Maduracion De Frutos Zapote Negro

CAMBIOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS DE ZAPOTE NEGRO (Diospyros digyna Jacq.) BIOCHEMICAL AND PHYSIOLOGICAL CHANGES DURING RIPENING OF BLACK SAPOTE FRUIT (Diospyros digyna Jacq.) Luis A. Arellano-Gómez, Crescenciano Saucedo-Veloz y Lourdes Arévalo-Galarza Fruticultura. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México ([email protected]) ([email protected])

RESUMEN

ABSTRACT

El objetivo de este trabajo fue estudiar los principales cambios relacionados con el proceso de maduración de frutos de zapote negro (Diospyros digyna Jacq.) a 25±2 °C de temperatura y 65 a 70% de humedad relativa por un periodo de seis días. Los frutos presentaron un comportamiento climatérico, definido por un aumento significativo de la velocidad de respiración y producción de etileno, que alcanzaron su máximo a los 6 y 5 d después de la cosecha; la autocatálisis de etileno quedó establecida por el incremento significativo en la actividad de la enzima ACC-oxidasa, cuyo máximo antecedió al de etileno en 1 d. El proceso de ablandamiento inicial de los frutos estuvo asociado a la reducción en la firmeza desde 31.5 N a la cosecha hasta 3.8 N en el d 6, así como a una alta actividad de la enzima pectinmetilestearasa (PME). Hubo un incremento constante en concentración de carotenoides hasta el d 4 para después disminuir como resultado de un proceso de oxidación, coincidiendo con la disminución de ácido ascórbico de 180.7 a 69.8 mg 100 g−1 en el d 6. Los compuestos fenólicos fueron oxidados por la enzima polifenoloxidasa (PFO), contribuyendo así al típico color negro-café de la pulpa.

The aim of this paper was to study the main changes related to the ripening of black sapote fruit (Diospyros digyna Jacq.) stored at 25±2 °C and 65 to 70% relative humidity for six days. The fruits showed a climateric pattern, defined by a significant increase in respiration rate and ethylene production, which reached their maximum on the sixth and fifth day after harvest respectively; the autocatalysis of ethylene was established by the significant increase in ACC-oxidase activity, whose maximum preceded that of ethylene by one day. The initial softening of the fruits was related to the decrease in firmness from 31.5 N after harvest to 3.8 N on the sixth day associated with a high activity of pectinmethylesterase (PME). There was a constant increase of carotenoid content up to the fourth day and later a decrease as a result of an oxidative process which was related to the sharp decrease in the concentration of ascorbic acid from 180.7 to 69.8 mg 100 g−1. The phenolic compounds were oxidized by polyphenol oxidase enzyme (PPO), thus contributing to the typical black-brown color of the pulp. Key words: Enzymatic activity, phenolic compounds, respiration rate, polyphenol oxidase, ethylene production.

Palabras clave: Actividad enzimática, compuestos fenólicos, intensidad respiratoria, polifenol oxidasa, producción de etileno.

INTRODUCTION

T

INTRODUCCIÓN

he black sapote (Diospyros digyna Jacq.) is a fruit native to the south of México and Central America that belongs to the family of Ebanaceae, like the persimmon (Diospyros kaki) and the ebony (Diospyros ebenum) (Martín et al., 1987). In México, this species is found in diverse tropical and subtropical zones. In 2001, the production of black sapote was 729.2 tons, with a total value of 1.35 million pesos; the principal producing states were Tabasco, Guerrero, Chiapas and Puebla (SAGARPA, 2001). The fruit is a globe-shaped berry, with a persistent calyx with a diameter of 7 to 12 cm; the epicarp (skin) is bright green at physiological ripeness and is adhered to the pulp; the mesocarp (pulp) is brown to black, very abundant and sweet, containing 6 to 10 seeds per fruit encased in a transparent membrane (Morton, 1987; Martín et al., 1987). The sapote contains mainly carbohydrates, minerals and ascorbic acid, with a

E

l zapote negro (Diospyros digyna Jacq.) es un fruto nativo del sur de México y Centroamérica que pertenece a la familia Ebenaceae, al igual que el persimonio (Diospyros kaki) y el ébano (Diospyros ebenum) (Martín et al., 1987). En México, esta especie se encuentra en diversas zonas tropicales y subtropicales. En 2001 la producción de zapote negro fue 729.2 toneladas, con un valor total de 1.35 millones de pesos; los principales estados productores fueron Tabasco, Guerrero, Chiapas y Puebla (SAGARPA, 2001). El fruto es una baya de forma globosa, cáliz persistente con 7 a 12 cm de diámetro; el epicarpio (cáscara) es de color verde Recibido: Agosto, 2003. Aprobado: Enero, 2005. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 39: 173-181. 2005. 173

