Lezione 2

Coltura su terreno solido (piastra)

La piastra Petri coperchio

Uso normale

base Piccoli spaziatori permettono la circolazione dell’aria

Capovolta

Preparazione di piastre con terreno di coltura 1. Il terreno agarizzato, liquefatto, viene versato in piastra e lasciato solidificare

2. Il collo della botttiglia viene passato sulla fiamma

3. Il coperchio della piastra viene sollevato, il minimo necessario, inclinato e tenuto sopra la base della piastra.

4. Viene versato il terreno in piastra, circa 20 ml/piastra.

Marcare la piastra La piastra (così come la beuta o la provetta) deve essere marcata con dettagli riguardanti:  mezzo di coltura  data  provenienza dell’inoculo Perché questa marcatura va fatta sulla base della piastra, e non sul coperchio?

Colonie batteriche: crescite su terreni solidi

Microrganismi in fase planctonica seminati in numero appropriato su un terreno solido agarizzato si riproducono e, dopo 18-24 ore di incubazione, formano colonie contenenti circa 106 cellule. In condizioni ottimali, ogni colonia origina da una singola cellula. Le colonie microbiche hanno caratteristiche morfologiche (dimensioni, colore, forma), ma anche consistenza, odore, ed altro, che le rendono caratteristiche e sono un importante parametri per la loro identificazione e classificazione.

Proprietà dell’agar nei terreni solidi



agente solidificante (solidifica a 38 °C e fonde a 84 °C).



inerte ed atosicco per i microrganismi.

 all’ 1,5-2,0 % la superficie del terreno è sufficientemente umida da permettere la crescita dei microrganismi ma abbastanza asciutta da impedirne alle cellule di muoversi; le colonie restano separate. 

il gel ostacola il movimento dei microrganismi all’interno del terreno ma consente la diffusione delle sostanze nutritive.

Principali utilizzi dei terreni solidi Le piastre contenenti terreno agarizzato vengono utilizzate principalmente per:  Ripassare (strisciare) colture batteriche  Effettuare isolamenti di microrganismi  Effettuare conteggi di microrganismi vitali  Saggiare particolari capacità di crescita dei microrganismi

Tecnica di isolamento su piastra

Il terreno solido è un ottimo mezzo su cui ottenere l’isolamento di microrganismi e la loro crescita come colture pure. Si prelevano cellule da una piastra o da una coltura liquida e le disperdiamo (striscio, diffusione, inclusione) su un terreno solido, per ottenere la crescita di colonie isolate. Partendo da una di queste colonie isolate, si ripete l’operazione un certo numero di volte.

Conteggio di microrganismi su piastra o conta vitale (viable count)

Misura il numero (coltivabili).

di

cellule

vitali

Occorrono generalmente almeno 24 ore perché le colonie siano contabili. Generalmente si contano solo le piastre con 25-250 colonie.

Principi sui quali si fonda la determinazione della carica microbica su piastra

2. L’inoculo originale è omogeneo 4. Non vengono seminati aggregati cellulari 6. Ogni singolo batterio, crescendo, si divide e produce una singola colonia

Limiti della determinazione della carica microbica su piastra 1. Non tutte le cellule seminate crescono con la stessa velocità 3. Colonie di piccola dimensione possono sfuggire al conteggio 5. Cellule vicine possono dare origine ad una solo colonia 7. E’ difficile prevedere il numero delle cellule vitali (stima del fattore di diluizione necessario) 9. Errore analitico

Errore analitico 1. Campionamento 3. Pesatura 5. Diluizione e pipettatura (adesione dei microrganismi alla pipetta, calibrazione pipetta, errori di lettura, ecc.) 7. Insufficiente omogenizzazione 9. Errore nella semina (caratteristiche del terreno, spessore, umidità, ecc.) 11. Errore di conteggio

Le diluizioni In quasi tutti gli ambienti, i microrganismi sono presenti con un numero molto elevato di individui. Per ottenere un conteggio il più preciso possibile spesso è spesso necessario effettuare una diluizione del campione da analizzare. Il modo di esprimere i risultati cambia a seconda della natura del campione (liquido, aria, solido, superficie).

Densità cellulare espressa per unità di volume

fattore di diluizione

Densità cellulare espressa per unità di peso 25 g di campione vengono omogenizzati in 225 ml di un fluido di diluizione (diluizione 1:10 (w/v)). 1 ml

10-1

campione omogenato

1 ml

0,1 ml

0,1 ml

9 ml

9 ml

10-2

10-3

52

57

Numero di colonie contate

Formula applicata: C1 + C2 2

x

1 diluizione

x

1 volume piastrato (ml)

= CFU / g

Esempio: 52 + 57 2

x

1 10-3

x

1 0,1 ml

=

5,5 x 105 CFU / g

Densità cellulare espressa per unità di superficie Viene campionata un’area di 5 cm2. Il campione è rappresentato da un tampone, da una escissione o da un lavaggio della superficie sospeso in un volume di 10 ml di fluido di diluizione.

1 ml

0,1 ml

0,1 ml

1 ml

9 ml

9 ml

campione

52

57

Numero di colonie contate

Formula applicata: C1 + C2 2

Vol iniziale di sospensione (ml)

x

area campionata (cm2)

Esempio: 52 + 57 2

x

10 ml 5 cm2

x

x

1 diluizione

1 10-2

x

x

1 0,1 ml

1

= CFU / cm2

volume piastrato (ml)

= 1,1 x 105 CFU / cm2

L’isolamento può essere una procedura semplice Microbiologia clinica: un caso di sospetta meningite   

La causa è spesso il batterio Neisseria meningitidis. Si preleva del liquido spinale. Esame microscopico (N. meningitidis è un diplococco gram-negativo).



