fondo, donde pueden verse con una lupa y tomarse con una pipeta para su examen microscópico. f) La tira de papel filtro puede transferirse a un tubo limpio lleno de agua para recoger las larvas que hayan podido quedar en la película fecal. g) Algunas especies de larvas tienen tendencia a no migrar hacia abajo. Antes de retirarlas, las larvas pueden inmovilizarse introduciendo el tubo a baño María (5060°C) o añadiendo una cantidad de ácido Acético al 20%. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* METODO DE BAERMAN Fundamento: Se basa en los tropismos positivos: geotropismo, termotropismo e hidrotropismo de los trofozoítos de protozoos y larvas de helmintos. Es útil principalmente para Balantidium coli y larvas de Strongyloides stercoralis. MATERIAL Y EQUIPO: Embudo de vidrio Gasa Coladera metalica

Pipeta pasteur Portaobjetos Solución salina Microscopio Estufa METODO: a) b) c) d) e)

Colocar la coladera metálica con la gasa doblada dentro del embudo Colocar dentro de la gasa de 3 a 4 grs de heces Verter solución salina a 370C en cantidad suficiente Dejar a temperatura o en la estufa a 280C – 370C de 30 a 50 minutos. Sacar la coladera o rejilla y con ayuda de una pipeta Pasteur, obtener un mililitro de sedimento. f) Colocar dicho sedimento en un portaobjetos y observar al microscopio. g) Se deberán reportar los estadios evolutivos de los parásitos encontrados.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

*ESTUDIO DE AMIBAS DE VIDA LIBRE GENERALIDADES: Las amebas de vida libre son numerosas y se encuentran en la naturaleza, en medios como: agua, suelos y vegetación. Los géneros Naegleria y Acanthamoeba ; tienen importancia en salud pública ya que pueden producir enfermedades de tipo mortal como la meningoencefalitis. La puerta de entrada para estas amebas al ser humano es a través de la piel o de las mucosas, así como también la inhalación de agua o aire contaminados con estos patógenos. Una vez en el organismo, aparece una lesión y a través del sistema circulatorio, las amebas pueden alcanzan el sistema nervioso central. En este tipo de infección las lesiones se caracterizan por formar gránulos o tumoraciones en los tejidos. Naegleria fowleri; causa una infección llamada meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP). Esta infección se adquiere por la inhalación de agua con amebas. Una vez en las fosas nasales las amebas viajan rápidamente a través de los tejidos olfatorios llegando al cerebro y concentrándose en el encéfalo. Dado que la invasión es muy rápida y las amebas se reproducen aceleradamente, comienza la destrucción masiva del cerebro y ocurren numerosas hemorragias en gran parte del sistema nervioso central, y la muerte sobreviene en el lapso de tres y siete días, dependiendo del manejo y resistencia del paciente, así como de la virulencia del microorganismo invasor. infección se adquiere por la inhalación de agua con amebas.

Las amebas del género Acanthamoeba son capaces de producir un padecimiento llamado encefalitis amebiana granulomatosa (EAG) o acantamebiosis, además de otras enfermedades en ojo, oídos, piel, pulmón, hígado, próstata y útero entre otros órganos. DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO: Para identificar las amebas de Naegleria fowleri;se deberán realizar frotes de LCR y teñir con Wright o Giemsa. Es importante decir, que en estas preparaciones, las amibas muestran abundante citoplasma azulado y un nucleo pequeño y delicado de color rosa.El LCR en estos casos es purulento o sanguinolento, con leucocitos, principalmente neutrofilos hasta más de 20,0007mm3, la glucosa es baja y el contenido de proteínas alto. Para la identificación de Acanthamoeba en LCR se deben Observar de manera directa de la formas trofozoiticas. En tejido nervioso se deben observar las formas quísticas.