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brillante en la madurez fisiológica y se encuentra adherido a la pulpa; el mesocarpio (pulpa) es de color café a negro muy abundante y dulce; contiene 6 a 10 semillas por fruto envueltas por una membrana transparente (Morton, 1987; Martín et al., 1987). El zapote contiene principalmente carbohidratos, minerales y ácido ascórbico, superando en este último a los cítricos (Miller et al., 1998). Por sus características organolépticas los frutos se consumen en estado fresco; la pulpa se utiliza en la fabricación de helados y paletas, para relleno en repostería y elaboración de conservas (Miller et al., 1998). Las frutas inmaduras tienen un color de pulpa amarillo-dorado y no son comestibles por su marcado sabor astringente; cuando madura, la pulpa se torna completamente suave y con un color café-negro característico (Ledesma y Campbell, 2001). A pesar de su importante aceptación en diversos mercados regionales y su gran potencial de comercialización como fruta exótica, existe escasa información sobre los mecanismos bioquímicos y fisiológicos relacionados con su proceso de maduración, información necesaria para establecer sus requerimientos de manejo postcosecha. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar los cambios bioquímicos y fisiológicos que definen el proceso de maduración de los frutos de zapote negro.

MATERIALES Y MÉTODOS Frutos de zapote negro en estado de madurez fisiológica, definida por el tamaño, tonalidad verde-brillante de la cáscara y levantamiento del cáliz de la base del fruto, fueron cosechados en enero de 2002, en Coatlán del Río, Morelos, México (Altitud: 1010 m). En las siguientes 12 h los frutos se trasladaron al Laboratorio de Fisiología Postcosecha del Colegio de Postgraduados en Montecillo, México, en cajas de cartón de 4 kg. Para el experimento se seleccionó una muestra de 100 frutos sin daños ni defectos y se mantuvieron a 25±2 °C y con 65 a 70% de humedad relativa durante 6 d, consideradas como condiciones de maduración. Durante el periodo mencionado, se realizó la determinación de las variables que se describen enseguida. Intensidad respiratoria y producción de etileno Se determinó por cromatografía de gases, de acuerdo con el método estático (Salveit y Sharaf, 1992), utilizando un cromatógrafo de gases (Hewlett Packard 5890 Serie II) equipado con un detector de conductividad térmica (TCD) y un detector de ionización de flama (FID). Esta determinación se realizó con diez frutos enteros colocados en pares en diferentes recipientes con volumen conocido y cerrados herméticamente durante 1 h, y hubo un total de cinco repeticiones. Cada 12 h se tomó una muestra de 1 mL del espacio de cabeza y se inyectó en el cromatógrafo utilizando estándares de

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higher content of the latter than the citrus fruits (Miller, et al., 1998). Due to its organoleptic characteristics, the fruit is consumed while fresh; the pulp is used in the elaboration of ice cream and popsicles, for filling in desserts, and in the making of preserves (Miller et al., 1998). The unripe fruit have a golden yellow colored pulp and are not edible due to its highly astringent taste; when ripe, the pulp becomes completely soft and with a characteristic brownblack color (Ledesma and Campbell, 2001). Despite its wide acceptance in diverse regional markets and its great potential of commercialization as an exotic fruit, there is little information available regarding the biochemical and physiological mechanisms related to its ripening process, information necessary for establishing its requirements of postharvest management. Thus, the objective of the present study was to evaluate the biochemical and physiological changes that define the ripening process of the black sapote fruit.

MATERIALS AND METHODS Black sapote fruits in the stage of physiological ripeness, defined by size, brilliant green tone of the skin and raised calyx of the base of the fruit, were harvested in January of 2002, in Coatlán del Río, Morelos, México (Altitude: 1010 m). During the following 12 h the fruits were transported to the Laboratorio de Fisiología Postcosecha of the Colegio de Postgraduados in Montecillo, México, in 4 kg cardboard boxes. For the experiment, a sample of 100 undamaged fruits free of defects was selected and maintained at 25±2 °C and 65 to 70% relative humidity during 6 d, considered as ripeness conditions. During the aforementioned period, the variables described below were determined. Respiratory intensity and ethylene production It was determined by gas chromatography, according to the static method (Salveit and Sharaf, 1992), using a gas chromatograph (Hewlett Packard 5890 Series II) equipped with a thermic conductivity detector (TCD) and a flame ionization detector (FID). This determination was carried out with ten whole fruits placed in pairs in different recipients of known volume and hermetically closed during 1 h, with a total of five repetitions. Every 12 h a 1 mL sample was taken from the head space and was injected in the chromatograph using standards of ethylene (10mg L−1) and carbon dioxide (500 mg L−1). The results of the respiratory intensity were reported as mL CO2 kg−1 h−1, and those of ethylene production in µL C2H4 kg−1 h−1. Firmness It was determined by means of a Chatillon model FDV-30 texturemeter with a 0.7 diameter conical support, measuring the force (Newtons) necessary for penetrating the pulp. This variable was evaluated daily in five whole fruits in which 1 cm was eliminated from

CAMBIOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS DE ZAPOTE NEGRO (Diospyros digyna Jacq.)

etileno (10 mg L−1 ) y dióxido de carbono (500 mg L−1 ). Los resultados de intensidad respiratoria se reportaron como mL CO2 kg−1 h−1, y los de producción de etileno en µL C2H4 kg −1 h−1.

the epicarp in opposite sides of the middle part, with two measurements per fruit. Weight loss