Coltivazione del microrganismo su piastre di terreno ricco in presenza di CO2. N. meningitidis

 

S. epidermidis

Conferma dell’identificazione mediante differenti test di crescita e biochimici (caratterizzazione fenotipica). Caratterizzazione molecolare.

….. oppure una procedura complessa La comunità microbica del colon umano  E’ una comunità numerosa (1011 cellule per g di peso umido) e varia (più di 400 specie).  Si preleva materiale dal colon.  L’esame microscopico rivela una composizione microbica complessa.  Coltivazione e isolamento dei microrganismi in terreno solido ricco di polisaccaridi e proteine in anaerobiosi e in presenza di N2, CO2 e H2. Colture di arricchimento particolari per gli archea metanogeni colici.  La coltivazione, isolamento e caratterizzazione fenotipica di tali microrganismi ha portato all’identificazione di numerosi generi e specie già noti ma anche di nuovi generi e specie.  Fingerprinting molecolare.

….. oppure problematico Una comunità microbica marina Per questi microrganismi le condizioni di coltura usualmente adottate per organismi di diversa origine non sono ottimali o addirittura risultano tossiche. Utilizzo di terreni poveri di nutrienti. Eliminazione di metalli pesanti tossici dal terreno di coltura. Sostituzione dell’agar con altri supporti di crescita.

COLTURE ANAEROBICHE L’effetto dell’ossigeno atmosferico sulla crescita microbica è strettamente correlato al potenziale di ossido-riduzione (potenziale redox o O-R) del terreno di coltura. Un terreno con un rapporto H/O maggiore di quello presente nell’acqua (2/1) è fortemente ridotto ed ha un potenziale O-R negativo, un terreno fortemente ossidato ha un potenziale O-R positivo. Alcuni batteri anaerobi possono comunque essere coltivati eliminando l’ossigeno dall’ambiente o aggiungendo al terreno composti riducenti, che abbassano l’O-R.

RAPPORTO TRA OSSIGENO LIBERO E CRESCITA MICROBICA La richiesta di ossigeno gassoso dei batteri può essere valutata facendo crescere i microrganismi in provette contenente agar-germi o agar-shake.

Gradiente di ossigeno

+

(a) aerobi obbligati (b) anaerobi (c) aerobi facoltativi (d) microaerofili (e) anaerobi aerotolleranti

-

La coltivazione di batteri anaerobi

•

Si elimina l’ossigeno dal terreno di coltura bollendolo per 10 min, si raffredda rapidamente, si fa un abbondante inoculo, senza agitare, e si stratifica sul terreno olio minerale, quindi si chiude ermeticamente il contenitore (prove di fermentazione).

•

Si aggiunge al terreno un agente riducente (sodio tioglicollato) che reagisce con l’ossigeno e aiuta a mantenere gli enzimi nella forma ridotta (brodi di coltura non chiusi ermenticamente e agar in piastra).

Giara sotto vuoto E’ possibile utilizzare particolari contenitori come le giare per anaerobiosi, che vengono prima svuotati della sua atmosfera, poi al suo interno viene aperto un GasPack, che sviluppa idrogeno.

In alternativa si usa un incubatore anaerobico, riempito con CO2 idrogeno o azoto.

Camera anaerobica Quando le colture devono essere manipolate si usano cabine anaerobiche a guanti.

Conservazione dei microrganismi

Una volta ottenuta una coltura pura di un microrganismo, possiamo conservarla per futuri utilizzi.

Obbiettivi della conservazione dei microrganismi La conservazione di ceppi microbici nel tempo deve garantire: 1. sopravvivenza 3. stabilità genetica e fisiologica

Conservazione mediante propagazione su piastre?

La propagazione su piastre soddisfa le esigenze di sopravvivenza e stabilità?

Conservazione mediante batteriostasi

Sopravvivenza e stabilità possono essere mantenute nel tempo adottando condizioni che facilitano la batteriostasi. La batteriostasi può essere ottenuta mediante: •

Refrigerazione

•

Essiccamento

Conservazione per brevi periodi (qualche mese): refrigerazione a 4-5 °C I microrganismi vengono fatti crescere e poi conservati su terreno solido Aerobi: - in superfice su agar inclinati Anaerobi facoltativi: - infissi in agar (non inclinati), eventualmente ricoperti di paraffina Anaerobi stretti: - infissi in terreni fortemente ridotti (presenza di tioglicollato) e ricoperti di paraffina Per ovviare alla produzione di acidi da parte del microrganismo il terreno viene tamponato.

Conservazione per lunghi periodi (diversi anni): congelamento I microrganismi vengono uccisi dal congelamento, ma la maggior parte di essi sopravvive se congelati in presenza di glicerolo (sterile) in rapporto 1:20 e vengono poi conservate a -20 °C o temperature inferiori.

Minore la temperatura più lungo il periodo di conservazione. Si possono utilizzare congelatori speciali (-80 °C/-100 °C), oppure l’immersione in azoto liquido (-200 °C).

Tecnica di essiccazione mediante liofilizzazione La tecnica di liofilizzazione o freeze-drying prevede che la coltura microbica venga: 3) risospesa, all’interno di una fiala di vetro, in latte sterile o siero di sangue o altre sostanze egualmente protettive; 5) velocemente congelata (in azoto liquido oppure in un miscuglio di ghiaccio secco e alcol). 3) essiccata mediante sublimazione 4) infine la fiala viene sigillata sotto vuoto e conservata a tambiente.

Reperimento diparticolari ceppi microbici: le ceppoteche Collezioni di ceppi microbici: 

American Type Culture Collection – ATCC



Belgian Coordinated Collections of Microorganisms – BCCM



E. coli Genetic Stock Center – CGSG