* ESTUDIO DE PROTOZOARIOS CILIADOS INTESTINALES FUNDAMENTO: Este método permite hacer la identificación por medio de un examen coproparasitoscópico directo del trofozoito en heces diarreicas y el quiste en heces formadas del parásito Balantidium coli. MATERIAL Y EQUIPO Aplicadores de madera Portaobjetos de 25 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Solución Salina isotónica Lugol Agua destilada Microscopio Materia fecal porcina

METODO a) Colocar en un lado del portaobjetos una gota de solución salina y del otro extremo una gota de lugol. b) Agregar una porción de materia fecal porcina y homogeneizar. c) Colocar el cubreobjetos procurando no hacer vacíos. d) Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. e) Hacer los dibujos y anotar resultados. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* ESTUDIO DE PROTOZOARIOS CILIADOS EN CAVIDADES FUNDAMENTO: Este método permite demostrar la presencia de protozoarios flagelados en exudados vaginales y uretrales y en orina por medio de examen directo. El parasito más comúnmente encontrado es Trichomonas vaginalis. MATERIAL Y EQUIPO Microscopio Hisopo Portaobjetos Cubreobjetos Tubo de ensaye con sol. Isotónica estéril Espejo vaginal Puente de tinción Pipeta Pasteur con bulbo Aceite de inmersión Colorante de Wright

Secreción vaginal, uretral u orina Pizeta con agua destilada

METODO: a) b) c) d) e)

Se coloca a la paciente en posición ginecológica. Introducir con cuidado el espejo vaginal. Con un hisopo tomar la muestra del fondo de saco posterior. Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido. La segunda toma depositarla en un tubo de ensaye con solución salina conservando a 37°C. f) Una vez seco el extendido se procede a teñir con el colorante de Wright de 1 a 3 min. g) Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a éste último aceite de inmersión. h) Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensaye y se deposita en un portaobjetos y se cubre. i) Examinar con objetivos de 10X y 40X. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos).

* ESTUDIO DE EXPECTORACION PARA LA BUSQUEDA DE PARASITOS PULMONARES

FUNDAMENTO: este método consiste en investigar en secreciones pulmonares, presencia de protozoarios. MATERIAL Y EQUIPO Microscopio Portaobjetos 25 X 76 mm Aplicador de madera Mechero Puente de tinción Colorante de Giemsa Sol. Buffer ph 7.0-7.2 Aceite de inmersión Frasco con expectoración o material de aspiración bronquial

METODO: a) En un portaobjetos limpio y desengrasado hacer un frotis de la expectoración. b) Dejar secar 5 minutos. c) Proceder a teñir cubriendo el frotis con sol. colorante de Giemsa por 30 minutos, escurrir y lavar con sol. buffer, escurrir y dejar secar. d) Observar al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a esta última observación aceite de inmersión. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos).

* ESTUDIO DE PLASMODIUM

GENERALIDADES: El procedimiento para el diagnóstico de protozoos en sangre circulante es el estudio al microscopio de preparaciones en portaobjetos las cuales son la extensión fina y la gruesa. La extensión fina ideal es la que tiene el grosor de una célula y en la que los elementos celulares aparecen algo aplanados. La extensión fina es útil para estudiar detalles de los hematíes y de los parásitos de la sangre, su principal limitación es que la cantidad de sangre presente en la muestra es pequeña.La extensión gruesa contiene 6-20 veces más sangre por unidad de

superficie que la extensión fina. Es fundamental que no se fije antes de la tinción ya que los hematíes tienen que deshemoglobinizarse durante el procedimiento. La rotura de los hematíes y la pérdida de su hemoglobina permite la visión microscópica de las demás estructuras, incluidos los parásitos sanguíneos, aunque se encuentren en la parte más profunda de la extensión. La extensión gruesa resulta útil para el diagnóstico rápido de las parasitemias demasiado leves para apreciarse en la extensión fina, pero no sirve para estudios anatómicos finos. La toma de sangre periférica para Plasmodium vivax y P. Malarie deben efectuarse cuando el paciente presenta escalofríos para la búsqueda de esquizontes maduros. Para P. Falciparum se debe tomar la muestra después del acceso febril para observar los eritrocitos con varios trofozoitos antes que estos desaparezcan en capilares de órganos internos. Con el colorante Giemsa las estructuras se tiñen de la siguiente manera: ➢ ➢ ➢ ➢

Plasmodium: Citoplasma azul o azul grisáceo. Eritrocitos: Azulosos, grisáceos y en ocasiones rosados. Núcleo de los Leucocitos: Violeta o morado. Plaquetas: Violeta ligero o rosa pálido.