Firmeza Se determinó mediante un texturómetro Chatillon modelo FDV30 con puntal cónico de 0.7 cm de diámetro, midiendo la fuerza (Newtons) necesaria para penetrar la pulpa. Esta variable se evaluó diariamente en cinco frutos enteros en los cuales se eliminó 1 cm del epicarpio en lados opuestos de la parte media, realizando dos mediciones por fruto. Pérdida de peso Para esta variable se utilizó un lote de 10 frutos, pesados individualmente cada dia durante la maduración. Las pérdidas de peso acumuladas se midieron en porcentaje (%) respecto al peso inicial de los frutos, en cada periodo de evaluación. Carotenoides totales

For this variable, a lot of 10 fruits was used, which were individually weighed each day during ripening. The accumulated weight losses were measured in percentage (%) with respect to the initial weight of the fruits, in each evaluation period. Total carotenoids The method employed was that described by Ting and Rouseff (1986). The pigments were extracted from samples of 20 mg of pulp, 70 mL of acetone was added, and left to sit for 12 h. The mixture was filtered, placed in a 500 mL separation funnel, adding 20 ml of hexane and 100 mL of distilled water; it was agitated and the phases were left to sit; the upper phase contains the carotenoids and the lower phase acetone. The extract of carotenoids (in hexane) was washed with water until the odor of acetone was eliminated, and in this extract the absorbance was measured at 452 nm in a Spectronic 20. The content of carotenoids (mg 100 g−1) was calculated from a pattern curve of βcarotene.

Se usó el método de Ting y Rouseff (1986). Los pigmentos se extrajeron de muestras de 20 g de pulpa, se adicionó 70 mL de acetona y se dejó reposar por 12 h. La mezcla se filtró, se colocó en un embudo de separación de 500 mL y se añadió 20 ml de hexano y 100 mL de agua destilada; se agitó y dejó reposar las fases: la fase superior contiene los carotenoides y la inferior acetona. El extracto de carotenoides (en hexano) se lavó con agua hasta eliminar el olor a acetona y en este extracto se midió la absorbancia a 452 nm en un Spectronic 20. El contenido (mg 100 g−1) de carotenoides se calculó a partir de una curva patrón de β caroteno.

It was determined based on the 2, 6 dichlorophenol indophenol method (AOAC, 1990). Five samples were taken daily (5 g of pulp), homogenized with 50 mL oxalic acid (5 g 100 mL−1), and an aliquot of 5 mL was taken, and then titled with the Tillman solution until the pink color remained visible for 1 min. The amount (mg 100 g−1) of ascorbic acid was calculated by reference to solutions of a known concentration of ascorbic acid.

Ácido ascórbico

Total phenols

Se determinó con base en el método del 2, 6 diclorofenol indofenol (AOAC, 1990). Diariamente se tomaron cinco muestras (5 g de pulpa), se homogeneizaron con 50 mL de ácido oxálico (5 g 100 mL−1), se tomó una alícuota de 5 mL que se tituló con la solución de Tillman hasta que el color rosa permaneció visible por 1 min. La cantidad (mg 100 g−1) de ácido ascórbico se calculó por referencia con soluciones de ácido ascórbico de concentración conocida.

The technique described by Litwack (1967) was used, in which 0.1 g of acetone powder is mixed with 4 mL of extracting solution, then it was centrifuged (700 xg 15 min), 10 mL of Na2CO3 were added, and it was incubated (38 °C 15 min); 1 mL was taken and 3.5 mL H2O and 0.5 mL of the Folin-Ciocalteau reactive were added. The reading was made at an absorbance of 660 nm (data in mg 100 g−1), taking the standard phenol curve as reference.

Ascorbic acid

Fenoles totales

Activity of the ACC oxidase enzyme

Se utilizó la técnica descrita por Litwack (1967), en la que 0.1 g de polvo de acetona se mezclan con 4 mL de solución extractora, se centrifugó (700 xg 15 min), se agregó 10 mL de Na2CO3 e incubó (38 °C 15 min); se tomó 1 mL y agregó 3.5 mL de H2O y 0.5 mL del reactivo Folin-Ciocalteau. La lectura se realizó a una absorbancia de 660 nm (datos en mg 100g−1), tomando como referencia la curva estándar de fenol.

This was determined by the method described by Serrano et al. (1991), for which 2 mL of Hepes-Tris buffer solution (25 Mm; pH=7.5) and ACC (1mM) were added to 0.4 g of pulp in vials of 25 mL, which were placed in a double boiler (30 °C, 2 h); 1 mL of gas was taken from the head space and injected in the gas chromatograph. The results are reported as the amount of ethylene produced per gram of pulp (µL C2H2 . g−1 h−1).

ARELLANO-GÓMEZ et al.

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Actividad de la enzima ACC oxidasa

Activity of the enzyme pectinmethylesterase (PME)

Se determinó por el método descrito por Serrano et al. (1991), para lo cual a 0.4 g de pulpa se agregó 2 mL de solución amortiguadora Hepes-Tris (25 mM; pH=7.5) y ACC (1 mM) en viales de 25 mL que se colocaron en baño María (30 °C, 2 h); se tomó 1 mL de gas del espacio de cabeza e inyectó en el cromatógrafo de gases. Los resultados se reportan como la cantidad de etileno producido por gramo de pulpa (µL C2H2 . g−1 h−1).

