Laboratorio De Inmunologia

LABORATORIO DE INMUNOLOGIA Existen diferentes técnica de laboratorio que permiten a los medico obtener los resultados de los exámenes para poder dar un diagnostico y Tto. De la enfermedad inmunológica, reumatológica o las musculopatias en Gral. Estas se pueden dividir en 5 grandes grupos: 1. técnicas de autoinmunidad por inmunofluorescencia En Gral. la mayoría de las enfermedades reumatológicas son autoinmunes y el organismo produce anticuerpos contra el mismo cuerpo. La más conocida es la inmunofluorescencia, mediante esta técnica se realizan los exámenes como: a. determinación de anticuerpos antinucleares (ANA) b. determinación de anti DNA (DNAn) c. determinación de anticuerpos antimitocondriales (AMA) d. determinación de anticuerpo antimúsculo liso 2. técnicas nefelométrica a. equipamiento que mide la luz dispersas por las proteínas o antígeno anticuerpo, como por ejemplo b. cuantificación de inmunoglobulinas c. medición del complemento C3 y C4 d. factor reumatoide fr e. medición de antiestreptolisina

3. técnica de autoinmunidad por enzima inmuno análisis, EIA o ELISA a. determinación anticuerpo antipéptido citrulinado presente en la artritis reumatoide b. determinación de anticuerpos o esclerodermia scl70 o sjoegre: SCAro o LES: Sm o Enfermedad mixta del tejido conectivo: RNT o Poliomielitis Jo1

4. técnica de electroforesis de proteínas séricas 5. técnicas de estudio del liquido articular Se realiza una punción en la articulación y se toma una muestra del liquido articular, para realizar un estudio físico químico, análisis de algunas proteínas, glucosa, citológico para ver la calidad de las células presentes y otros estudios con luz polarizada para ver los cristales.

1. TECINCAS DE AUTOINMUNIDAD -

INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA Permite detectar anticuerpos circulantes en las persona en una muestra sanguínea. Marcada con isocianato de fluoresceína. Se toma una muestra sanguínea y se analiza el suero poniéndolo en contacto con un antígeno específico expuesto en una lámina de portaobjeto para verlo en el microscopio. El anticuerpo se pega a la lámina y se pone la globulina humana que esta marcada con isocianato de fluorescencia que al mirarla al microscopio se ve de color verde manzana. Si no se tiñe es negativo y si se tiñe es positivo. Se utiliza un microscopio de fluorescencia. Todos los exámenes que resultan positivos deben ser titulados, es decir esa muestra positiva debe ser diluida a la mitad y se analiza si vuelve a florecer se vuelve a diluir hasta que ya no fluórese mas que se conoce como la ultima dilución. El microscopio emite una luz especial que hace fluorecer cuando existe una reacción antígeno anticuerpo y la fuente es una lámpara de mercurio.

o Determinación de anticuerpos antinucleares (ANA) Este examen sirve para prácticamente todas las enfermedades inmunológicas, principalmente:  Lupus (LEC)

 

    

Enfermedad mixta del tejido conectivo Lupus eritematoso inducido por drogas Hepatitis crónica activa autoinmune Esclerosis sistémica progresiva Síndrome de Crest Artritis reumatoide Dermatomiositis.

Pero, indica solo que algo inmunológico se encuentra alterado pero no indica que enfermedad específica es, por lo que deben realizarse otros exámenes más para determinar cual es la enfermedad. El sustrato de adhesión de esto son las células Hep 2, antígeno a utilizar para que ocurra la reacción antígeno anticuerpo y va pegado en la lámina porta objetos. Son células de cultivo que provienen de carcinoma de cartílago de laringe humana.

Anticuerpos antinucleares (ANA) PATTERN HOMOGENEO

PATTERN PERIFERICO

PATTERN MOTEADO

PATTERN NUCLEOLAR

PATTERN ANTICENTROMERO

LUPUS [pattern homogéneo y pattern periférico] ENFERMEDAD MIXTA DEL TEJIDO CONECTIVO [pattern moteado] ESCLEROSIS SISTEMICAS PROGRESIVAS [pattern nucleolar] SINDROMES DE CREST [pattern anticentromero]

Anticuerpos anti DNA nativo (DNAn) Se realiza en un DNA de doble hebra, es indicativo de Lupus Eritematoso Activo, se utiliza como criterio para ver si el paciente responde al tratamiento, para ver la cantidad de anticuerpos presentes en el paciente. El sustrato que se utiliza es critidia lucilae, es un protozoo que se encuentra en las glándulas salivales de las moscas, que presenta un quinetoplasto rico en DNA activo de doble hebra. También debe titularse.

