Luan Van Thac Si

MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ

Rau xanh là nguồn cung cấp dinh dưỡng quan trọng cho cơ thể con người Tuy nhiên, hiện nay rau xanh đang đứng trước tình trạng bị nhiều loài côn trùng phá hoại, gây khó khăn cho công tác phòng trừ dịch bệnh trong đó có loài ruồi đục lá Lyriomyza sativae Blanchard. Hiện tượng côn trùng kháng thuốc được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1887 (Dẫn theo Babos. Patts; 1951). Kể từ đó cho tới nay có nhiều loài kháng thuốc ngày càng tăng và việc phòng trừ chúng gặp rất nhiều hết sức khó khăn. Về phương diện sinh học, tính kháng thuốc trừ sâu là một hiện tượng tiến hóa sinh học ở mức độ quần thể có liên quan mật thiết tới các gen trong cơ thể chống thuốc, khi sinh vật tiếp xúc liên tục và lâu dài với thuốc bảo vệ thực vật sẽ xảy ra quá trình chọn lọc. Các cá thể mang gen kháng thuốc sẽ được chọn lọc và dẫn đến sức đề kháng tăng qua các thế hệ dưới áp lực chọn lọc của thuốc trừ sâu. Trước khi tiếp xúc trực tiếp với thuốc trừ sâu tần số alen kháng thuốc trong QT thường là thấp, sau nhiều thế hệ tiếp xúc với thuốc làm cho tần số alen kháng thuốc trong QT tăng lên. Tính kháng thuốc của dịch hại lúc đầu là tăng từ từ, sau đó nhanh dần lên và cuối cùng tạo quần thể kháng mạnh. Sử dụng thuốc hóa học là phương pháp cơ bản và có hiệu lực cao trong việc phòng trừ sâu hại nói chung và ruồi đục lá Lyriomyza sativae Blanchard nói riêng. Tuy nhiên, tình trạng lạm dụng quá mức các loại thuốc hóa học như: sử dụng với cường độ và liều lượng quá cao, không đúng thời điểm, tần suất phun..., đã làm tăng tính kháng thuốc ở sâu hại gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như: Làm giảm năng suất và chất lượng của nông sản, ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, để lại lượng lớn dư lượng thuốc

1

trừ sâu trong nông sản gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm, làm ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, gây tâm lý bất an cho cộng đồng. Để góp phần vào việc phòng trừ ruồi đục lá hại rau đậu có hiệu quả và làm cơ sở cho việc đề xuất một quy trình sử dụng hợp lý thuốc trừ sâu, ngăn chặn sự gia tăng khả năng kháng thuốc của sâu hại và đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, cần phải đẩy mạnh nghiên cứu tính kháng thuốc của sâu hại và đưa ra được các phương pháp phòng trừ tối ưu có hiệu quả nhằm mang lại lợi ích cho con người mà vẫn đảm bảo sự cân bằng sinh thái ở mức cao nhất có thể. Xuất phát từ những vấn đề thực tế nêu trên chúng tôi đã lựa chọn tiến hành thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU TÍNH MẪN CẢM VỚI MỘT SỐ TTS CỦA ẤU TRÙNG RUỒI ĐỤC LÁ Liriomyza sativae Blanchard Ở BA QUẦN THỂ SONG PHƯƠNG HÀ NỘI, AN BÌNH VÀ ĐÌNH TỔ BẮC NINH”

Mục đích nghiên cứu của đề tài: Nhằm đánh giá độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá ở 3 quần thể tự nhiên với 5 loại TTS, từ đó có cơ sở đưa ra những phương pháp sử dụng TTS hợp lí giúp người nông dân phòng trừ hiệu quả được các loại sâu hại. Nội dung nghiên cứu của đề tài 1- Điều tra tình hình sử dụng thuốc trừ sâu trên rau, đậu của các hộ nông dân tại các địa điểm nghiên cứu. 2- Xác định độ mẫn cảm với 5 loại thuốc thuộc các nhóm khác nhau của ấu trùng ruồi đục lá tuổi 1 tại 3 quần thể: Song Phương- Hà Nội, An Bình và Đình Tổ- Bắc Ninh. 3- Tạo dòng kháng với thuốc Sherpa 25EC của QT ruồi đục lá ở Song Phương Những đóng góp mới của luận văn này: -Đánh giá độ mẫn cảm với một số loại TTS thông dụng của ấu trùng ruồi đục lá ở những quần thể tự nhiên tại những địa điểm nghiên cứu làm cơ sở cho biên pháp sử dụng TTS hợp lý - Cung cấp thêm tư liệu về quá trình tạo dòng kháng, từ đó có thể giải thích

2

được sự hình thành một số quần thể sâu hại kháng TTS trong tự nhiên. Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1. MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN

I.1.1. Tính kháng (resistance) Tính kháng thuốc trừ sâu là sự thay đổi tính mẫn cảm có khả năng di truyền của một quần thể sâu hại nó được phản ánh trong sự thất bại nhiều lần của một sản phẩm, mà đáng nhẽ đạt được mức phòng trừ mong đợi khi sử dụng theo khuyến cáo trên nhãn cho loài sâu hại đó (IRAC). Hay tính kháng thuốc là sự giảm sút tính mẫn cảm của quần thể sinh vật với một loại thuốc trừ dịch hại sau một thời gian dài quần thể này liên tục tiếp xúc với thuốc đó, khiến cho những loài này chịu được lượng thuốc lớn có thể tiêu diệt được hầu hết các cá thể cùng loài chưa chống thuốc. Khả năng này được di truyền qua đời sau, dù cá thể đời sau có hay không tiếp xúc với thuốc (Who,1976). Điều này phân biệt hẳn với hiện tượng quen thuốc của sâu bệnh vì tính quen thuốc không di truyền cho thế hệ sau [10] I.1.2. Tính kháng chéo (Cross Resistance) Tính kháng chéo là hiện tượng khi một nòi sâu bệnh hay côn trùng nào đó không những kháng với các hợp chất thuốc được sử dụng liên tục qua nhiều thế hệ mà còn kháng được một hay nhiều hợp chất khác mà dòng kháng đó chưa hề tiếp xúc[8]. Hiện tượng kháng chéo xảy ra khi các hợp chất được sử dụng liên tục và các hợp chất chưa từng được sử dụng ở QT có cùng cơ chế kháng. I.1.3.Tính đa kháng (Multiple resistance) Tính đa kháng là hiện tượng một nòi sâu bệnh hay côn trùng nào đó tăng khả năng chịu đựng với nhiều loại thuốc trừ sâu. Hiện tượng đa kháng

3

xảy ra là do nhiều cơ chế kháng khác nhau cùng tồn tại và hoạt động trong nòi kháng, tạo ra phổ kháng tương đối rộng cho từng nòi sâu hại. Nòi đa kháng được hình thành khi có phổ kháng với nhiều nhóm thuốc trừ sâu riêng biệt sử dụng đồng thời hay liên tiếp trong một thời gian dài ở địa phương (8). * Để đánh giá mức độ kháng thuốc của sâu hại dựa vào chỉ số kháng thuốc (Ri* -Resistance index): Theo FAO: Ri* =

LD 50 (hayLC 50 ) cñadßngnghi lµ kh¸ng LD 50 ((hayLC 50 ) cñadßngmÉn

với Ri* >10 thì dòng đó kháng thuốc với Ri* <10 dòng đó chỉ chịu đựng với thuốc - Khi nghiên cứu tính kháng TTS của sâu tơ, do Việt Nam chưa có QT mẫn cảm để làm QT so sánh, vì vậy hai tác giả Tào Minh Tuấn và Đặng Hữu Lanh đã sử dụng chỉ số kháng Ri* * bằng cách so sánh giá trị LC95 và LKC (Ri* * =

LC 95 LKC

), các tác giả cho rằng khi Ri* * >50 thì QT sâu hại nghiên

cứu mới có thể được coi là đã kháng với loại thuốc trừ sâu đó[7]. I.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG TTS Ở CÔN TRÙNG VÀ RUỒI ĐỤC LÁ.

I.2.1. Trên thế giới Tính kháng thuốc của sâu hại là hiện tượng phổ biến ở nhiều loài sinh vật, nhưng xuất hiện nhiều nhất là ở côn trùng và nhện. Hiện tượng kháng thuốc của côn trùng phát hiện đầu tiên vào năm 1887 (Babos và Patts, 1951). Kể từ đó đến nay số loài kháng thuốc ngày càng tăng. Ban đầu hiện tượng kháng thuốc được phát hiện ở nhiều loài côn trùng và nhện và mới chỉ chống với một số thuốc Clo, lân hữu cơ, Carbamat, thì nay nhiều nhóm thuốc mới như Pyrethroid, các chất điều hòa sinh trưởng côn trùng, các thuốc trừ sâu vi sinh vật cũng bị chống. Theo thống kê của FAO: đến năm 1970 đã có 224 loài côn trùng hình

4

thành tính kháng thuốc. Đến năm 1980, con số đó đã tăng lên 428 loài và đến cuối năm 1989 tổng số loài chân khớp kháng thuốc là 504 loài trong đó 481 loài gây hại kháng thuốc thì có đến 283 loài gây hại trong nông nghiệp (chiếm khoảng 58,8%) và 198 loài (chiếm khoảng 41,2%) gây hại cho người và động vật [12]. Như vậy chỉ trong khoảng mười năm, số loài chân khớp kháng thuốc đã tăng đáng kể (gần gấp đôi). Trong tổng số các loài chân khớp kháng thuốc, phần lớn thuộc bộ hai cánh (Diptera) với 177 loài chiếm khoảng 35,1%, sau đó là Lepidoptera (74 loài, chiếm tỉ lệ 14,7%); Cleoptera (72 loài, chiếm 14,3%); Acarina (71 loài, chiếm tỉ lệ 14,1%).... Số lượng này phần nào phản ánh áp lực chọn lọc của TTS hóa học đã được người nông dân sử dụng để diệt côn trùng gây hại [27] Tính đến nay các nghiên cứu về tính kháng trên đối tượng ruồi đục lá với các thuốc trừ sâu chưa nhiều, mặc dù hiện tượng kháng thuốc trừ sâu của ruồi đục lá đã được đề cập cách đây đã khá lâu. Năm 1980, Sharma và cộng sự đã đưa ra báo cáo đối với loài L.sativae đã trở nên khó phòng trừ ở California vì chúng đã rất kháng với một số loại TTS[27] Hiện tượng kháng cao với một số nhóm thuốc trừ sâu Pyrethroid như Permethrin và Fenvarelate của nhiều quần thể ruồi L.sativae và L.triforli cũng đã được Manson và cộng sự (1987)[23] ghi nhận trên nhiều loài cây trồng ở Hawai. Tác giả cũng chỉ ra rằng các quần thể của loài L.sativae và L.triforli đã chống với với TTS từ trước khi hai loại thuốc Pyrithroid được dùng phổ biến ở Mỹ. Như vậy Pyrithroid chỉ là nguyên nhân phụ hình thành tính kháng ở hai loài ruồi này, mà nguyên nhân chính có thể từ sức ép trực tiếp của loại thuốc nhóm Clo hữu cơ được sử dụng rộng rãi ở địa phương từ nhiều năm trước, vì DDT có thể gây nên tính kháng chéo ở các loài ruồi này với nhóm thuốc Pyrithroid. Đứng trước tình trạng tính kháng TTS của côn trùng ngày càng tăng, tổ chức FAO và WHO năm 1963 đã thành lập các nhóm chuyên gia trên thế

5

giới chuyên nghiên cứu về vấn đề kháng thuốc của côn trùng để tìm ra biện pháp khắc phục. I.2.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về tính kháng TTS trên sâu hại chưa nhiều, cho đến thời điểm này thì đã có một số công trình nghiên cứu trên các đối tượng như: sâu tơ, rầy nâu, bọ phấn và ruồi đục lá.... Trên đối tượng sâu tơ, năm 1967 các chuyên gia của FAO đã nhận định: Sâu tơ ở Việt Nam đã kháng cao với các TTS OP và Car như Dianizon, Malathion, Methomyl và Carbaryl [15]. Ở Quần thể Song Phương, theo tác giả Đặng Thị Thanh Mai (2002) đã kết luận rằng sâu tơ ở quần thể này đã kháng cao với loại thuốc Sherpar 25EC [5]. Nghiên cứu tính kháng TTS của bọ phấn ở cả hai địa điểm Vân Nội và Song Phương tác giả Nguyễn Đình Thông (2006) đã kết luận: Ấu trùng bọ phấn ở hai quần thể trên còn mẫn cảm với thuốc Padan 95SP, Selecron 500EC và giảm tính mẫn cảm với thuốc trừ sâu Sherpar 25EC [9]. Trên đối tượng ruồi đục lá, một số công trình nghiên cứu như của TS Lê thị Kim Oanh, Nguyễn Thị Ngọc, Trần Phan Hữu cho rằng ruồi đục lá là đối tượng sâu hại nghiêm trọng thuộc khu vực đồng bằng Sông Hồng. Đây là loài sâu hại đa thực có phổ ký chủ rộng gây hại trên hầu hết trên các loại rau xanh và cây trồng màu. Theo Lê Thị Kim Oanh (2003) thì ruồi đục lá tại Song Phương- Hà Tây nay thuộc Hà Nội và Vân Nội- Đông Anh- Hà Nội ở thời điểm nghiên cứu năm 2002 đã thể hiện tính kháng đối với thuốc có hoạt chất cypermethrin tuy nhiên chưa thấy loài sâu hại này kháng với thuốc Abamectin, spinosad và Cyromazine. Do chưa có dòng mẫn cảm chuẩn tác giả đã dựa vào chỉ số kháng Ri* qua việc so sánh giữa tỉ lệ LC 50 của quần thể tự nhiên với LC 50 của quần thể được cho là dòng mẫn cảm nhất với mỗi thuốc trừ sâu. Cũng qua báo cáo

6

này tác giả cho thấy chỉ số kháng trong một năm ở các thời điểm khác nhau là khác nhau. Tác giả cũng tính chỉ số kháng Ri* * để đánh giá mức độ kháng của các QT nghiên cứu. Với hai cách tính như trên thì tác giả Lê Thị Kim Oanh đã kết luận hai quần thể ruồi đục lá ở Song Phương và Vân Nội đã kháng với thuốc có hoạt chất Cypermethrin. Theo Nguyễn Thị Ngọc (2002) cùng thời gian và địa điểm nghiên cứu cũng có nhận xét tương tự. Tuy nhiên ruồi đục lá ở những địa điểm nghiên cứu vẫn còn mẫn cảm cao với các loại thuốc Trigard 75WP, vertimec 1.8 EC, Padan 95 SP và Selecron 500 EC. Theo Trần Phan Hữu (2004) ấu trùng ruồi đục lá quần thể Vân Nội – Đông Anh và quần thể Song Phương Hà Tây nay thuộc Hà Nội cũng dùng phương pháp như trên khảo nghiệm với 4 loại thuốc và cũng dựa vào cách tính chỉ số kháng Ri* , Ri* * với liều khuyến cáo, tác giả đã rút ra nhận xét ở các quần thể nghiên cứu vẫn còn mẫn cảm với 4 loại thuốc nghiên cứu là vertimex 1.8EC; Confidor 100SL Success 25EC và Sherpar 25EC. Đối với quần thể Song Phương mẫn cảm với 3 loại thuốc, nhưng độ mẫn cảm đã giảm sút đáng kể đối với Sherpar 25EC (Cypermethrin) Và tác giả Mai Thị Thuỷ (2006) cũng nghiên cứu về tính kháng ở 3 quần thể ruồi đục lá Song Phương, Vân Nội và Hải Phòng cũng đã đưa ra kết luận là đối với quần thể Song Phương đã thể hiện tính kháng với thuốc trừ sâu Sherpar 25EC. I.3. NHỮNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC TÍNH KHÁNG TTS Ở CÔN TRÙNG

Hiện nay đã có nhiều tài liệu bàn luận về sự di truyền tính kháng với mỗi loại thuốc trừ sâu. Trong đó có một số nghiên cứu di truyền tính kháng trên sâu tơ và một số đối tượng khác đối với TTS sinh học BT, TTS phethoate và