The Ranganna method (1979) was used. The pulp was made to react with citric pectin as substrate, and by adjustment of pH to 7.5 during 30 min the methoxyl groups were quantified, unfolded by the enzyme, per gram of solid solubles or °Brix (mg methoxyl 100 g−1).

Actividad de la enzima pectinmetilestearasa (PME)

This was measured by the Martínez-Téllez and Lafuente method (1997). To 0.4 g of acetone powder, 15 mL of 0.1M sodium borate buffer (pH 8.8) were added, with 20 mM of β-mercaptoethanol, and incubated (2 h, 40 °C). The activity of PAL (picokatals per gram of dry weight, pkat g−1 PS) was determined in the solution with 2 mL of purified enzymatic extract and 0.6 mL of phenylalanine 100 mM.

Se utilizó el método de Ranganna (1979). Se hizo reaccionar la pulpa con pectina cítrica como sustrato, y por ajuste de pH a 7.5 durante 30 min se cuantificaron los grupos metoxilo, desdoblados por la enzima, por gramo de sólidos solubles o °Brix (mg metoxilo 100 g−1). Actividad de la enzima fenilalanina amonialiasa (FAL) Se midió utilizando el método de Martínez-Téllez y Lafuente (1997). A 0.4 g de polvo de acetona se agregaron 15 mL de 0.1M amortiguador borato de sodio (pH 8.8), con 20 mM de βmercaptoetanol; se centrifugó la mezcla (25000 xg, 20 min) y se agregó sulfato de amonio hasta saturación. El precipitado se disolvió con 4.5 mL de acetato de amonio 0.1 M (pH 7.7), con 20 mM βmercaptoetanol, e incubó (2 h, 40 °C). La actividad de FAL (picokatales por gramo de peso seco, pkat g−1 PS) se determinó en la solución con 2 mL de extracto enzimático purificado y 0.6 mL de fenilalanina 100 mM. Actividad de la enzima polifenol oxidasa (PFO) Se cuantificó mediante la metodología de Jingwei y Paull (1997). A 0.2 g de polvo de acetona se agregaron 5 mL de solución extractora, se centrifugó la mezcla (10000 xg, 4 °C, 10 min). Se tomaron 80 µL de sobrenadante y se adicionaron 5 mL de catecol (60 mM); se tomó una lectura (490 nm), se incubó la mezcla en baño María (40 °C, 5 min) y se leyó la absorbancia. Los valores se reportan como el incremento en absorbancia en 0.01 unidades por minuto en peso seco (∆A490nm .min−1 g−1 PS). Diseño experimental y análisis estadístico Los datos de respiración y producción de etileno se graficaron en función del tiempo de muestreo, calculando la media y desviación estándar. Durante el periodo de evaluación se tomaron aleatoriamente cinco frutos diariamente (cada fruto se consideró una repetición) para su análisis. A los resultados para cada variable se les realizó un análisis de varianza (diseño completamente al azar), y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Se calcularon también coeficientes de correlación de Pearson entre variables.

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Activity of the enzyme phenylalanine amonialyase (PAL)

Activity of the enzyme polyphenol oxidase (PPO) This was quantified by means of the Jingwei and Paull methodology (1997). To 0.2 g of acetone powder, 5 mL of extracting solution were added, and the mixture was centrifuged (10000 xg, 4 °C, 10 min). Then, 80 µL of supernatant were taken and 5 mL of catechol (60 mM) were added; a reading was made (490 nm), the mixture was incubated in a double boiler (40 °C, 5 min) and the absorbancy was read. The values are reported as the increase in absorbance in 0.01 units per minute in dry weight (∆A490nm .min−1 g−1 PS). Experimental design and statistical analysis The data of respiration and ethylene production were graphed in function of the time of sampling, calculating the mean and standard deviation. During the evaluation period five fruits were taken each day randomly (each fruit was considered a replication) for analysis. The results for each variable were subjected to an analysis of variance (completely randomized design), and the means were compared with Tukey’s test (p≤0.05). Pearson’s correlation coefficient among variables were also calculated.

RESULTS AND DISCUSSION The ripening process of the fruits presented a climateric behavior marked by a high production of CO2 and ethylene, the climateric maximum occurring on d 6 (367.3 mL CO2 kg−1 h−1) and 5 d (480.7 µL C2H2 kg−1 h−1) after harvest (Figure 1); the fruits reached the organoleptic characteristics of consumption on the d 5. The climateric elevation of CO2 initiated 24 h after harvest, with a slight decrease at 72 h, until reaching the maximum on d 5. The high respiratory intensity presented during ripening allows this fruit to be classified as highly perishable (Kader, 1992). The production of

CAMBIOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS DE ZAPOTE NEGRO (Diospyros digyna Jacq.)