Anticuerpos antimitocondriales (AMA) Se utilizan en enfermedades del hígado, se utiliza en la Cirrosis Biliar Primaria [se utilizan títulos altos para la determinación], en hepatitis crónica activa [se utilizan títulos bajos para la determinación]. El sustrato que se utiliza es riñón de rata, se utiliza la fluorescencia en el citoplasma de los túbulos renales de rata. Y también se pueden utilizar células Hep2.

Anticuerpo antimúsculo liso También ayuda a detectar las enfermedades del hígado, se utiliza para confirmar junto con los demás examenes el diagnostico y es sustrato que se utiliza es estomago de rata.

Anticuerpo anticitoplasma de los neutrófilos Existen dos tipos: P anca: son periféricos, anticuerpos contra la mieloperoxidasa C anca: de patrón citoplasmático, anticuerpo contra la proteinaza 3 de los neutrófilos Asociados principalmente a Vasculitis

2. TECNICAS NEFELOMETRICAS Equipo especial automatizado que permite cuantificar proteínas del suero y otros …. Mide pequeñas cantidades es muy sensible y precisos. Los

equipos se llaman Nefelometros y lo que hacen es medir la luz dispersa. Cruce de un has de luz por un tubo que contiene proteínas y cuando se produce la reacción antígeno anticuerpo produce un desvío de luz que es medido, según cuanta luz. Si se transmite mucho quiere decir que hay muchas proteínas desviando el rayo de luz. Sirve para medir todas las inmunoglobulinas menos la IgE, por que la E circula en muy baja cantidad por lo que se utilizan otras técnicas especiales para medirlas. Las inmunoglobulinas se utilizan para ver como esta respondiendo el sistema inmune humoral pudiendo estar aumentado o diminuido dependiendo de la patología que se trate. También sirve para medir el complemento C3 y C4. El complemento esta disminuido en el Lupus Eritematoso Sistémico y en las glomerulonefritis. Y se encuentra aumentado en las patologías inflamatorias como en la Artritis Reumatoidea. Mientras mas unido mas concentrado se encuentra el complemento. El factor reumatoideo son antianticuerpos que están dirigidos contra la inmunoglobulina G. se pueden detectar distinto factores reumatoideos Ig, Igm o Iga. Pero el mas frecuente es Ig M y de muy util en el diagnostico de artritis reumatodidea y se informa por cantidades, el hecho que vaya bajando implica que hay una buena respuesta al tto. También se puede medir la antiestreptolisina O, que se utiliza como diagnostico de la Amigdalitis por estreptococos grupo A, este estreptococo produce exotoxinas y una de esta es la estreptolisina O que es medida en el laboratorio. Recordemos que la amigdalitis purulenta por estreptococo A podia producir fiebre reumática y una reacción cruzada donde produce un reumatismo en las válvulas del corazón o una glomerulonefritis aguda. Es muy importante su medición en el laboratorio como diagnostico de estas enfermedades.

3. TECNICA DE AUTOINMUNIDAD POR ENZIMA DE INMUNO ANALISIS [EIA] o ELISA Se utiliza para medir.  Anticuerpo antipeptido citrulinado, en la Artritis Reumatoide.  Csl70 para la esclerodermia  SCAro para Sjoegre  Sm para Lupus  Rnt para la enfermedad mixta del tejido conectivo  Jo1 para la poliomiositis Consiste en una reaccion antigeno anticuerpo que ocurre en unos microposillos que presentan unas placas que tienen pegados un anticuerpo, uno pone un antigeno se forma una reaccion antigeno anticuerpo que viene unido a una enzima que cambia de color y se mide el cambio de color. Cambio de color positivo. Sin cambio es negativo.