7

fenvalare của một số tác giả trên thế giới sẽ được chúng tôi tham khảo. 1.3.1. Nghiên cứu di truyền tính kháng với nhóm TTS Bacillus thuringiens [34]. Di truyền tính kháng TTS sinh học Bacillus thuringiens đã được Tabashnik; Hama và một số ctv bắt đầu nghiên cứu trên đối tượng sâu tơ từ năm 1992 đến năm 1995 Dòng kháng với BT kí hiệu là BS;dòng mẫn cảm kí hiệu là S. Để tiến hành nghiên cứu Tabashnik và Hama đã sử dụng dòng mẫn cảm S đã nuôi trong phòng thí nghiệm từ năm 1980 với trên 200 thế hệ, cách ly hoàn toàn với TTS do công ty hoá chất công nghiệp Hokko cung cấp, và dòng kháng BS đã được chọn lọc trong năm 1994 ở Bang Bua Thong tại Thái Lan và duy trì 17 thế hệ trong phòng thí nghiệm không có áp lực chọn lọc của BT, cũng do Công Ty hoá chất công nghiệp Hokko cung cấp, ấu 0

trùng được nuôi trong phòng thí nghiệp ở tại nhiệt độ 25±2 C (theo phương pháp của Koshihara và Yamada,1976). Trong 17 thế hệ đã được duy trì thì Tabashnik cho rằng tính kháng của sâu tơ vẫn không thay đổi và các tác giả đã tiến hành cho lai thuận nghịch giữa 2 dòng mẫn và kháng với nhau nhằm tạo ra con lai. Sau đó tiến hành thử thuốc để thu thập số liệu và xử lý số liệu bằng probit trên máy tính tác giả thu được: + LC50 của con lai F1 giữa dòng mẫn và dòng kháng của các phép lai thuận là 6,03 (4,04-9,01) và của phép lai nghịch là 7,02 (4,75-10,9), như vậy ta thấy là có sự gối lợp giá trị 95% của LC50 tức về mặt xác suất thống kê là không khác nhau về ý nghĩa. Như vậy, giá trị giống nhau giữa LC50 của con lai thuận nghịch F1 cho biết cơ sở di truyền tính kháng BT là dược kiểm soát bởi gen nằm trên NST thường. + LC50 của con lai nằm ở khoảng giữa bố và mẹ -Nếu tính kháng BT trong QT BS được điều khiển bởi một nhân tố di 8

truyền trên NST thường (chỉ có một alen kháng và một alen mẫn) thì quần thể S là SS, quần thể BS là RR, thế hệ F1 là RS. Và khi cho lai trở lại với dòng kháng BS thì con lai F2 là 50% RR và 50% RS. Như vậy: Tính kháng TTS BT của sâu tơ được kiểm soát bởi alen lặn không hoàn toàn nằm trên NST thường. Tuy nhiên trong những thí nghiệm khác, Sim và Stone (1991) báo cáo sự chọn lọc tính kháng trong phòng thí nghiệm của sâu đục chồi thuốc lá, Helicoverpa virescens, (với 130-kDa delta-nội độc tố) của BT là di truyền trên NST thường, trội không hoàn toàn và được điều khiển bởi 1 vài locus. Trong thí nghệm với loài P.interpunctella, cho biết tính kháng là không ổn định khi chọn lọc không liên tục và được di truyền như tính trạng lặn (McGaughey,1985). I.3.2. Nghiên cứu tính kháng với thuốc Phethoate và Fenvalare trên sâu tơ [33] + Đối với Phethoate: - Chọn lọc tiếp tục những dòng kháng phethoate (OKR-R v à OSSR)từ kết quả của 12 thế hệ đã làm mức kháng tăng lên, sau một thời gian chọn lọc giá trị LC50 đối với phenthoate (48,00 và 44.800µg) tăng hơn so với báo cáo trước đây (16.200 và 13.600µg)[33]. - chọn lọc tiếp tục của những dòng mẫn cảm phenthoate (OKR-S và OSS-S) ba thế hệ không làm tăng tính mẫn cảm phenthoate. Tính kháng phenthoate ở con lai F1 của phép lai thuận nghịch OKRR×OKR-S nằm ở khoảng giữa bố mẹ (D của LD50 và của LD95 bằng 0,15;0,15 và 0,47;0,55), giá trị D được so sánh giữa hai phép lai là nhỏ. Tương tự tính kháng của con lai F1 ở phép lai thuận nghịch (OSSR×OSS-S) nằm ở khoảng giữa bố mẹ (D của LC50 và của LC95 bằng 0,15;0,11;0,50 và 0,32), sự khác nhau giữa giá trị D của hai phép lai thuận nghịch này là nhỏ.

9

Những kết quả nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng sự di truyền tính kháng phenthoate ở sâu tơ đã được tri phối bởi nhiều gen trội không hoàn toàn nằm trên nhiễm sắc thể thường . * Đối với TTS Fenvalerate: - Cũng bắt đầu tiến hành chọn dòng kháng, dòng mẫn rồi sau đó cho lai thuận nghịch giữa hai dòng, xác nhận tính kháng của con lai thông qua LC50 và giá trị D. Tính kháng của con lai F1 tạo ra từ phép lai thuận và phép lai nghịch giữa hai dòng OKR-FR (dòng kháng với OKR-S (dòng mẫn cảm) nằm ở khoảng giữa bố mẹ (D của phép lai thuận nghịch bằng -0,50 và -0,53). Tương tự tính kháng của thế hệ F1 tạo ra từ phép lai thuận và phép lai nghịch (KAR-FR×KAR) đối với Fenvalerate cũng nằm trong khoảng giữa bố mẹ (D của LC50 thuận nghịch bằng -0,53 và -0,44). Giá trị D cho thấy sự giống nhau giữa các phép lai thuận và lai nghịch là có ý nghĩa về mặt thống kê. Vậy ở đây không có sự di truyền liên kết với giới tính đối với di truyền tính kháng. Những kết quả nghiên cứu con lai thuận và lai nghịch là cơ sở để rút ra kết luận là: tính kháng Fenvalerate ở sâu tơ có thể là do nhiều gen. Liu (1981) và Hama (1989) cũng đã có báo cáo tính kháng Fenvalerate được di truyền qua những gen lặn không có hiên tượng di truyền liên kết với giới tính. Tóm lại từ những kết quả nghiên cứu trên của một số tác giả trên thế giới chúng ta thấy tính kháng thuốc trừ sâu ở côn trùng là do gen trội hoặc gen lặn không hoàn toàn không liên kết với giới tính tác động.Nếu tính kháng được kiểm soát bởi 1 gen (chỉ có một alen kháng và một alen mẫn) thì dòng kháng có kiểu gen RR, dòng mẫn có kiểu gen SS nên thế hệ con lai giữa dòng kháng và dòng mẫn sẽ có kiểu gen RS. Nếu thể dị hợp mang đặc điểm giống bố hoặc mẹ hơn thì ta có thể kết luận rằng tính kháng được mô tả như là tính trạng trội tính mẫn cảm là tính trạng lặn hoặc ngược lại.Tuy nhiên kết luận trên không chính xác tuyệt đối vì có nhiều tác giả nghiên

10

cứu đã chỉ ra rằng tính kháng TTS hiếm khi là do alen trội hoặc lặn hoàn toàn chi phối. “Tính trội không hoàn toàn” thường ám chỉ tới tính trội không đầy đủ, tương tự “tính lặn không hoàn toàn” thường ám chỉ tới tính lặn không đầy đủ. “Tính đồng trội” là chỉ mức cùng biểu hiện của bố và mẹ, tính trội không hoàn toàn là chỉ mức độ trung gian giữa trội và lặn ở con lai F1. I.3.3.Một số kết quả nghiên cứu khác. Có rất nhiều tài liệu cho rằng mức độ kháng thuốc của sinh vật là kết quả của sự tương tác giữa các gen không alen (gen thuộc các locus khác nhau), sự tương tác này gọi là tính kháng đa gen. Các mô hình học thuyết Darwin mới (moore;1984) cho rằng sự xuất hiện tính kháng là kết quả của sự tích luỹ nhiều đột biến, mỗi đột biến đóng góp một hiệu quả nhỏ đối với tổng số.Nếu như vậy tính kháng TTS sẽ do đa gen có tác động cộng gộp. Whiten và Mc.kenzic,1980 lại đưa ra báo cáo trong các quần thể sinh vật đồng ruộng tính kháng hầu như do một gen chính đơn. Tuy nhiên nhiều trường hợp tính kháng đa gen được biết rất rõ (Crow,1954;King,1954;Liu,1982; Wood và Bishop,1981). Với đối tượng ruồi đục lá bước đầu tác giả Mai Thị Thuỷ (2006)bằng phương pháp nghiên cứu tương tự như trên cũng khẳng định là sự di truyền tính kháng với hoạt chất Cypermethrin của ấu trùng ruồi đục lá là do gen lặn không hoàn toàn nằm trên NST thường quy định. I.4. Sù tiÕn ho¸

tÝnh kh¸ng TTS cña c«n trïng vµ

s©u h¹i

Hiện tượng kháng TTS bắt nguồn từ những sai khác tự nhiên, thuộc về bản chất di truyền trong độ mẫn cảm đối với các chất độc của các cá thể trong quần thể, chứ không phải sự phát sinh phát triển tính kháng thuốc của

11

côn trùng là một quá trình thích ứng sinh lý của cá thể. Sự khác biệt di truyền về tính kháng TTS là đã có sẵn trong quần thể tự nhiên từ khi quần thể chưa tiếp xúc với thuốc trừ sâu. Khi một quần thể dịch hại chịu tác động lâu dài với một loại TTS thì sẽ xảy ra hiện tượng chọn lọc. Những cá thể mang gen kháng thuốc sẽ tồn tại, sinh ra thế hệ sau mang tính kháng thuốc. Quá trình chọn lọc này về bản chất là làm thay đổi tần số gen trong quần thể. Khi chưa tiếp xúc với thuốc, tần số của gen kháng thuốc trong quần thể tự nhiên thường rất thấp do chúng chưa gặp điều kiện thuận lợi để phát triển. Khi quần thể côn trùng tiếp xúc với thuốc thường xuyên, trong các thế hệ nối tiếp sẽ có những biến đổi trong quần thể, tỷ lệ kiểu gen kháng thuốc tăng dần, ở những thế hệ đầu phần lớn các kiểu gen kháng thuốc ở trạng thái dị hợp, qua nhiều thế hệ kiểu gen kháng thuốc ở trạng thái đồng hợp ngày một tăng. Ở những thế hệ đầu, sự biến đổi này xảy ra chậm chạp, từ từ. Theo tính toán của Sawiski (1979), trong quần thể tự nhiên, tỉ lệ các cá −4

thể mang gen kháng thuốc là 10 , nếu cho tiếp xúc liên tục với thuốc trừ sâu qua 15 thế hệ, tỉ lệ này tăng tới 1/30. tiếp tục cho tiếp xúc thêm 7 thế hệ nữa tỉ lệ này là 1/1. Điều này góp phần giải thích một hiện tượng mang tính quy luật thường xảy ra với những vùng dùng nhiều TTS hoá học là: Thời gian đầu dùng thuốc có hiệu lực rõ rệt, nhưng chỉ sau một thời gian sử dụng, thuốc sẽ có tác dụng thấp và dần dần mất tác dụng. Như vậy hiện tượng kháng thuốc không phải là một quá trình thích nghi sinh lý của cá thể trong quần thể. Hiện tượng này bắt nguồn từ sự sai khác tự nhiên có bản chất di truyền về độ mẫn cảm với các chất độc giữa các cá thể trong quần thể (ngay từ khi QT này chưa tiếp xúc với bất kì chất độc nào). Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ của quá trình tiến hoá tính

12

kháng TTS của côn trùng được thể hiện qua bảng I.1.

Bảng I.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ của quá trình tiến hoá tính kháng TTS trên đồng ruộng. Theo Geoghiou và Taylor (1976) 1.Di truyền 1.1 Tần số alen kháng 1.2.Số lượng các alen kháng 1.3.Tính trội của alen kháng 1.4.Mức ngoại hiện, độ biểu hiện, tác dụng tương hỗ của các alen kháng 1.5.Sự lựa chọn trước đó bởi các hoá chất 1.6.Phạm vi phối hợp của hệ gen kháng với các yếu tố thích nghi 2.Sinh học và sinh thái học. 2.1.Sinh học 2.1.1.Vòng đời 2.1.2.Con cháu mỗi thế hệ 2.1.3.Tính đơn giao/tính tạp giao,sự sinh sản. 2.2.Tập tính/sinh thái học 2.2.1.Sự cách ly, di chuyển, sự di cư 2.2.2.Tính đơn thực/tính đa thực 2.2.3.Sự sống sót ngẫu nhiên, vùng trú ẩn. 3.Tác động của TTS 3.1.Hoá chất 3.1.1.Bản chất hoá học của TTS 3.1.2.Mối quan hệ với các hoá chất sử dụng trước đó 3.1.3.Thời gian tồn tại của dư lượng, công thức áp dụng. 3.2. Áp dụng. 3.2.1.Ngưỡng áp dụng 3.2.2.Ngưỡng chọn lọc

13

3.2.3.Giai đoạn sống được chọn lọc 3.2.4.Kiểu tác động 3.2.5.Không gian-giới hạn chon lọc 3.2.6.Sự chọn lọc thay thế + Các yếu tố di truyền ảnh hưởng đến sự chọn lọc của tính kháng Tần số alen kháng (R) ban đầu có ảnh hưởng đến sự phát triển tính kháng. Tần số alen kháng ban đầu trong QT cao, tính kháng có một sự khởi đầu thuận lợi. Thường thì tần số alen kháng ban đầu trong QT rất thấp. Sau nhiều thế hệ sử dụng TTS tần số này tăng dần lên. Hình dung một quần thể với alen R có tần số thấp. Các cá thể đồng hợp tử RR có thể xuất hiện, nếu quần thể đủ lớn, nhưng số lượng sẽ rất hiếm. Nếu tính kháng là lặn thì việc áp dụng TTS với một liều lượng phù hợp (Taylor và Georghiou.1979), khi đó tiếp tục sử dụng TTS thì tất cả các cơ thể đồng hợp mẫn (SS) và dị hợp (RS) sẽ bị loại khỏi quần thể côn trùng gây hại, chỉ còn rất ít cá thể RR. Nếu trong QT thời điểm này có một dòng nhập cư là các cá thể mẫn, thì số ít cá thể RR trong quần thể gốc sẽ bắt cặp với những cá thể nhập cư SS, con cháu của thế hệ tiếp theo hầu hết là RS và SS. Những cá thể này có thể bị giết với sự áp dụng của TTS tiếp theo, giữ cho quần thể dưới sự khống chế. (theo Georghiou. P. Georg and Taylor. E. Charles (1986), Factores influencing the evolution of resistance, pesticide resistance: strategies and tactic for management, National academy press, Washington D.C) Nhờ các gen sửa đổi tần số alen kháng trong quần thể côn trùng tăng dần lên. Theo Mayr (1963) hoặc Dobzhansky (1970) các gen sửa đổi giúp phối hợp các alen kháng với phần còn lại của hệ gen để tạo một “hệ gen đồng thích nghi hài hòa”. Nhiều alen kháng ban đầu là có hại nhẹ (Ferrairi và Georghiou, 1981). Sau đó, khi có cơ hội cho các gen sửa đổi được chọn lọc và các ảnh

14

hưởng đa hiệu đã được bù đắp, thì sự bất lợi giảm bớt hoặc biến mất. Sự chọn lọc TTS trước đó có thể làm dễ dàng hơn cho tiến hóa của tính kháng với các TTS mới bởi tính kháng chéo. Các cơ chế của tính kháng đã được phát hiện và xác định tính kháng không chỉ với một nhóm TTS mà với nhiều nhóm khác. Một ví dụ cổ điển cho kết luận này là phát hiện gen kháng kdr. Cả DDT và Pyrethroid can thiệp vào kênh Na+ dọc sợi trục của tế bào thần kinh. Theo Sawicki và ctv (1984) chỉ ra rằng một Estease, E.033 đã được chọn lọc ở ruồi nhà bởi Malathion và Trichlophon, cũng xác định tính kháng chéo nhẹ với các Pyrethroid. Tự nó, Est không phải là kết quả của sự khống chế ở ruồi nhà với pyr, bởi vì các liều lượng được sử dụng trong thực tế là đủ mạnh để vượt qua tính kháng nhẹ mà nó xác định Trong một vài quần thể, tuy nhiên kdr cũng hiện diện, dù ở tần số thấp, có lẽ là kết quả của việc sử dụng DDT trước đó để khống chế ruồi nhà. Trong các quần thể này việc sử dụng pyr dẫn đến sự chọn lọc đồng thời kdr cũng như Est và sự thất bại nhanh chóng của các hợp chất thuộc nhóm thứ 3, pyr, qua sự chọn lọc của các cơ chế kháng chung [30] Bọ cánh cứng Colorado là một vi dụ thích hợp minh họa cho vấn đề trên. Trên bán đảo Long Island, QT của các loài này cần 7 năm để phát triển tính kháng với DDT, loại thuốc trừ sâu tổng hợp đầu tiên được sử dụng để khống chế chúng. Cũng QT này thời gian phát triển tính kháng ngắn dần với các hóa chất sử dụng tiếp theo: 5 năm để phát hiện tính kháng với Azinphosmethyl, 2 năm với Carbofuran, 2 năm với Pyr và một năm cho các Pyr với chất điều phối [19]. + Các yếu tố sinh học và sinh thái học Sinh thái học và lịch sử đời sống có thể làm thay đổi đáng kể phản ứng

15

đối với sự chọn lọc dẫn đến sự phát triển tính kháng. Rõ ràng nhất, tất nhiên phần lớn là số thế hệ mỗi năm.