1000

600

500 CO2 Etileno

750

400

300

500

200 250 100

Producción de etileno (µL C2H4 kg −1 h −1)

El proceso de maduración de los frutos presentó un comportamiento climatérico marcado por una alta producción de CO2 y etileno, ocurriendo el máximo climatérico en el d 6 (367.3 mL CO2 kg−1 h−1) y 5 d (480.7 µL C2H2 kg−1 h−1), después de la cosecha (Figura 1); los frutos alcanzaron las características organolépticas de consumo en el 5 d. La elevación climatérica de CO2 se inició 24 h después de la cosecha, con una ligera disminución a las 72 h, hasta alcanzar el máximo en el d 5. La alta intensidad respiratoria presentada durante la maduración permite clasificarlo como un fruto altamente perecedero (Kader, 1992). La producción de etileno fue elevada en relación con la de otros frutos climatéricos del mismo género, como el persimonio, lo cual es importante con fines de compatibilidad de cargas durante el almacenamiento o transporte (Itamira et al., 2003). La evaluación de la actividad de ACC oxidasa, que cataliza la oxidación de 1-aminociclopropano 1carboxílico (ACC) a etileno en la última etapa de la biosíntesis de esta hormona, no presentó cambios significativos durante los primeros 3 d; sin embargo, al igual que el etileno, tuvo un incremento sustancial a partir del d 4, lo que confirma su participación en el metabolismo de dicha hormona y en la maduración de los frutos de zapote negro (Terai y Mizuno, 1985). Según Nakano et al. (2003a), cuando el fruto de persimonio está unido al árbol, mantiene la continuidad vascular para recibir agua que compensa las pérdidas por transpiración, por lo que, al desprenderlo del árbol, experimenta estrés hídrico que induce la producción de etileno. Esta fitohormona se produce inicialmente en el cáliz y posteriormente se difunde a otros tejidos provocando la autocatálisis de la misma, que lleva al desarrollo de la maduración. Lo anterior explica la relación entre producción de etileno y pérdidas de peso. La firmeza presentó una disminución paulatina desde 31.5 N, a la cosecha, hasta 3.8 N en el d 6 (Cuadro 1), coincidiendo este último con síntomas de senescencia. Los cambios significativos en firmeza ocurrieron a partir del d 3, coincidiendo con el inicio de la elevación climatérica de etileno, lo que sugiere esta hormona se encuentra involucrada con el proceso de ablandamiento del fruto; un comportamiento similar en persimonio ha sido reportado por Nakano et al (2003b). La actividad de la enzima pectinmetilestearasa (PME) tuvo una disminución significativa durante los primeros 4 d después de la cosecha, pero en el d 5 se incrementó significativamente coincidiendo con el pico en la producción de etileno (Cuadro 1). Asimismo, se encontró una correlación positiva entre la actividad de PME y producción de etileno (0.72) (Cuadro 3), sugiriendo que dicha enzima es activada por la hormona vegetal. Al respecto, Awad y

ethylene was high in relation to that of other climateric fruits of the same genus, such as the persimmon, which is important for purposes of cargo compatibility during storage or transport (Itamira et al., 2003). The evaluation of the activity of ACC oxidase, which catalyzes the oxidation of 1-aminocyclopropane 1-carboxylic (ACC) to ethylene in the last stage of the biosynthesis of this hormone, did not present significant changes during the first 3 d; however, as with ethylene, it had a substantial increase from d 4, which confirms its participation in the metabolism of this hormone and in the ripening of the black sapote fruits (Terai and Mizuno, 1985). According to Nakano et al. (2003a), when the persimmon fruit is attached to the tree, it maintains its vascular continuity for receiving water, which compensates the losses by transpiration, thus, when detached from the tree, the fruit undergoes hydric stress which induces the production of ethylene. This phytohormone is produced initially in the calyx and is later spread to other tissues, causing its autocatalysis, which leads to the development of ripening. This explains the relationship between ethylene production and weight losses. The firmness presented a gradual decrease from 31.5 N, at harvest, to 3.9 N on the d 6 (Table 1), the latter coinciding with symptoms of senescence. The significant changes in firmness occurred from d 3, coinciding with the start of the climateric elevation of ethylene, which suggests that this hormone is involved in the process of

Intensidad respiratoria (mL CO2 kg −1 h −1)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

0

0 0

1

2 3 4 5 Dias después de la cosecha

6

Figura 1. Intensidad respiratoria y producción de etileno durante la maduración de frutos de zapote negro a 25±2 °C. Medias±DE para n=5. Figure 1. Respiratory intensity and ethylene production during ripening of the fruits of black sapote at 25±2 °C. Means±SD for n=5.

ARELLANO-GÓMEZ et al.

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AGROCIENCIA, MARZO-ABRIL 2005

Cuadro 1. Cambios en las características físicas y bioquímicas del fruto de zapote negro (Diospyros digyna) durante el proceso de maduración a 25±2 °C. Table 1. Changes in the physical and biochemical characteristics of the black sapote fruit (Diospyros digyna) during the ripening process at 25±2 °C. Días después de cosecha Variables 1 Firmeza (N) Pérdida de peso (%) Carotenoides totales (mg 100g−1) Clorofila total (mg 100 g−1) Ác. ascórbico (mg 100 g−1) ACC oxidasa (µL C2H2 kg−1 h−1) Actividad de PME (mg metoxilo 100 g−1) Actividad de FAL (pkat 100g−1)

31.5 a 0f 13.06 b 0.891a 180.7 a 23.95 b 515.1 b 771.81a

2

3

30.6 a 1.74 e 13.70 b 0.388 b 159.5 b 24.74 b 489.5 bc 708.81 a

22.5 b 3.34 d 14.29 b 0.292 c 149.8 c 22.18 b 470.5 c 420.04 c

4 21.7 b 4.80 c 16.32 a 0.280 c 134.6 d 37.59 a 424.6 d 520.49 b

5 21.0 b 6.58 b 11.58 c 0.269 c 90.19 e 17.19 c 621.7 a 91.96 d

6 3.8 c 8.19 a 7.29 d 0.258 c 69.8 f 15.42 c 452.3 c 63.41e

a, b, c, d, e, f, Medias con letras diferentes en una misma hilera, son estadísticamente diferentes (p≤0.05).