* COLORACION DE HEMATOXILINA FERRICA DE HEIDENHAIN FUNDAMENTO:Esta tinción permite colorear estructuras internas de especímenes adultos o fragmentadas del mismo . Se usa en casos de cestodos y trematodos. MATERIAL Y EQUIPO: portaobjetos Cubreobjetos Frasco coplin o placas Petri Colorante de hematoxilina Cytoseal o bálsamo de Canadá Alcoholes 50%, 70%, 85%, 95% Solución Schaudinn Solución mordiente de sulfato de fierro y amonio Tintura de yodo Solución fisiológica Microscopio binocular

METODO: a) Preparar un set de placas petri 100 x 150 mm o el frasco Coplin con los reactivos correspondientes y con ayuda de un estilete o pinza curva hacer un frotis fino en la lámina o la laminilla, esta última sujeta al porta-laminilla. b) Si la muestra es dura, hacer una emulsión previa en solución fisiológica, realizar el frotis y pasaren solución Schaudinn por 3 a 5 minutos. c) Pasar por alcohol 70% más 1 a 2 gotas de tintura de yodo por 5 minutos d) Pasar por alcohol 70% y 50% de 5 a 10 minutos cada vez.-Pasar por agua corriente por 5 a 10 minutos e) Pasar por la solución mordiente 2% de 5 a 10 minutos y enjuagar con agua corriente.

f)

Pasar por colorante por 5 a 10 minutos (1 mL de solución colorante hematoxilina y 9 mL de agua) g) Lavar con agua y pasar por una segunda solución de mordiente al 2% para decolorar, observandola intensidad de la coloración h) Lavar con agua corriente a chorro continuo de 10 a 15 minutos i) Deshidratar pasando por alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto, de 10 a 15 minutos cada uno j) Aclarar con xilol agitando el frotis, montar con cytoseal o bálsamo de Canadá y observar al microscopio. k) Informar el nombre del parásito y el estadio evolutivo

NOTA: Observar con objetivo de inmersión 1000x. El citoplasma de los parásitos se observan de color azul oscuro y los núcleos de color morado intenso a negruzco.

INTERPRETACION DE RESULTADOS :En caso de encontrar algún parasito en la tinción se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo .

* TÉCNICA DE ZIEHL NEELSEN

(MODIFICADA PARA OBSERVAR COCCIDIAS:

CRIPTOSPORIDIUM)

FUNDAMENTO: Se basa en el comportamiento acido-resistente de la cubierta de estos parásitos , los cuales se tiñen de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul , dependiendo del colorante de contraste usado.

MATERIAL Y EQUIPO: Portaobjetos Cubreobjetos Puente para tinción Fucsina fenicada Verde de malaquita o azul de metileno acuoso Metanol Hidróxido de sodio al 4% Alcohol acido METODO: a) b) c) d)

Realizar un frote de heces en el portaobjetos y dejar secar. Colocar las laminas sobre el puente de tinción Fijar la lamina con alcohol metílico de 2 a 3 minutos y dejar secar Agregar hidróxido de sodio, sobre el preparado por un minuto y eliminar el exceso con agua de la llave.

e) Cubrir la lamina con fucsina fenicada (previa agitación del frasco que contiene dicho reactivo). Por 5 minutos. Es importante recordar que la fucsina debe ser diluida previamente con agua al tercio (1 ml de colorante mas 2 ml de agua) f) Lavar suavemente la lamina con agua corriente g) Cubrir el portaobjetos con alcohol acido por unos segundos hasta quitar el colorante. h) Lavar suavemente la lamina con agua corriente i) Colocar el colorante de contraste a la lamina que puede ser verde de malaquita al 1% o azul de metileno al 1.4%, durante 5 minutos( diluidas previamente al tercio) j) Lavar suavemente la lamina con agua corriente y secar a temperatura ambiente. k) Realizar el montaje con cytoseal, bálsamo de Canadá o Permount, cubrir con un portaobjetos. l) Observar al microscopio. NOTA: Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora, aparecen de un color rojo fucsina, sobre un fondo verdoso (verde de malaquita). En algunos no se colorean bien, pero la refringencia característica permite diferenciarlos. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algún parasito acido alcohol resistente en la tinción se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo .

*PROTOZOOARIOS INTESTINALES: ENTAMOEBAS :

QUIST TROF OZOIT E O

Entamoeba :

*AMIBAS DE VIDA LIBRE :

AMEBA

TROFOZOITO

FLAGELADO TRANSITORIO

Naegleria fowleri

Acanthamoeba sp..

Balamuthia mandrillaris..

*PROTOZOOARIOS FLAGELADOS :

QUISTE

*PROTOZOOARIOS INTESTINALES COCCIDIOS Y BLASTOCYISTIS:

CILIADOS ,

* HELMINTOS : HUEVOS DE NEMATODOS Y CESTODOS PRESENTES EN HECES :

*PROTOZOOARIOS INTESTINALES COCCIDIOS Y BLASTOCYISTIS:

CILIADOS ,

* HELMINTOS : HUEVOS DE NEMATODOS Y CESTODOS PRESENTES EN HECES :

* HUEVOS DE TREMATODOS PRESENTES EN LAS HECES

ETAPAS JUVENILES , DE UNCINARIAS Y STRONGYLOIDES :

* PROGLOTIDOS GRAVIDOS Y ESCOLICES DE CÉSTODOS.

* E T A P A S

RABDITOIDES Y FILARIFORMES DE UNCINARIAS Y STRONGYLOIDES:

*NOTA : LARVA RABDITOIDE : Larva de vida libre (viven en el ambiente ) LARVA FILARIFORME : Tipo de forma larvaria en la cual se transforma una larva rabditoide al encontrar un hospedero a quien parasitar

* TAMAÑO COMPARATIVO DE HUEVOS DE HELMINTOS : * HEMOFLAGELADOS : Tripanosoma y Leishmania :

AMASTIGOTE ó LEISHMANIA

PROMASTIGOTE ò LEPTOMONA

TRIPOMASTOGOTE EPIMASTIGOTE òò TRIPANOSOMA CRITHIDIA

Cinetoplasto

Flagelo

Cinetoplasto

Flagelo

Cinetoplasto *Forma hombre

Cinetoplasto

Flagelo

infectante

Gránulos de votulina CuerpoB asal

Membrana ondulante Membrana ondulante Núcleo

Núcleo *Forma transitoria

* Plasmodium FASE ERITROCITARIA :

Núcleo

Núcleo

al

JOVEN

VIEJO

TROFOZOITOS

INMADURO

MADURO

EZQUIZONTES

MASCULINO

FEMENINO

GAMETOCITOS

* FIJADORES y/o CONSERVADORES Los fijadores sirven para preservar protozoarios, sin que se modifiquen las estructuras internas, sobre todo cuando las muestras no pueden ser procesadas inmediatamente.

El conservador mas utilizado en el laboratorio por económico y eficaz es la Solución de formalina al 10 % también conocido como formol , aldehído fórmico o formaldehido. Sin embargo a continuación se hará referencia a diversos conservadores que también se utilizan ampliamente dentro del laboratorio de Parasitologia :

I. PAF (phenol-alcohol-formol): UTILIDAD: Conserva las estructuras de los parásitos (trofozoítos, quistes, huevos y larvas), pudiéndose incluso observarse en semanas o meses (6) sin que haya ocurrido deterioro alguno. Es recomendable mantener el fijador preparado en frascos color ámbar. Además, permite observar el material al microscopio. MATERIAL: Fijador PAF Tionina o azure A Agua destilada. Hisopo. Tubos de centrífuga de 15 mL. Aplicadores. Tritón NE. Éter. Embudo de vidrio. Solución fisiológica PROCEDIMIENTO: a) La muestra de heces se mezcla con el fijador en un recipiente en la proporción 1:1. b) Para la observación microscópica. Mezclar bien la muestra fijada en PAF y con ayuda de un embudo y una gasa doblada en un tubode 15 mL, colar de 3 a 4 mL del material fijado c) Agregar solución salina hasta un volumen de 12 mL y centrifugar a 1800 r.p.m. por 3 minutos. d) Decantar el sobrenadante y obtener un sedimento de 0,5 mL; si es menor, agregar de la muestra filtrada una cantidad suficiente y volver a centrifugar para obtener el volumen del sedimento deseado. e) Decantar el sobrenadante y completar 12 mL con solución fisiológica, emulsionar con el aplicador centrifugar a 1800 r.p.m. por 3 minutos. f) Repetir el centrifugado y lavar de 2 a 3 veces más. g) Agregar 2 mL de solución fisiológica al sedimento final, emulsionar y obtener una gota del sedimento con una pipeta Pasteur y colocarla en una lámina portaobjetos h) Agregar una gota del colorante tionina o azure A, cubrir con una laminilla cubreobjetos y examinar al microscopio.

