Lezione 7

Studio delle comunità microbiche

La coltivazione in laboratorio dell’insieme dei microbi presenti in popolazioni miste di origine ambientale provoca cambiamenti sostanziali nella loro composizione. Controllare tali cambiamenti è praticamente impossibile. Per questo motivo si è storicamente preferito isolare i singoli microrganismi in colture pure; una procedura che ha portato a uno straordinario progresso della conoscenza degli aspetti fisiologici e genetici dei microrganismi, ma che ha fortemente sacrificato gli aspetti ecologici.

Per la coltivazione in laboratorio di alcuni microrganismi le difficoltà sono enormi. Inoltre i microbi cresciuti in laboratorio non si comportano come nel loro ambiente naturale, dove per esempio la disponibilità di nutrienti è di solito più limitata e irregolare, ed è difficile ricreare le interazioni con altri organismi (microbi e altri) che si verificano nel sito originale.

In alcuni casi, il confronto della composizione microbica di un campione ambientale mediante osservazioni microscopiche e analisi degli isolati in colture pure mostrava che, anche adottando ingegnose tecniche di selezione e arricchimento, solo una piccola frazione dei microrganismi originali poteva essere coltivata.

Cause della non coltivabilità dei microrganismi ambientali  Il terreno approntato non contiene tutti i nutrienti necessari.  Il terreno è troppo ricco.  Il terreno contiene sostanze tossiche per il microrganismo.  L’atmosfera utilizzata non è adatta.  il microrganismo è incapace di crescere in coltura pura.

Esempio di un sito inquinato Sito inquinato da un particolare combustibile e dove sono presenti microrganismi in grado di degradarlo. I batteri crescono, Terreno di coltura minimo, combustibile alcune componenti come principale fonte di carbonio. del combustibile scompaiono. L’analisi della popolazione batterica evidenzia la presenza di tre o quattro tipi di microrganismi rispetto alle centinaia presenti nel suolo inquinato. Spesso dopo la fase di crescita nel terreno di arricchimento non si riescono ad isolare le componenti microbiche sullo stesso terreno agarificato. Questo risultato fa pensare che più di un microrganismo partecipi alla reazione di degradazione contribuendo in maniera specifica e differenziata: separando i microrganismi si impedisce il processo degradativo e la crescita batterica. Queste cooperazioni microbiche sono definite consorzi.

I consorzi Nei consorzi è attivo un fenomeno definito sintrofia. La sintrofia è l’interazione tra due o più microrganismi che rende possibile la degradazione di un substrato che nessuno dei singoli microrganismi sarebbe in grado di utilizzare. Il problema è di tipo energetico. Un primo microrganismo compie la prima parte della reazione di degradazione che è energeticamente svantaggiosa (valore positivo di energia libera), per cui il processo non andrebbe avanti. Ma se il prodotto di questa prima reazione viene utilizzato come substrato da un secondo microrganismo la reazione torna ad essere energeticamente vantaggiosa (valore negativo di energia libera); il processo degradativo procede.

Analisi della composizione di una comunità microbica E’ necessario adottare nuovi strumenti di analisi di comunità microbiche che permettano di evidenziare la presenza di tutti i componenti, anche di quelli che risultano, per quanto detto in precedenza, difficilmente isolabili e coltivabili in laboratorio. Si può utilizzare l’analisi di sequenza dell’rDNA 16S.

Analisi molecolare di comunità microbiche Fasi (1, 2, 3 e 4) dell’analisi di biodiversità di una comunità microbica mediante PCR.

1. 2.

1. 2. 3. 4. 5.

Clonaggio della popolazione di amplificati in un vettore Trasformazione di un ospite batterico Selezione trasformanti Purificazione DNA vettore Sequenziamento

3. 4a.

4b.

I campioni 1, 2 e 4 hanno una banda (gene) comune, mentre i campioni 2 e 3contengono una banda unica.

Sequenziando le bande di amplificato si costruisce un’albero filogenetico.

Analisi delle sequenze amplificate 1

Profilo DGGE

2

Le bande principali vengono escisse e sequenziate

3

L’analisi filogenetica identifica i microrganismi

Costruzione di alberi filogenetici utilizzando i dati di sequenza

Il possibile risultato dell’analisi di una particolare comunità microbica

Sequenze tipizzanti L’analisi delle sequenze di RNA ribosomiale ha rivelato la presenza di sequenze tipizzanti (signature sequences). Sulla base di queste sequenze possiamo progettare oligonucleotidi che sono specifici per gruppi di batteri (per es., genere, specie oppure ceppo). Queste oligonucleotidi possono essere usati come sonde specifiche (sonde filogenetiche). L’oligonucleotide viene marcato con un colorante fluorescente e diventa una sonda che viene usata con cellule batteriche permeabilizzate così che possa penetrare all’interno della cellula e legarsi al bersaglio: l’RNA ribosomale nei ribosomi. In seguito all’ibridazione della sonda le cellule diventano uniformemente fluorescenti e possono essere osservate al microscopio a fluorescenza.

Sonde oligonucleotidiche In teoria molte sequenze differenti possono essere usate come sonde per analisi filogenetiche. Queste sequenze devono avere l’unica caratteristica di essere uniche a livello tassonomico desiderato. Nell’analisi a livello di genere e a volte di specie, vengono preferenzialmente utilizzate le sequenze di geni dell’RNA ribosomale, spesso quelle dell’rRNA 16S.

FISH La tecnica che utilizza le sonde fluorescenti su cellule intere viene detta FISH (fluorescent in-situ hybridization) e può essere applicata direttamente a cellule in coltura o in ambiente naturale. La tecnologia FISH è ampiamente usata in ecologia microbica e diagnostica clinica. In ecologia, la FISH può essere impiegata per l’identificazione microscopica e per rintracciare i microrganismi direttamente nell’ambiente, consentendo di acquisire migliori conoscenze sulla composizione delle comunità microbiche e sul ruolo di specifici microrganismi in processi naturali.

FISH di un campione di flora batterica mista (E. coli, Bordetella e Legionella) mediante una sonda batterica aspecifica (verde) e una sonda specifica per Legionella (rossa). Legionella

Bordetella E. coli