Young (1979) mencionan que durante la maduración de algunos frutos la enzima PME puede presentar poca actividad por estar separada del sustrato o ser inhibida por ácidos fenólicos. En el presente estudio, la concentración de fenoles totales fue alto durante los primeros 3 d de almacenamiento (Cuadro 2), pudiendo esto explicar la baja actividad de PME inicial y su incremento durante el proceso de maduración, cuando el contenido de fenoles totales se redujo en poco más de 80%. El aumento de la actividad de PME en el d 5 y pérdida sustancial de firmeza en el d 6, puede estar relacionado con que PME actúa principalmente en la desesterificación de las pectinas para preparar el substrato para la hidrólisis efectuada por la enzima poligalacturonasas (PG) (Awad y Young 1979). La concentración de carotenoides totales presentó un incremento constante en su síntesis durante los primeros 4 d de maduración, desde 13.06 a 13.32 mg 100 g−1, para disminuir hasta 11.58 y 7.29 mg 100 g−1 en la madurez para consumo (d 5) y senescencia (d 6), (Cuadro 1). La oxidación es la principal causa de la degradación de los carotenoides (Fennema, 1985), ya sea por la presencia de oxígeno activo producido en los cloroplastos durante la fotosíntesis (Leshem, 1981) o por la acción de enzimas lipoxigenasas; dicha oxidación se reduce por la presencia de antioxidantes como el ácido ascórbico (Cuadro 1). Lo anterior explica la

softening of the fruit. A similar behavior in persimmon has been reported by Nakano et al. (2003b). The activity of the enzyme pectinmethylesterase (PME) had a significant decrease during the first 4 d after harvest, but on d 5 it increased significantly, coinciding with the peak in the production of ethylene (Table 1). Likewise, a positive correlation was found between the activity of PME and the production of ethylene (0.72) (Table 3), suggesting that this enzyme is activated by the plant hormone. To this respect, Awad and Young (1979) mention that during the ripening of some fruits the enzyme PME may present little activity due to being separated from the substrate or being inhibited by phenolic acids. In the present study, the concentration of total phenols was high during the first 3 d of storage (Table 2), which may explain the initial low activity of PME and its increase during the process of ripening, when the content of total phenols was reduced by a little over 80%. The increase in activity of PME on d 5 and substantial loss of firmness on d 6, could be related to the fact that PME acts mainly in the de-esterification of the pectins for preparing the substrate for the hydrolisis produced by the enzyme polygalacturonasas (PG) (Awad and Young, 1979). The concentration of total carotenoids presented a constant increase in its synthesis during the first 4 d of

Cuadro 2. Actividad de polifenoloxidasa (PFO) y contenido de fenoles totales en la pulpa de frutos de zapote negro durante su maduración a 25±2 °C. Table 2. Activity of polyphenoloxidase (PPO) and content of total phenols in the pulp of black sapote fruit during ripening at 25±2 °C. Días después de cosecha Variables 1 Polifenol oxidasa (A490 nm min−1) Fenoles totales (mg 100 g−1)

8.0 b 28.94 a

2 8.5 b 23.24 a

a, b, Medias con letras diferentes en una misma hilera, son diferentes (p≤0.05).

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VOLUMEN 39, NÚMERO 2

3 8.0 b 20.93 a

4 14.3 a 4.51 b

5 14.7 a 3.45 b

6 12.2 a 4.36 b

CAMBIOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS DE ZAPOTE NEGRO (Diospyros digyna Jacq.)

Cuadro 3. Correlaciones entre variables durante la maduración de frutos de zapote negro (Diospyros digynia) a 25±2 °C. Table 3. Correlations among variables during the ripening of black sapote fruit (Diospyros digyna) at 25±2 °C.