i) Al sedimento emulsionado y sobrante del procedimiento anterior, agregar 10 mL de solución fisiológica y una gota de Triton NE. j) Mezclar, agregar 2 mL de éter, tapar con un tapón de jebe o de corcho, agitar suavemente y destapar. k) Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 3 minutos, decantar y eliminar los detritus de las paredes del tubo mediante un aplicador cubierto de algodón. l) Agregar al sedimento 1 ó 2 gotas de solución fisiológica, mezclar y obtener del fondo del tubo con una pipeta Pasteur una gota que se colocará en una lámina portaobjeto. m) Agregar una gota de colorante tionina o azure A, cubrir con una laminilla y observar al microscopio NOTA: • Se deberán observar los elementos parasitarios: el citoplasma se ve de color azul y el núcleo azul oscuro. II. PVA (alcohol polivinílico): UTILIDAD: Fija y preserva, principalmente los trofozoítos y quistes de protozoarios, por tiempo muy prolongado sin modificación importante de su morfología. MATERIAL: Solución fijadora Conservador de PVA Aplicador Viales de vidrio de 3 a 4 mL. Portaobjetos

PROCEDIMIENTO: a) Colocar en una lámina portaobjetos 1 ó 2 mg de muestra, b) Secar el frotis, agregar 2 ó 3 gotas de PVA y secar o guardar hasta por 3 meses para colorearlos, c) Agregar al frasco que contiene la muestra v/v 1 a 4 mL. Generalmente se puede preservar por meses y cuando se considere conveniente se realizará la coloración con Trichrome Gomori Wheatley.

III. MIF (merthiolate - yodo - formol): UTILIDAD:

Fija y colorea simultáneamente los quistes y huevos de parásitos, permitiendo la observación inmediata de la muestra. MATERIAL: Solución MIF Viales de vidrio de 3 a 4 mL. Aplicador

PROCEDIMIENTO: a) Colocar 1 ó 2 mL de la solución MIF en el vial con ayuda del una pipeta. b) Para la observación microscópica, colocar 1 ó 2 mL o su equivalente de la muestra fresca de heces. c) Mezclar y observar al microscopio. NOTA: • Se deberán observar los parásitos teñidos de color amarillo oro.

IV. FIJADORES PARA PRESERVAR HELMINTOS ADULTOS: UTILIDAD: Conserva ejemplares adultos para su estudio morfológico, su preservación en museos o para contar con muestras de referencia. Los más usados suelen ser formol al 10%, AFA (Ácido acético - Formol- Alcohol) o SAF (Acetato sodio - ácido acético - formol)

. MATERIAL: Formol 10% Solución AFA Alcohol 70% Glicerina 5% Láminas portaobjetos. Pabilo o pesas de metal según modelo Frascos boca ancha 150 – 200 mL. Placas petri 150 x 100 mm y 240 x 200 mm.

PROCEDIMIENTO: Colección y lavado de los helmintos: a) Todo espécimen aislado del hospedero debe mantenerse fresco (agua o suero fisiológico) en un frasco con tapa. b) Los adultos colectados son lavados varias veces con solución fisiológica, para eliminar la mucosidad y otras sustancias adheridas al cuerpo del helminto. c) Finalmente, se lava con agua para permitir el relajamiento del parásitoCalentar a 55ºC de temperatura, alcohol de 70%, formol 10% ó AFA, para que con la fijación los ejemplares queden estirados y pueda observarse sus estructuras internas. Fijación: d) Para una conservación apropiada usar formol 10% (para céstodos y tremátodos) o una mezcla de alcohol 70% (para nemátodos), ambos con glicerina 5%. e) Todos los frascos deben ser rotulados, indicando el nombre del parásito, procedencia, localización y fecha de colección. f) Para la identificación, en ocasiones se requiere hacer el aclaramiento con lactofenol. Aplanamiento: g) Útil para céstodes y tremátodes, los cuales se colocan entre láminas y se les ajusta con el pabilo para favorecer su aplanamiento h) Se sumerge en formol 10% o AFA de 1 a 3 días, luego del cual se puede colorear o conservar como pieza de museo en formol 10% y glicerina 5%. i) Los tremátodes como Fasciola y/o Paragonimus pueden prepararse y conservarse siguiendo los pasos dados para los céstodos.