16

Biểu đồ 1.1. Mối liên hệ giữa số thế hệ mỗi năm và sự xuất hiện tính kháng Trong các loài được chọn lọc bằng xử lý Aldrin/Diedrin trong đất [19].

Biểu đồ 1.1 minh họa mối liên quan giữa số thế hệ mỗi năm trong các loài côn trùng gây hại sống trong đất và số năm chúng biểu hiện tính kháng với Aldrin/Dielrin xử lý trong đất (Georhiou,1980). Ta có thể thấy dòi rễ (Hylemya.spp) hoàn thành 3-4 thế hệ trong mỗi năm, phát triển tính kháng sau 5 năm xử lý thuốc, trong khi Conoderus falli, với hai thế hệ mỗi năm và xuất hiện tính kháng trong 6 năm. Diabrotica longicarnis, Amphimallon majalis và Popillia japonica, với một thế hệ mỗi năm, cần 8 đến 14 năm để xuất hiện tính kháng trong khi bọ bổ củi (Melanotus tamsuyensis) ở Taiwan, với vòng đời 2 năm, mất 20 năm để phát triển tính kháng. Các loài côn trùng gây hại đa thực có khuynh hướng phát triển tính kháng chậm hơn các loài đơn thực. Có thể do một phần nhỏ các loài đa thực ít chịu sự chọn lọc TTS, do đó sự chọn lọc ít căng thẳng hơn trên các loài này. Bởi vì một vài côn trùng sẽ ở vùng trú ẩn nơi không xử lý TTS- cung cấp nguồn cá thể mẫn cảm. Đây cũng có thể là cơ sở để giải thích sự hình thành tính kháng trong bọ chét của gia súc ở Nam Phi xuất hiện đầu tiên ở các loài kí chủ đơn và sau đó mới xuất hiện ở các loài bọ chét tấn công trên 2 hoặc 3 vật chủ (Whitehead và Baker, 1961; Whaton và Roulston, 1970)[19]

17

Sự nhập cư của các cá thể mẫn SS có thể làm chậm sự tiến hóa [36], [18]. Ngược lại, nếu sự nhập cư không xảy ra hoặc số cá thể nhập cư quá ít, thì một số lượng đáng kể các cá thể RR sẽ tạo ra, quần thể phát triển tính kháng nhanh[19]. Vùng trú ẩn có vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguồn cá thể nhập cư mẫn cảm, làm chậm quá trình tiến hóa (Georhiou và Taylor, 1976). Vùng trú ẩn giúp một phần các cá thể của QT trốn thoát khỏi sự chọn lọc. Vùng trú ẩn có thể bao gồm các mô thực vật, mầm cây,...hoặc có thể là giai đoạn sinh lý mẫn cảm thấp, như thời kì đình dục hoặc nhộng trong đất [19]. Kẻ thù tự nhiên. Xu hướng xuất hiện tính kháng của các loài côn trùng gây hại mạnh hơn kẻ thù tự nhiên của chúng một cách đáng kể (Tabashnik, Rouch cùng tập) [35]. Hiện tượng này được giải thích như sau: Giả sử một loại TTS giết một phần lớn con mồi và các vật ăn thịt trong vùng được xử lý TTS. Đối với cuộc sống của con mồi sống sót là tương đối thuận lợi (nó được tự do khi không bị khống chế bởi những loài vật ăn thịt), và QT con mồi có thể tăng lên nhanh chóng. Trái lại, cuộc sống của của các con vật ăn thịt còn sống sót là tương đối bất thuận lợi (do khó khăn trong việc tìm kiếm thức ăn) so với QT con mồi, do đó QT của chúng sẽ có khuynh hướng phục hồi chậm hơn [35]. + Các yếu tố tác động của TTS Quá trình xuất hiện tính kháng có thể có liên quan trực tiếp tới việc sử dụng TTS của con người, như thời gian, liều lượng và công thức sử dụng... TTS. Thời gian sử dụng TTS thường xuyên có thể là yếu tố quan trọng làm xuất hiện tính kháng. Khi xử lí thuốc lần đầu tiên thì số cá thể RR có thể sống sót rất ít, nhưng các lần xử lí tiếp theo thì số cá thể này có thể tồn tại đáng kể.[30]. Liều lượng TTS sử dụng là yếu tố nhằm xác định tính trội của tính kháng. Liên quan đến vấn đề này là công thức và tốc độ phân hủy TTS. Nếu

18

một TTS mà tồn tại dai dẳng thì có thể giết các cá thể nhập cư mẫn cảm và kết quả là ngăn cản sự nhập cư. Điều này rất thích hợp cho sự phát triển và hình thành tính kháng trong QT. Việc lựa chọn loại thuốc trừ sâu là rất quan trọng. Thường có một vài mức độ kháng chéo đối với các TTS khác nhau trong cùng một lớp. Sự phụ thuộc vào cơ chế kháng, cũng có thể là tính kháng chéo giữa DDT và Pyr bởi gen krd và giữa Car và OP bởi sự chọn lọc của AchE vô cảm (Hama, 1983) [19]. Như vậy, tính kháng TTS đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong những năm gần đây [18]. Nhiều nghiên cứu cho thấy tính kháng TTS là một hiện tượng tiến hóa, chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố: di truyền, sinh học, tác đông của TTS. Hiểu biết đầy đủ sự ảnh hưởng của các yếu tố trên là rất quan trọng giúp thiết lập các phương pháp quản lý tính kháng khả thi để làm chậm hoặc đoán trước được sự tiến hoá tính kháng TTS của côn trùng. I.5. C¸c c¬ chÕ cña tÝnh kh¸ng TTS ë c«n trïng

I.5.1. Cơ chế di truyền của tính kháng TTS Cơ chế di truyền của tính kháng TTS của côn trùng vô cùng phức tạp. Mức kháng của sinh vật thường là kết quả của sự tương tác giữa các alen của một vài gen ở những locus khác nhau. Sự tương tác này được gọi là tính kháng đa gen. Một sự phức tạp thêm nữa là sự tồn tại của gen ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tác động riêng rẽ hoặc trong mối liên quan với các gen trên nhiễm sắc thể. Ở thực vật, tính kháng thuốc diệt cỏ có thể được di truyền hệ gen nằm ngoài tế bào chất. Sự xuất hiện tính kháng có thể do đột biến gây nên, khi sử dụng một loại TTS nào đó kéo dài làm cho gen cấu trúc, hoặc gen điều hòa nào đó bị đột biến. Một vài gen cấu trúc được dịch mã tạo sản phẩm (như các enzym, các thụ quan hay các thành phần trong tế bào như ribôxôm, tubilin...) là các đích cho các TTS. Đột biến của các gen cấu trúc có thể dẫn đến sự thay đổi nghiêm trọng các sản phẩm gen, như giảm sự mẫn cảm của vị trí đích, hoặc

19

tăng khả năng chuyển hóa TTS. Các sản phẩm của gen điều hòa có thể khống chế tỉ lệ phiên mã gen cấu trúc. Chúng cũng có thể nhận ra và kết nối TTS và bằng cách đó chúng điều khiển sự cảm ứng của các enzym giải độc phù hợp[14]. Một vấn đề đặt ra rất quan trọng là có bao nhiêu gen quy định tính kháng ở côn trùng? Có nhiều gen xác định tính kháng và mỗi gen xác định tính kháng đối với một loại TTS hay chỉ có một vài gen, mỗi gen xác định tính kháng đối với một số lớn các nhóm TTS? Nếu có một số lớn các gen, mỗi gen xác định tính kháng đối với một loại TTS thì tính kháng sẽ được hạn chế và các TTS mới sẽ giải quyết được vấn đề kháng. Trái lại nếu có một số giới hạn các cơ chế di truyền liên quan, thì các QT có thể sẽ kháng với các loại TTS mà chúng chưa hề tiếp xúc bao giờ. Giả thiết thứ hai có vẻ hợp lý hơn. Vì vậy sự phát triển các TTS mới có quan hệ gần với các TTS hiện đang sử dụng về kiểu tác động hoặc con đường chuyển hóa sẽ không giải quyết được vấn đề [17]. Standard neo-Darwinian modells (Moore, 1984) cho rằng sự xuất hiện tính kháng là kết quả sự tích lũy của nhiều đột biến, mỗi đột biến đóng góp một hiệu quả nhỏ đối với tổng số. Nếu vậy tính kháng TTS ở côn trùng là do nhiều gen chi phối, nhưng thực tế không như vậy (Whitten và Mc kenzic, 1980), trong các quần thể trên đồng ruộng tính kháng hầu như luôn luôn bởi một gen chính đơn. Bởi vậy, giả thiết tiến hóa chuẩn dường như không áp dụng đối với sự phát triển của tính kháng[17]. Giả thuyết gen điều hòa là phương thức phù hợp hơn để giải thích cho sự biến đổi, đặc biệt ở mức QT hoặc loài phụ. Các gen như vậy khống chế thời gian và bản chất biểu hiện của gen cấu trúc, phù hợp hơn để cung cấp cơ sở di truyền của sự biến đổi thích nghi như sự phát triển của tính kháng (Levin, 1984). Theo quan điểm của Frederick. W, Papp.j.R các dữ liệu về tính kháng ủng hộ cho giả thuyết của Levin.

20

Có 2 kiểu gen điều hòa dường như cùng tồn tại, chúng khác nhau về bản chất di truyền và sinh hóa. Một kiểu di truyền theo kiểu tất cả hoặc không (trội hoàn toàn hoặc lặn) và xuất hiện liên quan đến sự thay đổi trong khối lượng của của prôtein được tổng hợp. Kiểu thứ 2 chỉ ra sự di truyền đồng trội và liên quan đến sự biến đổi trong bản chất của prôtein được tổng hợp. Tính kháng số lượng (kiểu kháng liên quan đến sự khác nhau trong số lượng prôtêin được tổng hợp) về bản chất tương tự các operon vi khuẩn. Tính kháng kiểu này xuất hiện liên quan đến các yếu tố điều hòa ở gần kề các gen cấu trúc mà không diễn ra trong gen cấu trúc. Sự điều hòa theo kiểu này đã xác định gần như sự điều hòa gần (Paigen, 1979). Tính kháng chất lượng, xuất hiện đối với sự hiện diện của một số cơ chế cho phép sự sản xuất các dạng biến đổi của các enzym giải độc đặc biệt trong côn trùng kháng so với côn trùng mẫn. Các nghiên cứu di truyền trên đối tượng ruồi nhà (Plapp, 1984) chỉ ra rằng sự biến đổi ở một locus di truyền đơn xuất hiện để khống chế tính kháng liên quan với các enzym giải độc phức tạp. Một cơ chế tương tự có thể rút ra từ các nghiên cứu ban đầu với D. melanogaster (Kikawa, 1964a,b). Khi một locus biểu hiện tác động vào sự biến đổi của các enzym, gen có lẽ không gần kề đối với các enzym mà hoạt tính của enzym điều khiển nó. Sự điều khiển như vậy, đã xác định như các điều hòa xa và các hệ thống như vậy có thể coi như “các đơn vị điều hòa” (Plapp, 1984). Theo Paigen, các hệ thống này được quy định bởi sự di truyền đồng trội của chúng hơn là kiểu “tất cả - hoặc – không” của các hệ thống tương tự ở vi khuẩn [17]. I.5.2 Cơ chế hóa sinh của tính kháng TTS I.5.2.1- Giảm khả năng thấm Tính thấm giảm do tầng cuticul hoặc lớp mỡ dưới da dày hơn ở cơ thể kháng so với cơ thể mẫn hoặc kháng yếu. TTS muốn tác động lên cơ thể côn

21

trùng gây hại nó phải thấm được vào cơ thể với một liều lượng nhất định rồi sau đó nó mới tác động lên vị trí đích của thuốc. Những dòng sâu hại kháng thuốc có thể hạn chế hoặc ngăn cản sự xâm nhập của thuốc vào cơ thể qua biểu bì, ngăn cản thuốc thuốc xâm nhập qua sợi trục và nội quan. Sự giảm tính thấm là cơ chế chủ yếu làm giảm mức độ nhạy cảm của các vị trí tác động đối với thuốc ở côn trùng (Moloyama. 1990). Theo Heyes và ctv (1974), ruồi kháng thuốc trừ sâu có lớp cuticul ở đốt bàn dày hơn nên thuốc cũng khó thấm hơn so với cá thể mẫn. Octt cũng nêu lên (1970) rằng ruồi đục lá kháng TTS có lớp lipit, lớp sáp và prôtêin trong lớp cuticul hay do sự tăng kết cứng biểu bì nên đã làm giảm khả năng xâm nhập thuốc vào cơ thể Pery và Agosin cũng cho rằng những QT sâu kháng thuốc xuất hiện một lớp lipit mới có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của thuốc vào cấu trúc tinh thể của hệ thần kinh làm thuốc mất tác dụng T. Miyata (1986) [24], N. Motayama (1990) [25] đã công bố rằng những nòi sâu tơ kháng TTS như Fenvalerate, có khả năng hạn chế sự xâm nhập chất độc qua biểu bì. Khi nghiên cứu so sánh khả năng thấm qua màng cuticul của thuốc Fenialevate đã được đánh dấu phóng xạ cho thấy tỉ lệ thấm qua màng ở dòng kháng (R) là thấp hơn dòng mẫn cảm (S) [22], [25] I.5.2.2.Giảm độ mẫn cảm đối với các vị trí tác động của TTS TTS sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng sẽ tác động lên côn trùng ở các vị trí đích nhất định gọi là vị trí tác động, ở các côn trùng kháng thuốc, tại các vị trí tác động có hiện tượng giảm mẫn cảm đối với các loại thuốc trừ sâu. Các cơ chế làm giảm mức độ mẫn cảm ở các vị trí đích là: * AchE. Trong nhiều nghiên cứu đã cho thấy AchE không mẫn cảm tạo tính kháng ở các loài cánh vảy (Robin. V. Gunning và Geahan. D. Moores).

22

Ache.E là enzym thủy phân chất dẫn truyền thần kinh, nếu sự thủy phân này không diễn ra, sự tích lũy AchE ở xinap thần kinh dẫn đến sự kích thích lặp lại, cuối cùng làm chết côn trùng bởi sự kiệt sức[20]. Sự tồn tại tính không mẫn cảm của AchE với OP được phát đầu tiên ở dòng nhện đỏ (Tetranychus usticae) kháng paraoxon (Smissart, 1964) [20]. Các loài côn trùng có nhiều dạng AchE không mẫn cảm, mà mỗi dạng thể hiện đặc tính khác nhau qua tham số động học riêng của nó. Các dạng AchE khác nhau đã được mô tả ở bọ phấn hại thuốc lá (Byrne và Devonshire, 1993). Tương tự như vậy, các dạng không mẫn cảm của AchE đã được báo cáo ở bọ khoai tây Colorada, L. decembineata (Wierenga và Holling. Worrth. 1993) Dạng AchE được phát hiện ở muỗi C. Tritaeniorhymchus là nhân tố không mẫn cảm rất lớn (tới 7000 lần) chống lại Dichlorvos (Mamiya. 1997) [13]. Ở các nòi sâu kháng thuốc khi tiếp xúc với TTS, Cholinesterase trở nên “trơ”, không mẫn cảm với thuốc nữa. Những TTS ức chế hoạt động của các enzym này là các thuốc thuộc nhóm OP và Car [31]. * Các thụ thể GABA (acid – amibutiric) là đích cơ bản của TTS Cyclodiene. Hầu hết các trường hợp tính kháng Cyclodiene xuất hiện là do làm giảm độ nhạy cảm thụ quan A tiểu loại GABA [29], một phần của kênh Cl −. Giống với AchE, sự giảm tính nhạy cảm của các thụ thể GABA là do một sự thay đổi trong cấu trúc prôtein. Nhưng không giống như ache, chỉ một đột biến đơn gây ra một Aa đặc hiệu bị thay bằng một Aa khác (một Serin hoặc một Glycine) dẫn đến các mức độ kháng cao với cyclodien. Ngoài ra cũng phát hiện một số đột biến điểm khác nhưng nó không gây nên tính kháng hoặc hiếm khi gắn liền với tính kháng [28]. * Các kênh Na + đóng mở phụ thuộc vào điện thế màng tế bào thần kinh, nó đóng một vai trò rất quan trọng trong việc dẫn truyền thần kinh.