X1 X2 X3 X4

X1

X2

1.00

0.61 0.01 1.00

X3

X4

X5

X6

X7

X8

X9

X10

X11

0.11 0.54 0.72 0.02 −0.52 0.03 0.14 0.44 −0.18 0.32 −0.06 0.72 −0.10 0.58 1.00

0.54 0.02 0.82 <.00 0.12 0.49 −0.60 0.04 −0.13 0.47 −0.95 <.01 −0.45 0.01 0.15 0.42 1.00

−0.76

0.86 <.01 0.74 <.01 −0.37 0.03 −0.95 <.01 −0.59 0.01 −0.89 <.00 −0.91 <.01 0.03 0.83 0.74 <.01 −0.80 <.01 1.00

−0.61

−0.90

−0.87

−0.65

−0.85

0.01 −0.34 0.06 1.00

<.00 −0.54 0.01 0.41 0.02 1.00

<.01 −0.35 0.05 0.82 <.01 0.71 <.01 1.00

<.00 −0.81 <.00 0.01 0.95 0.76 <.00 0.26 0.16 1.00

<.00 −0.61 0.03 0.65 <.01 0.90 <.01 0.74 <.01 0.75 <.01 1.00

X5 X6 X7 X8 X9 X10

<.00 −0.39 0.03 0.37 0.04 0.86 <.01 0.62 0.02 0.60 0.04 0.80 <.01 0.10 0.27 −0.44 0.01 1.00

X11

X1 = producción de CO2 (mL CO2 kg−1 h−1); X2 = producción de etileno (µL C2H2 kg−1 h−1); X3 = actividad de ACC oxidasa (µL C2H2 kg−1 h−1); X4 = ácido ascórbico (mg 100g−1); X5 = carotenoides totales (mg 100g−1); X6 = contenido de fenoles totales (mg 100g−1); X7 = actividad de fenilalanina amonialiasa (FAL) (pkat 100 g−1); X8 = actividad de pectinmetilestearasa (PME) (mgmetoxilo 100 g−1); X9 = actividad de polifenoloxidasa (PFO) (A 490 nm min−1); X10 = firmeza (N); X11 = pérdida de peso (%).

pérdida gradual de carotenoides después del d 4 de maduración, cuando el fruto presenta una disminución significativa de ácido ascórbico. Se encontró una correlación positiva entre carotenoides totales y ácido ascórbico (0.71) (Cuadro 3). Además, el aumento en la respiración durante el climaterio provoca la síntesis de un gran número de enzimas, entre ellas lipoxigenasas, que conjuntamente con el oxígeno provocarían la degradación de los carotenoides (Seymour et al., 1993; Badui, 1990). La concentración de ácido ascórbico durante la maduración presentó una disminución progresiva desde 180 mg 100 g−1 en el d 1 hasta 69.8 mg.100 g−1 en el d 6, una pérdida aproximada de 62% con cambios significativos diarios (Cuadro 1). El ácido ascórbico es muy inestable y su degradación se da por oxidación en presencia de oxígeno o por acción de la enzima ácido ascórbico oxidasa, llegando a producir pigmentos oscuros (Badui, 1990; Bidwell, 1990). Este comportamiento permite suponer que la oxidación del ácido ascórbico presente en la pulpa de zapote negro pudiera ser uno de los factores que interviene en el oscurecimiento de la pulpa durante la maduración. La concentración de fenoles totales tuvo una disminución significativa y continua durante la maduración, con una pérdida aproximada de 80% desde madurez fisiológica hasta madurez para consumo (Cuadro 2). De acuerdo con Macheix et al. (1990), los compuestos

ripening, from 13.06 to 13.32 mg 100 g−1, decreasing to 11.58 and 7.29 mg 100g−1 at ripeness of consumption (d 5) and senescence (d 6) (Table 1). Oxidation is the principal cause of the degradation of the carotenoids (Fennema, 1985), either by the presence of active oxygen produced in the chloroplasts during photosynthesis (Leshem, 1981) or by the action of lipoxygenase enzymes; this oxidation is reduced by the presence of antioxidants such as ascorbic acid (Table 1). The above explains the gradual loss of carotenoids after d 4 of ripening, when the fruit presents a significant decrease in ascorbic acid. A positive correlation was found between total carotenoids and ascorbic acid (0.71) (Table 3). Besides, the increase in respiration during the climateric process provokes the synthesis of a great number of enzymes, including lipoxigenases, which along with the oxygen would provoke the degradation of the carotenoids (Seymour et al., 1993; Badui, 1990). The concentration of ascorbic acid during ripening presented a progressive decrease from 180 mg 100 g−1 on d 1 to 69.8 mg 100 g−1 on d 6, a loss of approximately 62% with significant daily changes (Table 1). The ascorbic acid is very unstable and its degradation occurs by oxidation in the presence of oxygen or by action of the enzyme ascorbic acid oxidase, producing dark pigments (Badui, 1990; Bidwell, 1990). This behavior makes it possible to assume that the oxidation of the ascorbic acid present in the pulp of the black sapote could be one of the

ARELLANO-GÓMEZ et al.

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AGROCIENCIA, MARZO-ABRIL 2005