 AFA: Fijador conteniendo alcohol, formol y ácido acético.  CÁPSULA OVÍGERA: Vesícula que contiene huevos.  CESTODO: Gusano o helminto platelminto de forma acintada.  COLORANTE VITAL: Colorante que permite ver la estructura interna del parásito vivo.  COPRO-ANTÍGENO: Antígeno presente en las heces.  CRISTAL DE CHARCOT - LEYDEN: Cristales de proteínas provenientes de los gránulos de eosinófilos, que se destruyen en el intestino.  DIAFANIZAR: Aclarar para facilitar la visualización microscópica  DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO: Demostración directa o indirecta de alguna forma o estadio evolutivo del parásito.

 ENTEROPARÁSITO: Parásito que tiene por hábitat el tubo digestivo, especialmente el intestino.  ESPORA: Esporoquiste aislado.  ESPOROQUISTE: Quiste con cubierta definida que contiene esporozoítos.  ESTRÓBILA: Porción del cuerpo de las tenias o céstodes formadas por una cadena de proglótidos.  FIJACIÓN: Conservación de la estructura del parásito.  HECES: Mezcla de productos de excreción y secreción que se eliminan por el intestino.  HELMINTO: Ser pluricelular con exoesqueleto flexible, ausencia de apéndices y con movimientos reptantes.  HPG: Número de huevos por gramo de heces.  HUEVO: Producto de la fecundación con potencialidad de desarrollar un nuevo ser.  LARVA: Estadio evolutivo de algunos seres vivos como los helmintos y los artrópodos en quienes aún no se han desarrollado los aparatos genitales.  MIF: Fijador que contiene merthiolate, yodo y formol.  MONTAR: Colocar el espécimen entre lámina y laminilla con bálsamo de Canadá para su conservación permanente.  NEMATODO: Gusano o helminto de forma cilíndrica.  OOQUISTE: Quiste que contiene el huevo o cigoto.  PAF: Fijador y/o conservador conteniendo fenol, alcohol y formol para muestras con parásitos, sobretodo protozoario.  PVA: Alcohol polivinílico, fijador para conservar los parásitos en muestras fecales.  PARÁSITO: Ser vivo de escala zoológica inferior que vive a expensas de otro de escala superior.  PATOGENICIDAD: Capacidad de producir daño.  PROTOZOARIO: Ser unicelular.  PROGLÓTIDE: Segmento o anillo de la estróbila de las tenias o céstodes y que puede ser inmaduro, maduro o grávido, según el estadío de desarrollo de sus aparatos genitales.

 QUISTE: Forma de resistencia de los protozoos, los cuales se rodean de una membrana dura e impermeable.  SOLUCIÓN SOBRESATURADA: Solución en la cual el soluto está en su máxima concentración.  TROFOZOÍTO: Forma vegetativa, libre y en movimiento de los protozoos.  TREMÁTODE: Gusano aplanado o platelminto, que presenta su cuerpo indivisible.

BIBLIOGRAFIA: •

http://groups.msn.com/parasitologia1

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http://www.invdes.com.mx/anteriores/Febrero2002/htm/amebas.html

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http://www.drscope.com/privados/pac/generales/parasitologia/teniasis.html

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http://www.pdfcoke.com/doc/2362490/Manual-parasitologia-laboratorio-parte-I

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http://www.pdfcoke.com/doc/2362916/MANUAL-PARASITOLOGIALABORATORIO-PARTE-II

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http://www.pdfcoke.com/doc/995852/165-NT37