23

Thuốc trừ sâu DDT và Pyrethroid bám vào kênh Na + làm chậm tốc độ đóng hoặc mở của chúng và hậu quả của việc ion Na + đổ vào trong tế bào có thể tạo nên một loại điện thế thứ 2 và được nhân lên nhiều lần kết quả là hệ thống thần kinh của sâu hại bị kích thích dữ dội làm sâu hại chết. Có một phản ứng kiểu hình liên quan đến tính kháng Knockdown (kdr) làm cho các kênh Na + này trở nên ít nhạy cảm với sự gây độc. Nguyên nhân là do sự biểu hiện của một gen gắn liền với chức năng của kênh Na + bị thay đổi hay do một đột biến cấu trúc xảy ra với các kênh dẫn đến tính kháng kdr. * Các TTS giống hoocmon trẻ như Methoprene cạnh tranh thụ thể JH với hoocmon tự nhiên. Hầu hết tính kháng với các loại TTS giống JH được tạo ra bởi cơ chế chuyển hóa hay giảm sự xâm nhập của TTS qua màng cuticul. Thông báo duy nhất về sự không nhạy cảm ở điểm đích đối với TTS giả JH là các đột biến được phân lập từ các dòng Drosophila ở trong phòng thí nghiệm [28]. Gen kháng Met đã được phân lập từ các dòng này gắn liền với một prôtêin kết hợp với JH ít nhạy cảm. Sự vận động các alen của gen Met bởi một yếu tố vận động TE có thể gây ra tính kháng [19]. Protêin kết hợp với JH không nhạy cảm, hoặc là kết quả của một đột biến làm thay đổi cấu trúc prôtêin đó, hoặc sự biểu hiện chu kỳ sinh trưởng của côn trùng đã bị thay đổi. * Đối với TTS Bt, vị trí tác động của thuốc là màng ruột giữa. Những nòi sâu tơ kháng Bt, nhiều tác giả đã chứng minh, là do sự giảm sút ái lực của màng ruột giữa đối với thuốc (Sun.C.N. 1990)[31]. I.5.2.3. Tăng khả năng giải độc TTS cho côn trùng Sự giải độc TTS trong cơ thể côn trùng là nhờ hoạt động của một số en zym trong cơ thể như: Esterase, Microsomal oxidase, Glutathione- STransferase. * Các Monooxygenase P 450 . Các cytochrome P 450 là các protein chứa hem, nó tác động như enzym oxydase giới hạn trong hệ thống Monooxygenase. Trong tế bào của sinh vật

24

nhân chuẩn có nhiều dạng P 450 phức tạp. Các monooxygenase rất đáng chú ý vì chúng có thể oxy hóa các chất đa dạng và rộng rãi và có khả năng tạo ra một danh sách đáng ngạc nhiên các phản ứng (Kalkarni và Hodgson, 1980, Rendic và Dicarlo, 1997, Mansuy, 1998). Danh pháp và phân loại P 450 cytochrome đã được xác định qua các công trình nghiên cứu của Nelson và ctv (1996), Rendic và Dicarlo (1997). Các nghiên cứu sớm về Monooxygenase ở côn trùng nhận thấy tăng P 450

Cytochrome tổng số trong các dòng kháng so với dòng mẫn (tham khảo

Holgson, 1985). Tuy vậy, các mức P 450 tổng số thường tăng chỉ khoảng 3 lần trong khi đó hoạt tính Monooxygenase tăng với mức cao hơn nhiều[29] Tính kháng do Monooxygenase tạo thành có thể là kiểu phổ biến nhất nhất của tính kháng TTS dựa vào sự chuyển hóa (Holgson và Kulkasus. 1983; Oppenoorth 1985; Brattsten và ctv. 1986; Scott. 1991). Các enzym Monooxygenase xúc tác một loạt các phản ứng giải độc ở côn trùng bao gồm hydroxy hóa DDT, epoxid hóa các Cyclodiene, oxy hóa các phosphothloate[29] P 450 là kiểu biểu hiện vượt trội trong các quần thể kháng TTS và các dạng đa kháng được nhận biết dựa trên các nghiên cứu protein (Ronis 1988) và các nghiên cứu về axit nucleic (Scott 1994). Tuy nhiên, sự liên quan của nó với tính kháng TTS, cơ sở phân tử của sự biểu hiện quá mức này cho tới nay vẫn còn nhiều điều chưa rõ. * Hệ isozym Esterase (Est) Đây là một nhóm các isozym không cùng nguồn và một đặc tính chung của Est là có khả năng phá vỡ các liên kết este của axit cacboxylic trong các hợp chất phát sinh từ Naphthol, Indoxil Metholumbelliphirin. Trên thế giới, các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học đã cho biết một số isozym Est có liên quan đến tính kháng thuốc, các isozym Est liên quan đến tính kháng thuốc ở muỗi được nghiên cứu trong những

25

năm 1975 đến 1978 (Pasteur.N và Singre.G)[21], [26]. Năm 1993, khi tiến hành định lượng hàm lượng Est tổng số ở hai dòng muỗi Culex quinquefasciatus (dòng kháng và dòng mẫn cảm với TTS Malathion), một số tác giả đã nhận thấy rằng, hàm lượng enzym này ở dòng kháng cao gấp 8,5 lần so với dòng mẫn[1]. Theo Maguyama.Y và ctv (1983), điểm tác động của các enzym thủy phân lên thuốc Malathion như sau: H 3 CO

P

H 3 CO

(2)

S

CH

COO

C2 H5

CH

COO

C2 H5

(1) S

(1.)

Do phosphataza

(2.)

tác động

(3)

(2,3) Do carboxyl esterase tác động Một số tác giả khác thì cho biết dạng chuyển hóa của TTS do Est là như sau P

O

Esterase

S

O

O

Dạng độc P

P

Dạng không độc S

Esterase

S

P

O

O

Dạng độc

Dạng không độc

Mặc dù hoạt tính Est có liên quan đến tính kháng OP ở nhiều loài sâu hại, nhưng cơ chế phân tử và hóa sinh của tính kháng cho Est chỉ được làm sáng tỏ ở ít loài. Hai chức năng khác nhau đã được thiết lập trong giới hạn khả

26

năng của các enzym này liên quan đến tính kháng OP là: -

Sản xuất vượt mức Est mà chúng tác động để tách estephosphat

(do khuếch đại gen). -

Biến đổi chất lượng trong cấu trúc enzym mang lại sự tăng tính

hoạt hóa đã được nghiên cứu ở rệp và muỗi Culex. Ở muỗi, sự gia tăng lớn (250 lần) về số bản sao gen Est đã gặp ở những dòng kháng mạnh (Mouches và ctv. 1986). Hai năm sau, sự khuếch đại gen Est ở M. Persicae đã được xác nhận (Field và ctv. 1988) và 5 năm sau các gen đã được tách dòng và giải trình tự hoàn toàn (Frield và ctv. 1993). Các gen Est khuếch đại đã được phát hiện ở loài M.nicotionae (Field và ctv. 1994) và các cơ chế tương tự cũng đã được ở những loài rệp khác, Schizaphisgramivaum (Rider và ctv.1998, Ono và ctv. 1999). Trong nhiều trường hợp, các mức độ Est tăng lên bởi sự khuếch đại gen hoặc enzym bị đột biến thành các enzym Est bị thay đổi về cấu trúc là cơ chế kháng gây ra ở mức độ phân tử. Hiện tượng khuếch đại các gen Est ở rệp M.pesicae và muỗi Culex là một ví dụ điển hình nhất về cơ chế kháng ở mức độ phân tử.[16] Sự nhân đôi quan sát được trong lượng esterase thông qua 7 dòng kháng tăng dần đưa ra kết luận rằng sự khuếch đại gen là cơ sở cho sự tổng hợp enzym vượt mức tính kháng TTS (Devoshere và Sawiki,1979). Các gen E4 được khuếch đại và khung ADN ở một dòng rệp (7945) có một vị trí độc nhất trên nhiều đơn vị 24kb (các đơn vị khuếch đại genamplicaton) được sắp xếp như một dãy các đoạn lặp lại hướng đầu đuôi (theo Ried và cộng sự, 1996). Những đoạn này rõ ràng được tạo ra bởi nhiều đứt gãy chỗ ngược dòng gen E4 ở vị trí tương tự một cchs chính xác để tạo ra sự lặp đoạn E4/FE4n khởi đầu tiếp theo sự sắp xếp lại để tạo ra nhiều chỗ nối mới (NJ) giữa các bản sao (Fiel và Devomhine.1997,1998).[hình 1] mô tả cách sắp xếp nay phù hợp với mô hình tạo ra ADN bởi sự trao đổi chéo

27

không cân giữa các cromatid chị em, do đó không có những đoạn tương đồng khác nhau hay những vùng giàu adenine thường liên quan tới sự kiện như vậy (Trifolia và cộng sự,1991). Hình 1: Mô hình tạo mối nối mới (NJ) nhờ sự khuếch đại của gen E4 và khung ADN

a-Kiểu hoang dại với chỉ một bản gen b-Các amplicon xếp thành chuỗi Tính kháng tăng lên là do các esterase tương tác với TTS nhanh hơn với chính điểm đích của chúng, khi các Est có mặt với tỷ lệ ngang bằng với loại TTS này [25] Bọ xít xanh, Schinaphis graminum là một loại sâu hại lúa miến và cũng thể hiện sự phát triển tính kháng với TTS OP như ở rệp (Ono 1994) đã có sự xác nhận rằng các gen esterase E4/FE4 được khuếch đại của M.persicae giống với gen mã hóa kiểu I ở S.graminum tới 73% trình tự các axitamin dự đoán của Ono (1999) nên có thể các gen này là cùng tổ tiên dẫn đến sự giống nhau giữa các gen có thể là dẫn đến kết quả quá trình khuếch đại các các gen giống nhau trong phản ứng với áp lực của chọn lọc do TTS OP đối với cả hai loài.

28

Ở muỗi, sự khuếch đại gen như là cơ sở phân tử của tính kháng đã được tổng kết (Devonshire và Field, 1991; Soderlund và Bloomquist,1991;Soderlund,1997)[ 12] Như vậy sự xuất hiện hiện tượng khuếch đại gen như là cơ chế kháng ở Culex và M.persicae là một vài cơ chế kháng ở mức phân tử và đặc tính hóa sinh của cơ chế kháng được hiểu rõ nhất hiện nay Sự biến đổi chất. Sự có mặt của các esterase sửa đổi về chất liên quan với tính kháng OP được đề cập tới trong một số loài kháng OP (Whyand,1985). Cơ sở của sự thay đổi về chất như thể được đề xuất liên quan đến sự sửa đổi cấu trúc của esterase để tăng khả năng phân giải TTS của nó (Parker,1991) [30] .* Gluthion - S- Transferase. (GST) GST s là một họ các ezym đa chức năng hoạt hoá bổ sung nucleophilic của glutathion (GSH) khử (r-glutamyl-cystein-glycin) thành các cơ chất electroplilic (RX). RX + GSH → GSR + HX (Mannenrk và Danielsox.1988;Clark.1989) Sự liên quan của các GST trong sự chuyển hoá TTS OP lần đầu tiên được đề cập bởi Fukami và Shishido (1966). Họ phát hiện rằng trong các mô của chuột và các côn trùng, Methyl parathion bị Dimethyl hoá bởi enzym hoà tan mà mỗi enzym này đòi hỏi Glutathione. Nhiều TTS OP có thể được chuyển hoá và giải độc bởi enzym này (Motoyama và Dautema.1980), nên các GST có thể đóng vai trò chính trong tính kháng OP đặc biệt những thuốc OP có nhóm Omethyl. Sự loại hydrochlorid của DDT là con đường chính của sử giải độc trong một vài côn trùng, đặc biệt là ở ruồi nhà và một số loài muỗi (Oppenoorth.1985). Phản ứng được hoạt hóa bởi DDT dehydrochlorinase đòi hỏi GSH hòa tan (DDTase). Clark và Shaman (1984) đã cung cấp bằng

29

chứng thể hiện rằng DDTase ở ruồi là GST. Hiện nay có nhiều bằng chứng cho thấy một vài dạng GST có hoạt tính DDTase (Tang và Tu. 1994; Prapanthadaza và ctv. 1995) Yang và ctv 1971 đã phát hiện rằng sự tách diazion phụ thuộc GST ở những con kháng của dòng kháng là cao hơn đáng kể so với dòng mẫn. Hai cơ chất thường được dùng để nhận biết sự tăng hoạt tính GST trong

sự

liên

quan

với

tính

kháng

là

Chlorodinitrobenzen

và

dichcloronitrobenzen.

Chương II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

30

II.1. Đối tượng nghiên cứu - Ruồi đục lá (đối tượng sâu hại của nhiều câyrau và họ cây thập tự, trong đó có cây đậu trạch) - Vị trí phân loại:

Ngành:Động vật chân khớp (Athropoda) Lớp

:Côn trùng

(Insecta)

Bộ

:Hai cánh

(Diptera)

Họ

:Agomyzidae

Chi

:Liriomyzae

Loài : Liriomyzae sativae Blanchard II.1.1.Đặc điểm hình thái: Ruồi đục lá là loài biến thái hoàn toàn, vòng đời trải qua 4 giai đoạn là Trứng, sâu non, nhộng và giai đoạn ruồi trưởng thành. •

Trứng: Hình bầu dục, khi mới đẻ có mầu trắng sữa, sau đó chuyển thành mầu trắng đục. Trứng được nằm gọn trong vết châm của ruồi trên lá.Những vết châm không có trứng thì mép không gọn và hình dạng có thể tròn, hoặc có góc cạnh.Những vết châm có trứng thì luôn có hình bầu dục và mép gọn. Kích thước trung bình của trứng khoảng từ 0,02 đến 0,13mm.

•

Ấu trùng: Có ba độ tuổi.Móc miệng hình chữ Y rất linh hoạt. Tuổi 1 màu trắng trong, tuổi 2 mầu vàng nhạt, tuổi 3 màu vàng rơm.Kích thước trung bình các độ tuổi lần lượt là: 0,7;1,3 và 2,3mm.

•

Nhộng: Nhộng bọc hình bầu dục, có 10 đốt. Kích thước trung bình khoảng 2,8 đến 3,8mm.

31

Ảnh 1: Nhộng của ruồi đục lá •

Ruồi trưởng thành: Kích thước nhỏ, ruồi cái thường có thân hình và cành dài hơn ruồi đực. Đầu được bao phủ bởi một lớp lông màu đen bóng, có râu đầu.Mắt kép to màu nâu đỏ, ba mắt đơn nằm ở các khu trán-chân-môi. Miệng kiểu liếm hút có hàm dưới to, bàn chân có 5 đốt, bụng 6 đốt giữa các đốt có màu vàng. Bụng con đực thường nhỏ hơn con cái Con cái có máng đẻ trứng dài và nhọn; bộ phận sinh dục của con đực tù, ngắn và nhỏ.

Ảnh 2: Ruồi đục lá trưởng thành (Liriomyza sativae Blanchard) II.1.2. Đặc điểm sinh thái •

Nhộng thường vũ hóa thành con trưởng thành vào buổi sáng, nhiều nhất là khoảng từ 6h đến 8h sáng. Sau khi đã vũ hóa khoảng 1h thì màu sắc cơ thể mới ổn định. Ruồi ăn thêm và thường sau 1 ngày mới bắt cặp giao phối. Thời điểm giao phối nhiều nhất là khoảng thời gian từ 6h đến 8h và 14h đến 18h trong ngày. Thời gian giao phối mỗi lần

32

kéo dài khoảng 40 đến 120 phút..Một con cái có thể giao phối từ 1 đến 3 lần, số lần giao phối quyết định đến lượng trứng đẻ của ruồi cái. Ruồi cái không giao phối vẫn có khả năng đẻ trứng nhưng số trứng đẻ rất ít chỉ bằng 2/3 lần so với ruồi cái được giao phối và trứng không có khả năng nở thành ấu trùng. •

Ruồi cái dùng máng đẻ châm lên mặt lá thành những lỗ nhỏ sau đó bò lùi lại cho miệng vào vết châm hút dịch đồng thời thăm dò vị trí đẻ trứng. Ruồi thường đẻ trứng trên những lá bánh tẻ (không già, không non). Một con ruồi cái có thể đẻ khoảng 250 trứng trong thời gian là 810 ngày.

•

Vòng đời của ruồi đục lá ở nhiệt độ 25-30 0 C là khoảng từ 13 đến 19 ngày. Loài này gây hại cho cây trồng quanh năm. Chủ yếu gây hại cây trồng nặng nhất là vào các tháng 4,5 và từ tháng 7 đến tháng 11 trong năm.