fenólicos constituyen sustratos susceptibles de ser oxidados por enzimas como polifenol oxidasa y peroxidasas. La mayoría de los compuestos monofenólicos, como los ácidos fenólicos y fenilpropanoides, son intermediarios y derivados de las rutas metabólicas fenilpropanoide y shikimato. La conversión de L-fenilalanina a ácido trans-cinámico es el paso inicial de la ruta biosintética de fenilpropanoides, reacción es catalizada por fenilalanina amonialiasa (FAL), una enzima reguladora de la síntesis de fenoles (Salisbury y Ross, 1996). La actividad de FAL (Cuadro 1) fue mayor durante los primeros 4 d de la maduración, disminuyendo de manera significativa hasta 9% del valor inicial en la madurez para consumo (d 5); esto indica que la enzima permanece activa durante las últimas etapas del crecimiento del fruto e inicios de la maduración favoreciendo la biosíntesis de compuestos fenólicos. Se encontró una correlación positiva (0.75) entre la actividad de esta enzima y la concentración de fenoles totales (Cuadro 3). Muchas frutas poseen un sistema enzimático capaz de utilizar como sustrato a los compuestos fenólicos, dentro del cual se encuentra la enzima polifenoloxidasa (PP0) relacionada con los procesos de oscurecimiento de la pulpa (Radi et al., 1997). La actividad de esta enzima (Cuadro 2) se incrementó significativamente durante la maduración, coincidiendo con la disminución en la concentración de fenoles totales; esto sugiere que los compuestos son utilizados como sustrato por dicha enzima para formar quinonas, y la actividad disminuyó cuando las concentraciones del sustrato fueron bajas, lo cual se corrobora con la alta correlación negativa (−0.96) entre estas variables (Cuadro 3). PFO es una enzima soluble en el citosol y ligada a membranas, por lo que al evolucionar la maduración o senescencia el cambio de permeabilidad de membranas, debida a la acción de etileno (Yang, 1985), podría favorecer la interacción de esta enzima con los compuestos fenólicos y, por tanto, su oxidación; esto explicaría la correlación negativa (−0.82) entre PFO y este gas (Cuadro 3). El incremento en la actividad de PFO sugiere que el característico color cafe-rojizo de la pulpa del zapote negro maduro, se debe a un proceso de oxidación de compuestos fenólicos.

CONCLUSIONES Se concluye que el proceso de maduración de los frutos de zapote negro sigue un comportamiento típicamente climatérico, donde el máximo respiratorio antecede al pico de producción de etileno. Durante este proceso, el etileno favorece el ablandamiento del fruto y regula la actividad de las enzimas PME y PFO. La actividad de PFO influye en el obscurecimiento de la pulpa, coincidiendo con la disminución del ácido

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VOLUMEN 39, NÚMERO 2

factors that intervene in the darkening of the pulp during ripening. The concentration of total phenols had a significant and continuous decrease during ripening, with an approximate loss of 80% from physiological maturity to ripeness for consumption (Table 2). According to Macheix et al. (1990), the phenolic compounds form substrates susceptible of being oxidized by enzymes such as polyphenol oxidase and peroxidases. The majority of the monophenolic compounds, such as the phenolic acids and phenylpropanoids, are intermediaries and derived from the metabolic routes phenylpropanoid and shikimato. The conversion of Lphenylalanine to trans-cynamic acid is the initial step of the biosynthetic route of phenylpropenoids, whose reaction is catalyzed by phenylalanine amonialiase (PAL), a regulating enzyme of the synthesis of phenols (Salisbury and Ross, 1996). The activity of PAL (Table 1) was greater during the first 4 d of ripening, decreasing significantly to 9% of the initial value at ripeness for consumption (d 5); this indicates that the enzyme remains active during the last stages of growth of the fruit and the start of ripening, favoring the biosynthesis of phenolic compounds. A positive correlation was found (0.75) between the activity of this enzyme and the concentration of total phenols (Table 3). Many fruits have an enzymatic system capable of utilizing the phenolic compounds as substrate, within which is found the enzyme polyphenoloxidase (PPO) related to the darkening processes of the pulp (Radi et al., 1997). The activity of this enzyme (Table 2) increased significantly during ripening, coinciding with the decrease in the concentration of total phenols; this suggests that the compounds are utilized as substrate by this enzyme in forming quinones, and the activity decreased when the concentrations of the substrate were low, which is corroborated by the high negative correlation (−0.96) between these variables (Table 3). PPO is an enzyme which is soluble in cytasol and linked to membranes, thus as the processes of ripening or senescence evolve, the change of permeability of membranes, due to the action of ethylene (Yang, 1985), might favor the interaction of this enzyme with the phenolic compounds, and therefore, their oxidation; this would explain the negative correlation (−0.82) between PPO and this gas (Table 3). The increase in the activity of PPO suggests that the characteristic reddish brown color of the pulp of the mature black sapote, is due to a process of oxidation of phenolic compounds.

CONCLUSIONS It is concluded that the ripening process of the fruits of the black sapote has a tipically climateric behavior,

CAMBIOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS DE ZAPOTE NEGRO (Diospyros digyna Jacq.)

ascórbico, sugiriendo un proceso de oxidación como causa de los cambios en color de la pulpa, así como de la pérdida del valor nutricional. El fruto de zapote negro genera grandes cantidades de bióxido de carbono y etileno, lo cual se debe considerar con fines de compatibilidad durante el almacenamiento y transporte.

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where the maximum of respiration precedes the production peak of ethylene. During this process, the ethylene favors the softening of the fruit and regulates the activity of the enzymes PME and PPO. The activity of PPO influences the darkening of the pulp, coinciding with the decrease in ascorbic acid, which suggests an oxidation process as the cause of the changes in the color of the pulp, as well as of the loss in nutritional value. The fruit of the black sapote generates large amounts of carbon bioxide and ethylene, which should be considered for purposes of compatibility during storage and transport. —End of the English version—




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