•

Triệu chứng và mức độ gây hại: Ấu trùng ruồi đục lá nằm dưới biểu bì lá ăn lớp nhu mô để lại hai lớp biểu bì, tạo thành các đường đục ngoằn nghèo. Giữa các đường đục có vệt phân do ấu trùng thải ra mầu xanh hoặc mầu nâu đen. Do đường đục lá bị khô héo làm cho diện tích lá bị thu hẹp dẫn đến làm giảm khả năng quang hợp và trao đổi chất của cây trồng hậu quả là cây còi cọc, phát triển chậm ảnh hưởng đến năng xuất. II.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu II.2.1 Địa điểm Chúng tôi tiến hành đề tài này tại: + Trong phòng thí nghiệm: Phòng khảo nghiệm thuốc trừ sâu - Trung

tâm kiểm định thuốc bảo vệ thực vật phía Bắc-Cục bảo vệ thực vật. + Ngoài đồng ruộng: Chúng tôi thu thập mẫu và tiến hành các thí nghiêm ngoài đồng ruộng tại ba địa điểm có đặc điểm là vùng chuyên canh

33

trồng các loại rau màu đó là: - Song phương Hoài Đức Hà Nội: Đây là một địa điểm có diện tích trồng rau quanh năm với nhiều loại rau màu mà trong đó có nhiều loại cây là kí chủ của loài ruồi đục lá, trong đó có cây đậu trạch. Về mặt địa lý đây là một vùng chuyên canh nằm phía tây và cách trung tâm thành phố Hà Nội khoảng 12km. - Đình Tổ -Thuận thành - Bắc Ninh: Đây là một xã có diện tích đất trồng mầu chủ yếu trong đó có nhiều loại cây chủ yếu là kí chủ của loại ruồi đục lá này như các họ bầu bí, họ đậu, dưa chuột.... Nằm cách Hà Nội khoảng 30km. - An Bình Thuận thành - Bắc Ninh: Đây là một xã có diên tích đất chủ yếu trồng mầu cây trồng chủ yếu như dưa chuột, các cây bầu bí và đậu trạch. Nằm cách Hà Nội khoảng 50km. Những địa điểm mà chúng tôi lựa chọn đều cách xa nhau nhằm hạn chế tối đa sự di nhập của các cá thể trưởng thành giữa các quần thể. II.2.2.Thời gian nghiên cứu: Chúng tôi bắt đầu tiến hành nghiên cứu từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 10 năm 2009 II.3. Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm II.3.1. Dụng cụ Dụng cụ để phục vụ trong quá trình nghiên cứu đề tài này gồm có: Nhà lưới, lồng lưới kích thước 120×60×60cm và lồng 60×60×60cm. Các thiết bị trong phòng thí nghiệm như bô can thủy tinh,đĩa petri,ống nghiệm, kính lúp, ống đong, dụng cụ đo nhiệt độ tủ lạnh... II.3.2.Vật liệu - Gồm 5 loại thuốc được dùng trong nghiên cứu là: + Sherpa 25EC: Thuộc nhóm Pyrethroid, chứa hoạt chất Cypermethrin với hàm lượng 25g hoạt chất/100ml. Nó tác động vào kênh Na+ trên sợi trục tế bào thần kinh làm cho các kênh này kéo dài thời gian mở dẫn đến hưng

34

phấn kéo dài làm cho côn trùng chết. Thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc. + Trigard 75 WP: Thuộc nhóm thuốc ức chế điều hòa sinh trưởng côn trùng (IRG); chứa 75g hoạt chất Cycromazine/100g sản phẩm.Thuốc có tác dụng tiếp xúc,ngăn cản quá trình tổng hợp kitin, ngăn cản quá trình lột xác làm côn trùng chết. + Success 120SC: Nguồn gốc sinh học có chứa 120g hoạt chất Spinosad trong một lít thương phẩm, thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc, tác động vị độc cao hơn tiếp xúc khoảng 5 lần. Chúng ảnh hưởng đến sự hoạt hóa thụ quan Nicotinic acetylcholine (nAch) và chức năng của GABA. + Alfatin 1.8.EC: Có nguồn gốc sinh học chứa 1,8g hoạt chất Abamectin trong một lít thương phẩm, thuốc có tác dụng gây độc đường ruột và tiếp xúc, có khả năng thẩm thấu sâu, nhanh vào mô lá nên có tác dụng kéo dài đối với nhiều loại côn trùng trích hút và gây hại ở phần thịt lá. Abamectin gây rối loạn hoạt động sinh lý hệ thần kinh của côn trùng.Tác động chủ yếu là kích thích làm tăng quá trình tạo GAGB, ngăn chặn xung điện thần kinh trong hệ thần kinh vận động của côn trùng. Khi côn trùng tiếp xúc hoặc ăn phải chất độc sẽ bị tê liệt, ngừng ăn rồi chết. + Forfox 400EC: chứa 400g hoạt chất Chlopyrifos trong một lít thương phẩm - Đây là những loại TTS thông dụng được các bà con trồng rau đã và đang dùng hiện nay. - Ngoài ra cần có dung dịch mật ong để làm thức ăn bổ sung cho ruồi II.4. Phương pháp nghiên cứu II.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc trừ sâu. Phương pháp tiến hành: Tại những địa điểm nghiên cứu chúng tôi tiến hành điều tra tình hình sử dụng TTS của các hộ nông dân bằng cách phỏng vấn trực tiếp trên đồng ruộng, hay sử dụng phiếu điều tra có các hệ thống câu hỏi cụ thể và rõ ràng.

35

Nội dung của phiếu điều tra là: + Tình hình canh tác + Tình hình sử dụng TTS: như loại thuốc dùng, phương pháp sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, số lần phun/vụ, khoảng cách giữa các lần phun/vụ.... Mỗi địa điểm nghiên cứu chúng tôi tiến hành điều tra khoảng từ 25 đến 30 hộ gia đình. II.4.2. Nuôi ruồi và xác định độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá II.4.2.1 Nuôi ruồi Thu thập mẫu tại các địa điểm nghiên cứu: + Thu các lá cây có vết đục của ruồi (lưu ý là thu những lá ở cuối vết đục phải có mầu vàng ươm của nhộng, là những lá có chứa những ấu trùng còn sống) về phòng thí nghiệm. + Tại phòng thí nghiệm ủ lá cho tới khi ấu trùng hóa nhộng chui ra ngoài hoàn toàn rồi thu nhộng vào đĩa petri có bông tẩm ướt nhằm giữ độ ẩm thích hợp. + Sau khoảng thời gian từ 4-5 ngày chú ý quan sát mầu của nhộng từ màu vàng tươi chuyển sang màu vàng đen là nó chuẩn bị vũ hóa thì cho vào lồng có kích thước 120×60×60cm với số lượng khoảng từ 200 đến 300 cặp ruồi trưởng thành/lồng. Ruồi trưởng thành được nuôi trong lồng ở nhiệt độ khoảng từ 25 đến 30 0 C và cho ăn thêm thức ăn bổ sung là dung dịch mật ong 10% sau khi các cá thể trưởng thành bắt cặp với nhau thì cứ hằng ngày chúng ta đưa khoảng từ 30 đến 40 cây đậu trạch ở giai đoạn 1 -2 lá thật vào lồng trong khoảng thời gian là 6h đến 8h (khoảng 8h cho cây vào thì 14h đến 16h cho cây ra) để ruồi cái trưởng thành đẻ sau khi đã giao phối với con đực. + Các cây đậu sau khi lấy ra, được giữ cách ly hoàn toàn với ruồi trưởng thành và được chăm sóc cho tới khi trứng nở thành ấu trùng ở tuổi 1 (khoảng từ 3 đến 3,5 ngày) sử dụng ấu trùng này để thử với các loại TTS nghiên cứu nhằm xác định độ mẫn cảm của các QT ruồi đục lá tự nhiên.

36

II.4.2.2 Xác định độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá ở các quần thể tự nhiên. Chúng tôi dùng phương pháp nhúng lá của Tabashnik và Cushing (1997) [32] để tiến hành xác định độ mẫn cảm với một số loại TTS của ấu trùng ruồi đục lá ở tuổi 1. Cách tiến hành:. + Trước tiên phải làm thí nghiệm thăm dò để tìm ra thang nồng độ của mỗi loại TTS nghiên cứu gồm 5, 6 nồng độ sao cho nồng độ cao nhất gây chết khoảng 90 đến 95% nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 5 đến 10% số cá thể ấu trùng thí nghiệm. Sau khi đã chọn được thang nồng độ thích hợp chúng tôi bắt đầu tiến hành thí nghiệm chính thức. + Quá trình tiến hành thí nghiệm: Thang 5 hoặc 6 nồng độ của mỗi loại TTS thí nghiệm đã được chọn để làm thí nghiệm với ấu trùng tuổi 1, mỗi nồng độ nhắc lại ba lần, số ấu trùng sử dụng cho mỗi lần nhắc lại là từ 15 đến 30 cá thể. Khi chọn cây làm thí nghiệm các cây phải có mật độ ấu trùng vừa phải không quá nhiều để tránh tình trạng có hiện tượng cạnh tranh thức ăn giữa các ấu trùng trong quá trình thí nghiệm (mỗi lá cây đậu không quá 15 ấu trùng).Đếm và đánh dấu số ấu trùng trên mỗi lá đã được chọn làm thí nghiệm sau đó nhúng toàn bộ phần lá cây thí nghiệm vào dung dịch thuốc với nồng độ tương ứng trong khoảng 20 giây, Khi làm thí nghiệm xong chăm sóc cây bình thường khoảng từ 2-3 ngày quan sát ở lô đối chứng và các lô ở nồng độ khác nhau ấu trùng đã vào nhộng, cắt tất cả các lá đã thí nghiệm để vào đĩa petri tương ứng với từng nồng độ và mỗi lần nhắc lại (lưu ý để tránh cho lá thí nghiệm không bị khô cần dùng bông tẩm ướt quấn vào cuống lá hoặc cho vào đĩa petri bông ẩm). Khoảng 2-3 ngày sau khi ấu trùng đã hóa nhộng hoàn toàn chui ra khỏi mặt lá ta bắt đầu tiến hành xác định được số nhộng hình thành từ đó ta có thể xác định được số cá thể chết sau xử lý với

37

thuốc.Cần ghi chép cụ thể cho từng lần nhắc lại, từng nồng độ thí nghiệm. + Cách pha nồng độ thuốc khác nhau cho mỗi loại thuốc: Mỗi loại thuốc ta sử dụng 5 đến 6 nồng độ. Dung dịch thuốc có nồng độ cao nhất (làm cho số lượng ấu trùng chết nhiều nhất 90-95% ấu trùng chết) làm dung dịch mẹ (liều 1) muốn chuyển sang nồng độ thấp hơn (liều 2) sử dụng công thức C1V1=C2V2 trong đó C1,V1 là nồng độ thuốc và thể tích nước dùng để pha chế liều 1 C2,V2 là nồng độ thuốc và thể tích nước cần pha chế liều 2. II.4.2.3. Xử lí số liệu Các số liệu thu được chạy trên chương trình Ploplus trên máy tính để xác định được LC 50 và LC 95 Tỉ lệ chết của ấu trùng ruồi đục lá thử nghiệm với TTS có tương quan dương với đường thẳng theo phương trình y = bx+ a . Các liều lượng của thuốc được tính theo Logarit và tỉ lệ chết tương ứng với từng liều thử được chuyển thành Ploplus, hay probit y=bx+ a; trong đó x là logarit cơ số e của nồng độ. Mức độ tin cạy của giá trị LC 50 được kiểm định bằng phương pháp χ2

II.4.3. Quá trình tạo dòng kháng. Để nghiên cứu tính di truyền của tính kháng thì quá trình tạo dòng kháng là một bước rất quan trọng. Chúng tôi tiến hành tạo dòng kháng theo phương pháp chọn lọc quần thể dưới áp lực chọn lọc của TTS Sherpar 25EC có hoạt chất Cypermethrin. Trước hết chúng tôi dựa vào ½ liều khuyến cáo để xác định liều nhằm loại bỏ cá thể mẫn. Những cá thể sống sót được giữ lại nuôi tạo thế hệ tiếp theo. Ở những thế hệ sau xử lý thuốc với liều lượng tăng dần nhằm loại bỏ hết những cá thể mẫn và nâng cao dần tính kháng thuốc của dòng chọn lọc. Với quỹ thời gian có hạn chúng tôi chỉ tạo được dòng kháng Cypermethrin qua 12 thế hệ. Quá trình tạo dòng kháng chúng tôi chia làm 2 giai đoạn:

38

+ Giai đoạn trưởng thành với cả 12 thế hệ chúng tôi cho ăn dung dịch mật ong có pha trộn thuốc Sherpa 25EC có nồng độ 0.05ml thuốc/100ml nước. Mỗi ngày, sau khi ruồi trưởng thành ăn dung dịch mật ong lẫn thuốc, số ruồi sống sót được chúng tôi cho cây vào khoảng 4h đến 6h (sáng khoảng 8h cho cây vào đến 14h chiều lấy cây ra). Số cá thể trưởng thành ở thế hệ sau chính là số ấu trùng sống sót qua mỗi lần thử ở thế hệ trước. + Giai đoạn ấu trùng: Khi ấu trùng ở tuổi 1 (lấy cây ra khoảng 3 ngày sau trên bề mặt lá có vết đục khoảng 1cm) thì chúng tôi tiến hành xử lí thuốc với những thang nồng độ thích hợp ở mỗi thế hệ Bảng 2.1: Quá trình tạo dòng kháng ở giai đoạn ấu trùng Thế hệ F1

Nồng độ xử lí % (tương đương số ml thuốc Sherpar 25EC/100ml H 2 0 ) 0.05

F2

0.10

F3

0.20

F4 F5

0.30 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

F6 F7 F8 F9 F 10 F 11 F 12

Ở F 12 . Một nửa số cá thể trưởng thành sống sót ở thế hệ F 11 dùng để tiến hành thí nghiệm với thang 6 nồng độ, nồng độ cao nhất là 8ml cypermethrin/100ml H 2 O . Một nửa còn lại nuôi duy trì và cho thử với 4 loại thuốc còn lại mục đích là xác định xem có hiện tượng kháng chéo xảy ra đối với các thuốc đó ở dòng kháng thuốc Cypermethrin.

39

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1. Mức độ mẫn cảm và khả năng kháng của ấu trùng ruồi đục lá L. satuvae Blanchard với 5 loại TTS ở các quần thể nghiên cứu III.1.1- Đánh giá độ mẫn cảm và khả năng kháng với TTS của ấu trung ruồi đục lá ở ba quần thể tự nhiên. Để đánh giá mức độ mẫn cảm của ruồi đục lá chúng tôi đã tiến hành chọn ấu trùng ruồi đục lá ở tuổi 1 ở ba quần thể nghiên cứu làm thí nghiệm theo phương pháp nhúng lá với 5 loại TTS. Kết quả được ghi lại sau 4 đến 5 ngày thí nghiệm. Giá trị LC 50 và LC 95 (nồng độ gây chết 50% và 95% số cá thể thí nghiệm) được tính toán từ tỉ lệ ấu trùng chết của các loại TTS thông qua chương trình Ploplus trên máy tính. Mức độ tin cậy được đánh giá ở mức 95%. Các thí nghiệm ở các QT để đánh giá tính mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với 5 loại thuốc được tiến hành bắt đầu từ tháng 2 năm 2009. Mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá thể hiện qua giá trị LC 50 , giới hạn 95% của giá trị LC 50 và giá trị LC 95 của các QT nghiên cứu với các loại TTS tương ứng. Số lượng cá thể nghiên cứu cho mỗi thí nghiệm là (n) trong mỗi loại thuốc cho mỗi QT nghiên cứu và giá trị χ 2 để kiểm định sự phù hợp giữa giá trị thực thu được và giá trị mong đợi lý thuyết với mục đích đánh giá độ tin cậy của các số liệu thu được, cũng được chúng tôi trình bày. III.1.1.1. Kết quả thí nghiệm với thuốc Sherpa 25EC Kết quả xác định mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá L. sativae Blanchard tuổi 1 với TTS Sherpa 25EC của các QT: Song phương, Đình Tổ, An Bình thể hiện qua giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 và giá trị LC 95 được trinh bày ở bảng 3.1 40

Bảng 3.1: Kết Quả Giá trị LC 50 và LC 95 của ấu trùng ruồi đục lá ở các QT nghiên cứu thí nghiệm với TTS Sherpa 25EC Quần thể

Số cá thể thử (n) 412

Song phương Đình Tổ

485

An Bình

543

χ2 thực nghiệm 7.89 (4)* 8.25 (3)* 6.26 (3)*

LC 50 và giá trị giới hạn 95% (dose×10 −2 ) 51.161 (18.53- 157.11) 27.40 (10.93-49.53) 25.08 (17.42-33.21)

LC 95 Ri*

Ri* * LC 95 / LKC

641.94

64,194

127.30

12,73

85.704

8.57

2.04 1.09 1

Chú ý: (...)* là Số bậc tự do Ri* là tỉ số của LC 50 giữa các QT Ri* * là tỉ số giữa LC 95 với LKC Từ số liệu bảng 3.1. cho thấy: - Các giá trị thu được để đánh giá mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với thuốc Sherpa 25EC ở ba QT nghiên cứu là đáng tin cậy với P < 0.05

LC50 và giá trị giới hạn 95%

60 50

51.161

40 30 27.4

20

25.08

10 0 1 Song phương

Quần thể

Đình Tổ

An Bình

Biểu dồ 3.1: Chênh lệch giá trị LC 50 giữa ba QT với thuốc Sherpa 25EC - Sử dụng giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 ở ba QT nghiên cứu

41

mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với thuốc Sherpa 25EC là có mức độ tin cậy với P < 0.05 , chúng tôi thấy về mặt số học thì giá trị LC 50 của ấu trùng ruồi đục lá ở QT Song Phương là cao nhất gấp 2.04 lần so với QT Đình Tổ sau đó đến QT An Bình thấp nhất là QT Đình Tổ có giá trị LC 50 =25.08, tuy nhiên về mặt xác suất thống kê giá trị giới hạn 95% của LC 50 giữa b QT này là có sự gối lợp. Như vậy tính mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá ở 3 QT nghiên cứu với TTS Sherpa 25EC là không có sự khác nhau. - Sử dụng giá trị Ri* * cho thấy giá trị này của QT Song Phương là 641.194, QT Đình Tổ là 12.73 và QT An Bình là 8.57. Như vậy từ kết quả này chúng tôi thấy rằng ấu trùng ruồi đục lá của QT Song Phương đã thể hiện tính kháng với loại TTS Sherpa 25EC, ở 2 QT An Bình và Đình Tổ thì chưa biểu hiện tính kháng đối với loại TTS này. - So với những nghiên cứu gần đây cũng trên đối tượng này ở QT Song Phương như của Trần Phan Hữu năm 2004 và Mai Thị Thủy năm 2006: tỉ lệ Ri* =LC 50 (của dòng năm 2009)/LC 50 (của dòng năm 2004) = 51 .161 16 .288

= 3.14, tỉ lệ LC 50 của QT Song Phương năm 2009 so với dòng năm

2006 là: 1.27. Từ kết quả này chúng tôi có thể rút ra nhận xét là với thuốc Sherpa 25 EC ấu trùng ruồi đục lá đã giảm đáng kể tính mẫn cảm so với những năm trước. III.1.1.2. Kết quả thí nghiệm với thuốc Success 120SC Kết quả xác định mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá L. sativae Blanchard tuổi 1 với TTS Success 120SC của các QT nghiên cứu thể hiện qua giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 và giá trị LC 95 được trinh bày ở bảng 3.1.2

Bảng 3.2: Kết Quả Giá trị LC 50 và LC 95 của ấu trùng ruồi đục lá ở các QT

42

nghiên cứu thí nghiệm với TTS Success 120SC Số cá thể thử (n)

Quần thể Song phương Đình Tổ

χ2 thực nghiệm

LC 50 và giá trị giới hạn 95% (dose×10 −2 )

Ri* * Ri*

463

0.72 7,464 (3)* (5,94- 8,91) 798 0.884 1.57 (3)* (1.32 -1.83) An Bình 511 0.866 3.34 (3)* (2.75- 4.01 ) Chú ý: (...)* là Số bậc tự do

LC 95

LC 95 / LKC

36,11

7,22

14.20

2,84

4.75 1 4,47 2.13

22.35

Ri* là tỉ số của LC 50 giữa các QT Ri* * là tỉ số giữa LC 95 với LKC Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy: - Các giá trị thu được để đánh giá mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với thuốc Sucess 120SC ở ba QT nghiên cứu là đáng tin cậy với P < 0.05

LC50 và giá trị giới hạn 95%

8 7

7.464

6 5

Song Phương

4

Đình Tổ

3

An Bình

3.34

2 1

1.57

0 Quần thể

Biểu đồ 3.2. Sự chênh lệch giá trị LC 50 giữa ba QT nghiên cứu với TTS Success 120SC - Sử dụng giá trị giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 với mức độ tin cậy P < 0.05 , từ kêt quả trên chúng tôi nhận thấy mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với loại TTS Success 120SC giữa ba QT nghiên cứu là khác

43

nhau, cụ thể dựa vào giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 ta thấy độ mẫn cảm của loại ấu trùng này ở QT Song Phương là thấp nhất (LC 50 = 7.464)sau đó đến QT An Bình (LC 50 = 3.34) và QT Đình Tổ thì có độ mẫn cảm cao nhất (LC 50 = 1.57) - Sử dụng chỉ số Ri* * để đánh giá mức độ kháng của ấu trùng ruồi đục lá ở QT nghiên cứu là QT Song Phương, QT Đình Tổ và QT An Bình, cho thấy giá trị Ri* * của các QT lần lượt là: 7.22, 2.84 và 4.47. Như vậy từ kết quả này có thể đánh giá là ấu trùng ruồi đục lá ở 3 QT này chưa biểu hiện tính kháng với loại TTS có hoạt chất spinosad. III.1.1.3. Kết quả thí nghiệm với thuốc Abamectin 1.8EC Kết quả xác định mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá L. sativae Blanchard tuổi 1 với TTS Abamectin 1.8EC của các QT nghiên cứu thể hiện qua giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 và giá trị LC 95 được trinh bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết Quả Giá trị LC 50 và LC 95 của loại thuốc Abamectin 1.8EC thí nghiệm đối với ấu trùng ruồi đục lá ở các Quần thể nghiên cứu. Quần thể Song phương

Số cá thể thử (n)

χ2 thực nghiệm

LC 50 và giá trị giới hạn 95% (dose×10 −2 )

Ri* * Ri*

LC 95

LC 95 / LKC

487

1.09 5,17 4.74 26,20 5,24 (3)* (4,38- 6,08) Đình Tổ 4.79 1.44 13.14 2,63 666 (3)* (0.85 - 2.04) 1 An Bình 473 2.08 3.56 2.47 22.12 4,42 (3)* (2.85- 4.30) Chú ý: (...)* là Số bậc tự do, Ri* là tỉ số của LC 50 giữa các QT Ri* * là tỉ số giữa LC 95 với LKC Từ kết quả bảng 3.3 cho thấy: - Các giá trị thu được để đánh giá mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với thuốc Abamectin 1.8EC ở ba QT nghiên cứu là đáng tin cậy với

44

P < 0.05

LC50 và giá trị giới hạn 95%

6 5

5.17

4 3.56

3 2 1.44

1 0

Quần Thể Song Phương

Đình Tổ

An Bình

Biểu đồ 3.3. Sự chênh lệch giá trị LC 50 giữa ba QT nghiên cứu với TTS Abamectin 1.8EC - Sử dụng giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 để đánh giá độ mẫn cảm giữa các QT nghiên cứu chúng tôi thấy: giá trị LC 50 của QT Song Phương lớn hơn so với 2 QT An Bình và Đình Tổ (gấp 1.45 lần so với QT An Bình và 3.6 lần so với QT Đình Tổ). Như vậy mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá của QT Song phương là thấp nhất so với QT An Binh và QT Đình Tổ với loại TTS này.Về mặt xác suất thấy không có sự gối lợp giá trị giới hạn 95% của LC 50 ở ba QT trên chứng tỏ ấu trùng ruồi đục lá ở ba quần thể này có mức độ mẫn cảm khác nhau với loại TTS Abamectin 1.8EC. - Sử dụng giá trị Ri* * để đánh ra mức độ kháng từ kết quả trên chúng tôi thấy ấu trùng ruồi đục lá ở ba QT này chưa biểu hiện tính kháng với loại thuốc Abamectin 1.8EC. III.1.1.4. Kết quả thí nghiệm với thuốc Forfox 400EC Kết quả xác định mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá L. sativae Blanchard tuổi 1 với TTS Forfox 400EC của các QT nghiên cứu thể hiện qua

45

giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 và giá trị LC 95 được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4: Kết Quả Giá trị LC 50 và LC 95 của loại thuốc Forfox 400EC thí nghiệm đối với ấu trùng ruồi đục lá ở các Quần thể nghiên cứu Số cá χ2 LC 50 và giá trị Ri* * LC 95 / LKC Quần thể thể thử thực giới hạn 95% Ri* LC 95 − 2 (n) nghiệm (dose×10 ) Song phương Đình Tổ

508

1.66 9.31 3.24 33.78 3.38 (3)* (8.03-10.62) 473 5.12 4.22 1.47 20.34 2.03 (3)* (2.71 - 5.96) An Bình 462 3.55 2.87 15.59 1.56 (3)* (2.01 -3.95) 1 Chú ý: (...)* là Số bậc tự do, Ri* là tỉ số của LC 50 giữa các QT Ri* * là tỉ số giữa LC 95 với LKC Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy: - Các giá trị thu được để đánh giá mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với thuốc Forfox 400EC ở ba QT nghiên cứu là đáng tin cậy với P < 0.05 LC 50 và giá trị giới hạn 95%

10 9 8

9.31

7 6 5 4 3

4.22 2.87

2 1 0 1 Song Phương

Đình Tổ

An Bình

Biểu đồ 3.4. Sự chênh lệch giá trị LC 50 giữa ba QT nghiên cứu với TTS Forfox 400EC - Sử dụng giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 để đánh giá độ mẫn cảm giữa các QT nghiên cứu với độ tin cậy P < 0.05 chúng tôi thấy kết quả LC 50 của QT Song Phương lớn hơn hai quần thể An Bình và Đình

46

Tổ rất nhiều (3.2 lần so với QT An Bình và 2.2 lần so với QT Đình Tổ) điều đó chứng tỏ tính mẫn cảm của ấu trùng ở QT Song Phương đã giảm sút mạnh hơn so với QT Đình Tổ và An Bình. - Sử dụng giá trị Ri* * để đánh giá mức độ kháng của ấu trùng ruồi đục lá ở ba QT nghiên cứu với loại thuốc này, từ kết quả ở bảng 3.1.4. chúng tôi nhận thấy ở cả ba QT này chưa biểu hiện tính kháng với thuốc Forfox 400EC. III.1.1.5. Kết quả thí nghiệm với thuốc Trigard 75WP Kết quả xác định mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá L. sativae Blanchard tuổi 1 với TTS Trigard 75WP của các QT nghiên cứu thể hiện qua giá trị LC 50 , giới hạn 95% của LC 50 và giá trị LC 95 được trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5: Kết Quả Giá trị LC 50 và LC 95 của loại thuốc Trigard 75WP thí nghiệm đối với ấu trùng ruồi đục lá ở các Quần thể nghiên cứu. Quần thể Song phương

Số cá χ2 thể thử thực (n) nghiệm

LC 50 và giá trị giới hạn 95% (dose×10 −2 )

Ri* * Ri*

LC 95

( LC 95

/ LKC

478

5.95 5.16 26.59 10,64 (3)* (3.10-7.60) 1 Đình Tổ 505 2.01 6.55 34.60 13,84 (3)* (5.44 -7.74 ) 1.27 An Bình 464 1.72 6.33 29.43 11,77 (3)* (5.28 -7.47) 1.23 Chú ý: (...)* là Số bậc tự do, Ri* là tỉ số của LC 50 giữa các QT Ri* * là tỉ số giữa LC 95 với LKC Từ kết quả bảng 3.5 cho thấy: - Các giá trị thu được để đánh giá mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá với thuốc Trigard 75WP ở ba QT nghiên cứu là đáng tin cậy với P < 0.05

47

)

LC50 và giá trị giới hạn 95%

7 6 5

6.55

6.33

5.16

4 3 2 1 0 1 Song Phương

Đình Tổ

An Bình

Biểu đồ 3.5. Sự chênh lệch giá trị LC 50 giữa ba QT nghiên cứu với TTS Trigard 75WP - Sử dụng giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 để đánh giá độ mẫn cảm giữa các QT nghiên cứu với độ tin cậy P < 0.05 kết quả là: + QT Song Phương có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50

là: 5.16×10 −2 , (3.10-7.60) ×10 −2 + QT An Bình có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là:

6.33×10 −2 , (5.28 – 7.47)× 10 −2 QT Đình Tổ có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 6.55×10 −2 , (5.44 -7.74)× 10 −2 . Như vậy QT Đình Tổ có giá trị LC 50 lớn nhất QT Song Phương có giá trị này nhỏ nhất, tuy nhiên về mặt xác suất thống kê chúng tôi nhận thấy giá trị giới hạn 95% của LC 50 ở ba QT này là có sự gối lợp nhau. Điều này chứng tỏ tính mẫn cảm với TTS Trigard 75WP của ấu trùng ruồi đục lá ở 3 QT nghiên cứu là không khác nhau. - Sử dụng giá trị Ri* * để đánh giá mức độ kháng của ấu trùng ruồi đục lá ở 3 QT nghiên cứu với TTS Trigard, chúng tôi nhận thấy ấu trùng ruồi đục lá ở ba QT nghiên cứu vẫn mẫn cảm với loại thuốc này.

48

* Tóm lại từ kết quả phân tích ở trên chúng tôi rút ra kết luận như sau: + Tính mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá ở ba QT nghiên cứu không có sự sai khác đối với hai loại TTS Sherpa 25EC và Trigard 75WP + Đối với TTS Forfox 400EC, Abamectin 1.8.EC và Success có sự sai khác tính mẫn cảm giữa các QT ấu trùng ruồi đục lá. + Trong 5 loại TTS làm thí nghiệm thì QT Song Phương đã thể hiện tính kháng cao với TTS Sherpa 25EC, với các loại TTS khác thì QT này vẫn có tính mẫn cảm cao. + Với 2 QT Đình Tổ và QT An Bình chúng vẫn mẫn cảm cao với 5 loại thuốc trừ sâu làm thí nghiệm. III.1.2. Mức mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá dòng kháng với 5 loại TTS. * Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả giá trị LC 50 , LC 95 của dòng chọn tạo với 5 loại TTS so với QT Song Phương. Loại TTS thí nghiệm Sherpa 25 EC

LC 50 và (giá trị giới hạn 95%) của Dòng chọn tạo 158.94 ×10 −2

QT Song Phương 51.161 ×10 −2

Ri*

Ri* *

3.1

153,85

Success

(95.67-254.19) ×10 −2 19.74 ×10 −2

(18.53-157.11) ×10 −2 7,464×10 −2

2.64

4.74

120 SC Abamectin

(13.51- 29.72) ×10 −2 14.802 ×10 −2

(5,94- 8,91) ×10 −2 5,17×10 −2

2.863

17.25

1.8EC Forfox 400EC

(9.63-22.38) ×10 −2 11.29 ×10 −2

(4,38- 6,08) ×10 −2 9.31×10 −2

1.21

5.71

Trigard 75WP

(7.56-15.94) ×10 −2 27.08 ×10 −2

(8.03-10.62) ×10 −2 5.16×10 −2

5.25

38.45

(14.89- 44.51) ×10 −2 (3.10-7.60) ×10 −2 Chú ý: Ri* là tỉ lệ LC 50 của dòng kháng với LC 50 của QT Song Phương 49

Ri* *

= LC

95

/ LKC

(tỉ lệ giữa giá tri LC 95 với LKC)

Kết quả bảng trên cho ta thấy giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50

với từng loại TTS của QT Song Phương và Dòng chọn tạo là:

- Đối với thuốc sherpa 25EC: QT song phương có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 51.161 ×10 −2 , (18.53- 157.11)×10 −2 Dòng kháng có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 158.942 ×10 −2 , (95.696-254.189) ×10 −2 - Đối với Success 120SC: QT Song phương có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 7,46×10 −2 , (5,94- 8,91)×10 −2 Dòng kháng có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 19.745 ×10 −2 , (13.508- 29.725) ×10 −2

- Đối với Abamectin 1.8EC: QT Song Phương có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 5,170×10 −2 , (4,378- 6,079)×10 −2 Dòng kháng có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 14.802 ×10 −2 , (9.63-22.38) ×10 −2 - Đối với TTS Forfox 400EC: QT Song Phương có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 9,307×10 −2 (8,034 -10,620)×10 −2 Dòng kháng có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 11.29 ×10 −2 (7.56-15.94) ×10 −2 - Đối với TTS Trigard 75WP QT Song Phương có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 5.16×10 −2 (3.10-7.60) ×10 −2

50

Dòng kháng có giá trị LC 50 và giá trị giới hạn 95% của LC 50 là: 2.70×10 −2 (14.89- 44.51) ×10 −2 Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy - Giá trị LC 50 của dòng kháng lớn hơn của QT Song Phương 3.1 lần, nhưng về mặt xác suất thống kê thì giá trị giới hạn 95% của LC 50 có sự gối lợp chứng tỏ tính mẫn cảm với TTS Sherpa 25EC của ấu trùng ruồi đục lá ở hai QT này là không khác nhau. - Giá trị LC 50 của dòng kháng lớn hơn của QT Song Phương 2.64 lần, nhưng về mặt xác suất thống kê thì giá trị giới hạn 95% của LC 50 không có sự gối lợp chứng tỏ hai dòng ruồi này có tính mẫn cảm với loại TTS Success 120SC là khác nhau. Giá trị LC 50 của dòng kháng lớn hơn của QT Song Phương 2.86 lần, nhưng về mặt xác suất thống kê thì giá trị giới hạn 95% của LC 50 không có sự gối lợp chứng tỏ hai dòng ruồi này có tính mẫn cảm với loại TTS Abamectin 1.8EC là khác nhau. Giá trị LC 50 của dòng kháng lớn hơn của QT Song Phương 1.21 lần, nhưng về mặt xác suất thống kê thì giá trị giới hạn 95% của LC 50 có sự gối lợp chứng tỏ hai dòng ruồi này có tính mẫn cảm với loại TTS Forfox 400EC là không khác nhau. Giá trị LC 50 của dòng kháng lớn hơn của QT Song Phương 5.25 lần, nhưng về mặt xác suất thống kê thì giá trị giới hạn 95% của LC 50 không có sự gối lợp chứng tỏ hai dòng ruồi này có tính mẫn cảm với loại TTS Trigard 75WP là khác nhau. Như vậy theo phân tích ở trên và bảng 3.1.2 chúng tôi rút ra một số kết luận là: - Độ mẫn cảm giữa dòng kháng và QT Song Phương đối với 3 loại TTS Success 120SC, Abamectin 1.8.EC và Trigard 75Wp là khác nhau.

51

- Đối với TTS Forfox 400EC thì độ mẫn cảm giữa hai dòng này là như nhau. Điều này cho ta thấy dòng kháng Cypermethrin không ảnh hưởng gì đến mức độ kháng với thuốc Forfox 400EC. - Ấu trùng ruồi đục là của dòng kháng vẫn thể hiện tính mẫn cảm cao đối với 4 loại thuốc Success 120SC, Abamectin 1.8EC, Forfox 400EC và Trigard 75W, tuy nhiên so với QT Song Phương, tính mẫn cảm của dòng kháng có giảm nhưng chưa biểu hiện tính kháng.Điều này có thể được giả thích bởi lí do sau: Do tính kháng chéo gây nên, hoặc do các alen kháng với các TTS khác không có tác nhân chọn lọc, nên vẫn còn duy trì trong QT gốc. III.1.3. Tình hình sử dụng TTS của nông dân tại những địa điểm nghiên cứu. Sự hình thành tính kháng TTS ở côn trùng là một hiện tượng tiến hóa sinh học ở mức độ quần thể. Bản chất của hiện tượng này là sự thay đổi tần số alen dưới áp lực chọn lọc của TTS. Ở QT ngẫu phối, sau lần đầu tiếp xúc với TTS, trong QT đã có sự phân hóa về khả năng chống TTS, nguyên nhân là do sự sai khác tự nhiên có bản chất di truyền về độ mẫn cảm với TTS giữa các cá thể trong quần thể. Trong sự hình thành và phát triển tính kháng thuốc, các loại TTS có vai trò là nhân tố chọn lọc. Áp lực chọn lọc càng lớn tần số alen kháng thuốc trong QT càng tăng, QT trở nên thích nghi hơn với TTS. Việc sử dụng TTS đã quyết định đến áp lực chọn lọc và ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển tính kháng, ảnh hưởng đến tốc độ phát triển, độ bền vững và tính kháng chéo của tính kháng TTS. Sự khác nhau giữa các địa phương việc sử dụng TTS có khác nhau về chủng loại, tần suất, liều lượng phun và phương thức sử dụng nên đã tạo ra một áp lực chọn lọc là khác nhau. Nên tính mẫn cảm của côn trùng gây hại với từng loại TTS ở các địa phương khác nhau là khác nhau. Vì vậy để giải thích cho sự chênh lệch mức độ mẫn cảm của ruồi đục lá ở những QT nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu

52

thập thông tin về tình hình sử dụng TTS thông qua phiếu điều tra, hoặc phỏng vấn trực tiếp người dân ở các địa phương nghiên cứu, từ đó làm cơ sở để đánh giá áp lực của chọn lọc ở từng QT. Kết quả điều tra được chúng tôi trình bày ở các bảng sau: Bảng 3.7: Chủng loại TTS được nông dân sử dụng tại ba địa phương nghiên cứu:

Nhóm thuốc

Song Phương (n=30) Số hộ % dùng

Địa phương nghiên cứu Đình Tổ An Bình (n=25) (n=30) Số hộ % Số hộ % dùng dùng

OP

1

3.30

2

8.00

-

-

Fipronil

5

16.67

-

-

-

-

Pyrthroid

26

86.70

10

40.00

2

6.67

BT

2

6.67

7

28.00

15

50.00

Carbamate

2

6.67

3

12.00

-

-

Abamectin

7

23.30

5

20.00

10

33.33

IRG

13

43.30

18

72.00

16

53.30

Oxadiazin

15

50.00

-

-

-

-

Cartap

2

6.67

-

-

-

-

Neo nicotinoid

3

10.00

-

-

-

-

Các nhóm khác

3

10.00

4

16.00

6

20.00

Từ kết quả điều tra ở bảng 3.7 chúng tôi nhận thấy: - Số lượng các thuốc trừ sâu thuộc các nhóm hoạt chất khác nhau được nông dân ở các địa điểm nghiên cứu là khác nhau, cụ thể là nông dân ở Song Phương sử dụng tới 12 hoatj chất, nông dân thuộc Đình Tổ sử dụng 7 hoạt chất và nông dân ở AN Bình sử dụng 5 hoạt chất - Trong số các nhóm TTS được nông dân dùng, chỉ có 4 nhóm TTS được nông dân cả ba địa điểm sử dụng đó là Pyrithroid, BT, Abamectin, IRG

53

- Trong số các nhóm TTS được các hộ nông dân sử dụng, tỉ lệ nhóm thuốc được nông dân sử dụng với tỉ lệ ≥50% số hộ điều tra sử dụng là khác nhau. Cụ thể là ở: Song Phương có 2 nhóm thuốc là Pyrithroid: 86.70%, IRG: 50% số hộ dùng. Đình Tổ có nhóm IRG: 72.00% An Bình có hai nhóm BT: 50%, IRG: 53.30% Kết quả này cho thấy áp lực của TTS lên sâu hại nói chung và ruồi đục lá nói riêng là khác nhau ở các địa phương khác nhau, điều này được thể hiện thông qua việc đánh giá tính mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá đuợc chúng tôi trinh bày ở phần trên. * Phương thức sử dụng TTS của người nông dân kết quả điều tra được chúng tôi tổng hợp ở bảng 3.8: Bảng 3.8: Phương thức sử dụng TTS Địa điểm nghiên cứu Song Phương Đình Tổ An Bình

Cách sử dụng Hỗn hợp (%) Đơn lẻ (%) 85,60 65,33 55,70

13,40 34,67 44.3

Từ kết quả bảng 3.8 cho thấy, các hộ nông dân chủ yếu dùng nhiều loại TTS cùng một lúc, như ở Song Phương số hộ dùng kiểu này chiếm tới 85.6%, ở Đình Tổ số hộ dùng hỗn hợp nhiều loại TTS chiếm 65.33% và sau đó đến An Bình số hộ dùng kiểu hỗn hợp là 55,7%. Có hai điểm cần chú ý ở đây khi dùng hỗn hợp các loại TTS: - Khi sử dụng hỗn hợp nhiều loại TTS có thể thuộc một nhóm thuốc, hay nhiều nhóm thuốc có cùng cơ chế tác động. - Mặc dù sử dụng hỗn hợp nhiều loại TTS nhưng liều lượng và tần suất phun vẫn được giữ nguyên như khi sử dụng thuốc đơn lẻ.

54

Như vậy, liên tục cùng một lúc nhiều loại chất độc tác động đến côn trùng gây hại nói chung và loài ruồi đục lá nói riêng gây lên một áp lực chọn lọc lớn, điều này có thể tác động đến sự xuất hiện tính kháng, tính kháng chéo và tính đa kháng ở sâu hại và loài ruồi đục lá này. * Tần suất phun TTS của nông dân: tần suất phun TTS trên cây rau, cây họ đậu của nông dân được chúng tôi thống kê bảng 3.9. Bảng 3.9. Tần suất phun và số lần phun TTS của nông dân ở các địa điểm nghiên cứu. Chỉ tiêu

Địa điểm nghiên cứu Song Phương Đinh Tổ Số hộ % Số hộ % nông dân nông dân sử dụng sử dụng Phun định kì

< 7 ngày/lần >7-<10ngày /lần >10ngày/lần

10 15 6

33,33 7 28.00 50.00 18 72.00 20.00 5 20.00 Số lần phun /một vụ rau

<7lần

7

23,33

5

>7-<10lần

15

50.00

>10- 15 lần > 15 lần

7 3

23.33 10.00

An Bình Số hộ % nông dân sử dụng 0 7 23

0.00 23,33 76,67

20.00

25

83,33

13

52.00

5

16,67

3 0

12.00 0.00

0 0

0.00 0.00

Qua số liệu bảng 3.9 cho thấy: - Tần suất phun <7 ngày/lần ở Đình tổ, có số hộ sử dụng tần suất này 28% số hộ, ở Song Phương số hộ phun với tần suất này là 33.33%, ở An Bình không có hộ nông dân nào sử dụng với tần suất này. - Tần suất phun >7 ngày/lần <10 ngày/lần, nông dân ở Đình Tổ sử dụng với tần suất này chiếm tỉ lệ là cao nhất (72%), sau đó đến Song phương

55

với tỉ lệ hộ dân sử dụng là 50%, người dân ở An Bình sử dụng với tần suất này là thấp nhất với tỉ lệ là 23.33%. - Tần suất phun >10 ngày/lần, nông dân ở An Bình sử dụng với tần suất này chiếm tỉ lệ cao nhất (76.67%), sau đó đến Song Phương và Đình Tổ đều có tỉ lệ các hộ nông dân sử dụng như nhau là 20%. Với số lần phun /1 vụ theo kết quả bảng 3.4.4 nhận thấy Dưới 7 lần/1 vụ thì ở An Bình chiếm tỉ lệ cao nhất là 83,33%, Đình Tổ chiếm tỉ lệ thấp nhất là 20%. Tần suất phun > 7 lần /vụ < 10 lần/vụ cao nhất là Đình Tổ với 52%, sau đó là Song Phương 50% và thấp nhất là An Bình 16.67%. Tần suất phun >10 lần/vụ <15lần/vụ thì ở Song phương chiếm tỉ lệ cao nhất là 23.33%, Đình Tổ là 12%, ở An Bình không có hộ nào sử dụng với tần suất này. Với tần suất > 15 lần/vụ thì chỉ có ở Song Phương khoảng 10%. * Từ kết quả điều tra tình hình sử dụng TTS của các hộ nông dân tại các địa điểm nghiên cứu chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Tại Song Phương người nông dân tạo áp lực TTS với sâu hại nói chung và loại ruồi đục lá nói riêng là lớn nhất sau đó đến Đình Tổ và nông dân ở An Bình tạo áp lực TTS với sâu hại là thấp nhất - Nhóm TTS gây áp lực lớn nhất với sâu hại mà được nông dân sử dụng ở các địa phương là khác nhau, cụ thể ở Song Phương nhóm thuốc gây áp lực lớn nhất với sâu hại là Pyrithroid, ở Đình Tổ và An Bình nhóm TTS gây áp lực lớn nhất đều là IRG. III.1.4. Thảo luận Các kết quả thí nghiệm đánh giá tính mẫn cảm ở các QT nghiên cứu, chúng tôi dựa trên cơ sở những hiểu biết về di truyền tính kháng thuốc của côn trùng gây hại và dựa trên kết quả của việc điều tra tình hình sử dụng thuốc trừ sâu của các hộ nông dân tại các địa điểm nghiên cứu.

56

* Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận thấy rằng, mức độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá ở ba QT nghiên cứu là không có sự sai khác với TTS Sherpa 25EC. Để giả thích cho kết quả trên, chúng tôi đưa ra những lí do sau đây: + Kết quả điều tra tình hình sử dụng TTS tại ba địa điểm nghiên cứu cho chúng tôi thấy, nông dân ở cả ba vùng đều sử dụng kết hợp nhiều loài TTS cho một lần phun với những kiểu tác động giống hoặc khác nhau, như ở Song Phương tỉ lệ các hộ dân sử dụng hỗn hợp nhiều loại thuốc cho một lần phun là 85.6%, Đình Tổ số hộ dùng theo kiểu này là 65.33% và An Bình là 55.7%, điều này giải thích được một phần nào tính mẫn cảm của 3 QT với Sherpa là tương đương nhau. + Theo kết quả điều tra tình hình sử dụng TTS Sherpa và các thuốc trong nhóm Pyr cũng như các TTS có cùng cơ chế tác động với loại thuốc này đã được xử dụng thường xuyên từ rất lâu ở cả ba QT. Vì vậy sự phát triển tính kháng cao với loại TTS này là điều dễ hiểu. + Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, tính kháng với Pyr rất bền vững. Vì vậy, mức kháng Pyr vẫn rất cao, ngay cả khi áp lực chọn lọc của loại thuốc này với QT đã giảm xuống. + Các cơ chế kháng chéo giữa các nhóm thuốc OP, Pyr và Car cũng góp phần không nhỏ vào sự hình thành và phát triển tính kháng với Pyr ở ba QT nghiên cứu. Từ những cơ sở trên, chúng tôi thấy rằng ở các QT nghiên cứu mức chịu áp lực với TTS Pyr ở ba QT là khác nhau vào thời điểm nghiên cứu, nhưng mức độ mẫn cảm với loại thuốc này vẫn không khác nhau. * Mức độ mẫn cảm với Trigar 75WP ở ba QT nghiên cứu. Theo kết quả ở phần 3.1.1 chúng tôi nhận thấy tính mẫn cảm với loại thuốc này của ấu trùng ruồi đục lá thuộc ba địa điểm nghiên cứu là như nhau điều này có thể giải thích dựa vào các lí do sau:

57

Dựa vào kết quả điều tra cho thấy, loại thuốc này không được nông dân ở các địa điểm nghiên cứu sử dụng. Lí do là loại TTS này chúng tôi thấy không có bán ở miền Bắc nước ta, tuy nhiên loại TTS này thuộc nhóm IRG cùng nhóm với Match, nên kiểu tác động của thuốc này có thể giống với những loại TTS cùng nhóm. Theo kết quả điều tra tỉ lệ số hộ nông dân sử dụng nhóm IRG ở ba địa phương nghiên cứu là rất cao, được sử dụng nhiều nhất ở Đình Tổ 18 hộ chiếm đến 72 % số hộ điều tra, sau đó đến An Bình 16 hộ chiếm 53.30% và Song Phương 13 hộ chiếm 43.30%. Tuy nhiên tần suất sử dụng TTS ở các địa phương nghiên cứu là khác nhau (theo kết quả điều tra ở bảng 3.7) .* Mức độ mẫn cảm với Success 120SC, Forfox 400EC và Abamectin 1.8EC của 3 QT ruồi đục lá nghiên cứu là khác nhau. Sự khác nhau này theo ý kiến chủ quan của chúng tôi là có thể do sự sai khác vệ tần suất sử dụng TTS giữa các địa phương nghiên cứu, dẫn đến sự sai khác tính mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá tại các QT nghiên cứu Điểm thứ 2 là success và Abamectin đều có nguồn gốc sinh học nhưng cơ chế gây độc cho loài ruồi này lại khác nhau, đây cũng có thể là căn cứ để giải thích được một phần nào về sự khác nhau về tính mẫn cảm với 2 loại thuốc này giữa 2 QT đó. * Dựa vào kết quả so sánh tỉ số LC 95 /LKC ở 3 QT nghiên cứu với thuốc có hoạt chất Cypermethrin, chúng tôi nhận thấy QT Song Phương đã kháng cao với thuốc Sherpa có hoạt chất Cypermethrin, QT Đình Tổ và QT An Bình vẫn mẫn cảm cao với loai TTS này. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đó của Nguyễn Thị Ngọc (2002), Lê Thị Kim Oanh (2003), Trần Phan Hữu (2004) và Mai Thị Thủy (2006) cùng trên một đối tượng, tuy nhiên tính kháng ở thời điểm này chúng tôi nghiên cứu có mức độ kháng cao hơn so với những năm trước thể hiện thông qua giá trị LC 50 (giá trị này năm 2004 theo Trần Phan Hữu là

58

8.33×10 −2 , năm 2006 theo Mai Thị Thủy là 40.30×10 −2 , kết quả nghiên cứu của chúng tôi là 51.161×10 −2 ). Vây theo tôi nguyên nhân dẫn đến tính kháng thuốc Sherpa 25EC ở QT Song Phương là: Do đặc điểm di truyền tính kháng nhóm Pyrithroid là rất bền vững nên tính kháng thể hiện lâu dài kể cả khi áp lực của thuốc đã giảm. Do loại thuốc này có cùng cơ chế tác động như với DDT và DDT đã được sử dụng từ lâu, nên ấu trùng ruồi đục lá ở QT Song phương đã thể hiện tính kháng cao vơi loại TTS này. Nhóm thuốc này được người dân ở đây sử dụng tương đối phổ biến từ nhiều năm nay, cụ thể năm 2004 tỉ lệ số hộ sử dụng nhóm thuốc này là 30.% [3], 2006 tỉ lệ này là 80.% [8] và năm nay là 86.7% và với tần suất phun thườn xuyên, nên tạo áp lực với thuốc Sherpa trên QT Song Phương là rất mạnh. Dẫn đến sự chọn lọc QT, các cá thể có chứa gen kháng thuốc ngày càng thích nghi tỉ lệ sống sót của chúng càng cao khi liên tục sử dụng loại thuốc này trên QT. Điều này có nghĩa là tính kháng ở QT này ngày càng phát triển. + Đối với QT Đình Tổ và QT An Bình chưa thể hiện tính kháng với thuốc Sherpa 25EC nhưng cũng đã giảm tính mẫn cảm so với các thuốc khác. Vậy nguyên nhân nào mà ở những QT này chưa thể hiện tính kháng với hoạt chất Cypermethrin. Điều này có thể được chúng tôi giải thích như sau: Từ kết quả điều tra chúng tôi thấy rằng ở 2 địa phương này số hộ nông dân sử dụng nhóm thuốc có hoạt chất Cypermethrin là thấp (ở Đình Tổ tỉ lệ là 40%, An Bình là 6,67%). Do vậy ở hai QT ruồi đục lá Đình Tổ và An Bình chưa thể hiện tính kháng với Sherpa 25EC. * Ấu trùng ruồi đục lá ở ba QT Song Phương, An Bình và Đình Tổ vẫn chưa biểu hiện tính kháng với các thuốc Forfox, Abamectin, Success và Trigard. Mặc dù theo kết quả điều tra những loại thuốc này cũng được các hộ nông dân sử dụng rất đa dạng như ở Đình Tổ số hộ sử dụng loại Abamectin là 20%, sử dụng nhóm IRG số hộ dùng chiếm tỉ lệ 72%... ở An Bình số hộ sử

59

dụng các loại thuốc này tương ứng là 53.3%, nhóm BT là 50%...[ theo kết quả điều tra tình hình sử dụng TTS chương III]. Vậy do đâu mà những QT vẫn chưa biểu hiện tính kháng với các nhóm thuốc này. Dựa vào những hiểu biết chúng tôi có thể đưa ra một số căn cứ sau: Thứ nhất mặc dù số hộ nông dân sử dụng chủng loại TTS đa dạng tuy nhiên có thể do tần suất sử dụng TTS chưa đủ để gây nên áp lực chọn lọc để hình thành tính kháng. Thứ 2 do tập quán sản xuất ở vùng nông thôn nước ta là nhỏ, lẻ mỗi hộ chỉ có một thửa ruộng với diện tích canh tác từ vài chục m 2 đến vài sào, việc tiến hành phun thuốc trừ sâu là không đồng thời giữa các hộ gia đình, đây là cơ hội cho cá thể mẫn sống sót và di nhập trong QT là nguyên nhân làm giảm tốc độ phát triển tính kháng. * Đối với dòng kháng TTS có hoạt chất Cypermethrin được chúng tôi duy trì trong phòng thí nghiệm, không có hiện tượng di nhập gen, luôn có sự tác động của chọn lọc qua mỗi thế hệ. Áp lực chọn lọc tăng lên bằng cách nâng dần nồng độ thuốc qua mỗi thế hệ chọn lọc, cứ liên tục như vậy làm cho tần số alen kháng thuốc trong QT tăng dẫn đến tính kháng Cypermethrin đã phát triển mạnh trong dòng ruồi này và mạnh hơn cả các QT tự nhiên. III.2.Tạo dòng kháng Cypermethrin Chúng tôi tiến hành chọn tạo dòng kháng với thuốc có hoạt chất Cypermethrin với một số lí do sau: + Các TTS có hoạt chất này thuộc nhóm Pythroid có liên quan nhiều đến sự hình thành tính kháng và tính kháng chéo ở sâu hại. + Cần tiến hành nghiên cứu cơ chế di truyền tính kháng của ấu trùng ruồi đục lá với hoạt chất này. Việc chọn tạo dòng kháng của ruồi đục lá với TTS có hoạt chất Cypermethrin được tiến hành bằng phương pháp chọn lọc QT dưới áp lực chọn lọc của TTS Sherpa 25EC. Trước tiên để xác định được liều nhằm loại bỏ cá

60

thể mẫn chúng tôi dựa vào

1/ 2

liều khuyến cáo của thuốc (0,05ml thuốc trong

100ml nước) và QT ở thế hệ xuất phát là QT tự nhiên ở Song phương. Những cá thể sống sót được chúng tôi giữ lại nuôi tạo thế hệ sau. Do quỹ thời gian có hạn chúng tôi mới chỉ chọn lọc tạo dòng kháng TTS có hoạt chất Cypermethrin đến thế hệ thứ 12. Kết quả được chúng tôi trình bày ở bảng 3.9. Bảng 3.10: Kết quả chọn tạo dòng kháng TTS với hoạt chất Cypermethrin. Thế hệ

Ngày lấy trứng Nồng độ thuốc thử % (tương ứng với số ml thuốc Sherpar 25EC/100ml nước)

Tỉ lệ sống (%).

F1

03/03/2009

0.05 ml Sherpar 25EC/100ml nước

93.71%

F2 F3

18/03/2009

0.10 ml Sherpar 25EC/100ml nước

88.01%

02/04/2009

0.20 ml Sherpar 25EC/100ml nước

62.64%

F4

17/04/2009

0.30 ml Sherpar 25EC/100ml nước

77.38%

F5 F6

02/05/2009

1.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước

60.44%

18/05/2009

2.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước

60.55%

F7

03/06/2009

3.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước

55.63%

F8

19/06/2009

4.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước

49.64%

F9

03/07/2009

5.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước

46.61%

F 10

18/07/2009

6.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước

41.70%

F 11

03/08/2009

7.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước

42.05%

F 12

20/08/2009 8.00 ml Sherpar 25EC/100ml nước 41.16% So với kết quả chọn tạo dòng kháng của Mai Thị Thủy thì tốc độ hình thành tính kháng kháng ở bảng trên là cao hơn, thể hiện thông qua áp lực của TTS và tỉ lệ sống sót của ấu trùng ruồi đục lá.Theo Mai Thị Thủy với nồng độ thuốc là 4% tỉ lệ sống sót của ấu trùng ruồi đục lá là 10.82%[8] theo kết quả bảng trên nồng độ thuốc là 4% thỉ tỉ lệ sống là 49.64% và với nồng độ thuốc là 8% thì tỉ lệ sống sót là 41.16%. Chứng tỏ khả năng chịu đựng với loại thuốc của ấu trùng ruồi đục lá là tăng lên đáng kể so với năm trước.

61

Nguyên nhân gây lên sự sai khác về tốc độ chọn lọc tính kháng của ấu trùng ruồi đục lá dòng chọn tạo của chúng tôi so với Mai Thị Thủy có thể là do ở địa phương này vẫn sử dụng các loại TTS có chứa hoạt chất Cypermethrin, nên đã làm tăng khả năng chống chịu với loại thuốc này, dẫn đến tốc độ chọn tạo dòng kháng thuốc có hoạt chất này lớn hơn với những năm trước.

62

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Dựa vào kết quả nghiên cứu và những phân tích ở trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: * Ấu trùng ruồi đục lá Liriomyza sativae Blanchard tuổi 1 của các QT tự nhiên: QT Song Phương, QT An Bình và QT Đình Tổ không có sự khác nhau về mức độ mẫn cảm với 2 loại TTS nghiên cứu là Sherpa 25EC và Trigard 75WP và chúng đã có mức độ mẫn cảm khác nhau với 3 loại TTS Success 120SC, Abamectin 1.8EC và Forfox 400EC. * Ấu trùng ruồi đục lá của QT Song Phương đã thể hiện tính kháng cao với thuốc Sherpa 25EC, với 4 loại TTS còn lại thì vẫn thể hiện tính mẫn cảm cao. Ấu trùng ruồi đục lá của QT Đình Tổ và An Bình thì vẫn thể hiện tính mẫn cảm cao với 5 loại TTS nghiên cứu. * Các hộ nông dân ở các địa điểm nghiên cứu đều sử dụng TTS với nhiều chủng loại, liều lượng cao, tần suất phun và phương pháp sử dụng còn tùy tiện không thống nhất. Đề nghị Với những kết luận trên chúng tôi đưa ra một số đề nghị sau. Không sử dụng TTS có hoạt chất Cypermethrin để trừ sâu ở QT Song Phương vì ở QT này đã thể hiện tính kháng cao với loại TTS này. Tiếp tục nghiên cứu tính mẫn cảm của ruồi đục lá ở nhiều QT khác nhau với nhiều loại TTS qua nhiều thế hệ Rất cần thiết tạo một dòng mẫn cảm để đánh giá mức độ kháng của ruồi đục lá với các nhóm TTS và nghiên cứu cơ chế di truyền tính kháng ở loài ruồi này.

63

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.

Trịnh Đình Đạt, Chu Văn Mẫn, Vũ Thị Loan, Tạ Toàn (1993), “Xác định mức độ và đặc điểm di truyền tính kháng TTS của muỗi Culex quinepue fasciatus Say”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, tháng 1/1993, 26-27.

2.

Trần Bá Hoành (1985), Học thuyết tiến hóa, NXB Giáo Dục

3.

Trần Phan Hữu, 2004, “Góp phần nghiên cứu ruồi đục lá AGROMYZIDAE hại rau ở vùng Hà Nội và phụ cận”, luận văn thạc sĩ khoa học sinh học ĐHKHTN

4.

Lương Thị Liên, 2002, “Góp phần nghiên cứu tính kháng TTS và hiện tượng đa hình enzym esterase của ba QT sâu tơ ở ngoại thành Hải Phòng”, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội.

5.

Đặng Thị Thanh Mai (2002), “Góp phần nghiên cứu tính kháng TTS của ba QT sâu tơ ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học Trường ĐHSP Hà Nội.

6.

Nguyễn Thị Ngọc 2002, “Đánh giá hiệu lực phòng trừ của một số TTS đối với ruồi đục lá hại rau ở vùng Hà Nội và phụ cận”, Luận Văn Thạc Sĩ Nông nghiệp, Trường ĐH Nông Nghiệp 1 – Hà Nội.

7.

Tào Minh Tuấn, Đặng Hữu Lanh (2003), “Sử dụng giá trị tỉ lệ giữa LC 95

và LKC để đánh giá tính kháng TTS của sâu tơ”, Báo cáo khoa học

toàn quốc lần thứ 2 những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản khoa học, Hà Nội. tr1053-1056. 8.

Mai Thị Thủy, 2006 “Góp phần nghiên cứu tính kháng một số loại TTS của

ba QT ruồi đục lá ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Luận văn

thạc sĩ khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội.

64

9.

Nguyễn Đình Thông, 2006, “Nghiên cứu đánh giá mức độ mẫn cảm với một số loại TTS của bọ phấn ở vùng Hà Nội và phụ cận”, Luận Văn Thạc Sĩ Nông nghiệp, Trường ĐHNN 1- Hà Nội.

10.

Nguyễn Trần Oánh, Nguyễn Văn Viên, Bùi Trọng Thủy, Giáo trình thuốc bảo vệ thực vật quản lý và sử dụng, 29- 49 (ĐHNN 1 Hà Nội).

11.

Tạp chí chuyên ngành của Cục Bảo Vệ Thực Vật năm 2002 và năm 2003.

Tiếng Anh 12.

Blair. D.Siegfried and Michael E.Scharf (2001) "Mechanisms of organophosphate resistance in insest, Biochemical of insecticide action and resistance" Springer Verlar Berlin Heidenberg, 269-293.

13.

Cheng. E. Y, chou. T. M and kao. C. H. 91984), Insecicide resistance study in Plutella xylostella (L.), The induction cross resistance and Glutation-S- Transperance in relation to Mevinphos resistance, J, Agric, Res, China, 33-73.

14.

Eckert. W.Joseph and sisler. D. hugh (2000), Genetic, biochemical, and physiological mechanisms of resistance to pesticides, The national academy of sciences, 45- 53.

15.

FAO (1990), Reocomended methods for measurement of pest resistance for pesticides, plant protction bullentin, 76- 81.

16.

Field L. M.Blackman R.L and Devonshire A.L (2001), “Evolution of amplified esterrase genes as a mode of insectiside resistance in Aphids” Biochemical sites of insectide action and resistance, Springen 209- 220.

17.

Frederick. W, plapp. J. R (1986), Genetics and Biochemistry of insecticide resistance: strategies and tactic for management, National academy press, Washington D.C, 157- 169.

65

18.

Georghou G.P.Alqel. Lagunes – Jejede (1991) “The occurrence of resistance to peticcides in Arthropods”, FAO,11-17 and 201-205.

19.

Georghiou. P. George and Taylor. E. Charles (1986), Factores influencing the evolution of resistance, pesticide resistance: strategies and tactic for management, National acdemy press, Washington D.C

20.

Gunning. V. Robin and Moores. D. Grahan, Insensitive Acetyl cholinesterase as sites for resistance to Organophosphates and Carbamates in insects: insensitive Acetyl cholinesterrase confers resistance in Lepidoptera, Biochemical sites of insecticidi action and resistance.

21.

Hemingway. J (1983), Biochemical studies on Malathion resistance in Au. Arabiensts from Sudan, J, Iran of soia, Trop, Med and Hyg 71 (1), 106-109.

22.

Heisswolf. S. Houding B.T and Deuter P.L (1986) “Adecate of intergrated pest management (IPM) in vegetable southern Queenland Australia”, Proceeding of the third internation workshop, Malaixia, 228- 233.

23.

Mason, GA.M.W.Johnson and B.E. Tabashnik (1978) “Susceptibity of Liriomyza sativae and Liriomyza trifolii (Diptera: Agromyzidae) to permethrin and Fenvalerate” Entomological society America, pp, 1262- 1266.

24.

Miyata. T, Saito. T and Noppun. V (1986), Studies on the machanism of DBM resistance to insecticide, DBM and other Crucifer pest, Proceedings of the second international worshop, Taiwan, Taiwan, 42,383-389

25.

Motoyama. N, suganuma. T, and Maekoshi. Y (1990), Biochemical and physiological characteristics of insecticide, resistance in DBM, DBM

66

management, Proceedings of the second internatonal worshop, Taiwan, 45: 415-418 26.

Diamond back moth, Facully, Horti, Chiba Uni Japan, 45: 411- 418.

27.

Pasteur. N and Singre.G (1975), Esterase polymophism and sensitivity of

Dursban

Organopphosphate

insecticides

in

Culex

pipiens

populations, J, Bio, Gen, 13, 789- 803. 28.

Sharma, R.K,A.Durazo and K.S. Mayberry (1980) “Leafminer control increaes summer squash yields” California Agriculture, 21- 22.

29.

Scott. J. A (1995), The molecular genetics of resistance, resistance as a response to stress, Florida Entomologist, 78 (3), 388- 410.

30.

Scott. J. G (2001), Cytocrom P 450 mono oxygenases and insecticide resistance; Lesson from CYP6D1, Biochemical sites of imsecticide action and resistance springer, 255-363.

31.

Shimabuku. R. S, Mau. R. F. L and Gusukuma. Minuto. L (1996), DBM. Feeding preference among commercial varieties of head cabbage, proceedings of the third international worshop, Kuala Lumper, Malaysia.

32.

Sun. C. N, Wu. T. K, Chen. J. S and lee. W. J (1986), Insecticide resistance in DBM, DBM management, proceedings of the first international worshop, Tainan, Taiwan, 34: 359- 371

33.

Tabashnik. B.E. and Cushing. N.L. (1987) “Leaf resdue as topical biosay, for assessing insecticide resistance in the DBM plutella xylostella” L, FAO plant prot, Bull (35) 13-14.

34.

Tadashi Miyata, Virapong Noppun Testsuo Saito “Inherritance of resistance to phenthoate and Fenvalerate in Diamond back and Management of Insecticide Resistance”, Proceeding of the second International 1990. 447-482.

67

35.

Yuhzoh Mori and Katsuki Imai “Indentification of mutation in the housetly para type sodium channel gene associated with knocdown resistance (kdr) to Pyrethroid insecticides” Mol.Gen. Genet 252; 51-60

36.

Robert. M. May and Andrew. P. Dobson (1996), Population dynamics and the rate of evolution of pesticide resistance, Pesticide Academy Press, Washington, D.C, 170- 194.

37.

Rueda and Shelton, Global crop pests, Cornell international for food, Agricultural development.

68

MỤC LỤC Trang

69