4. TECNICA DE ELECTROFORESIS DE PROTEINAS PLASMATICAS Consiste en poner el plasma del paciente en un campo eléctrico donde las proteínas migran desde el polo negativo (cátodo) hasta el polo positivo (ánodo), todas las proteínas tienen carga y algunas son mas positivas que otras y van quedando en el camino según su carga y el peso molecular. Es muy importante en el diagnostico del mieloma múltiple para ver las hipogamaglobunilemias o síndrome necrótico. Se utiliza un gel de Agarosa se marcan las muestras y se deja pasar un par de horas y las proteínas comienzan a migrar hacia el polo positivo. Y se utilizan tensiones para ver como migraron las proteínas y se ven distinas intensidades de color.

* Hipogammaglobulinemia Trastornos donde se pierden inmunoglobulinas en forma excesiva: síndrome nefrótico, enteropatía perdedora de proteínas, quemaduras, paracentesis frecuentes. Síntesis defectuosa de inmunoglobulinas: agammaglobulinemia y hipogammaglobulinemia congénita. Enfermedades linfoproliferativas: leucemia linfoide crónica, enfermedades de cadenas pesadas y mieloma de BenceJones. Hipergammaglobulinemia Policlonal: hepatopatías crónicas, enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren y esclerodermia); infecciones crónicas (tuberculosis, lepra, paludismo, Kala-Azar, actinomicosis y mononucleosis infecciosa), Neoplasias (enfermedad de Hodgkin y metástasis). Monoclonal. Mieloma múltiple, Macroglobulinemia de Waldenström y gammapatías monoclonales de significado indeterminado.

Gammapatía policlonal

Gammapatía monoclonal

Inmunoglobulinas. Son glicoproteínas plasmáticas que tienen actividad de anticuerpos y son producidos por los linfocitos B y plasmocitos. Ellas migran electroforéticamente como gammaglobulinas y comprenden cinco clases mayores de inmunoglobulinas (inmunoglobulina G, inmunoglobulina A, inmunoglobulina M, inmunoglobulina D e inmunoglobulina E). Estas moléculas están formadas por cadenas polipeptídicas de diferente tamaño molecular con dos cadenas pesadas idénticas y dos ligeras idénticas. La región constante de las cadenas pesadas son la G, A, M, D y E, tienen un peso molecular entre 50.000 y 70.000 y determina la clase inmunoglobulina y las dos ligeras pueden ser kappa (k) o , están presentes en las cinco clases de inmunoglobulinas y tienen un)(lambda peso molecular aproximado de 23.000. Estas cadenas polipeptídicas dispuestas en forma de «Y», están constituidas por dos brazos (formados por una porción de cadena pesada y una de cadena ligera) y el tallo (constituido por dos porciones de cadena pesada). Los brazos y el tallo están unidos por puentes desulfuro. El sitio de unión de los antígenos se ubica en la parte final de los brazos y se conoce como la parte FAB de las inmunoglobulinas. El tallo (parte FC), cumple otras funciones biológicas como la activación del complemento y la unión a receptores de la superficie de las células (basófilos, neutrófilos, linfocitos y macrófagos). A continuación se describen las diferentes inmunoglobulinas. Inmunoglobulina G. Es la inmunoglobulina más abundante en el suero (75% de todas la inmunoglobulinas), con un vida media de 3 semanas. Tiene propiedades antivirales, antibacterianas, de opsonificación y neutralizadoras de toxinas. Es la única inmunoglobulina que atraviesa la barrera placentaria, hecho que garantiza la inmunización del recién nacido en los primeros meses. Los anticuerpos Ig G enlazados al antígeno (complejo inmune o complejo antígeno-anticuerpo) pueden fijar y activar el complemento por la vía clásica. Por otra parte, las células del sistema mononuclear fagocitario poseen receptores específicos para las inmunoglobulinas G; por esta razón participa en los mecanismos de fagocitosis como sistema de ampliación de la respuesta inmunológica.

Inmunoglobulina A. Está ubicada en la superficie de las mucosas y es producida por los linfocitos B de las placas de Peyer, amígdalas y otros tejidos linfoides mucosos. Existe la inmunoglobulina A secretora y la inmunoglobulina A sérica. La inmunoglobulina A secretora es la principal inmunoglobulina de los anticuerpos con acción antimicrobiana protectora de la saliva, lágrimas, sudor, calostro, líquido prostático, moco nasal y secreciones bronquiales, gastrointestinales y genitourinarias. La inmunoglobulina A sérica comprende las antitoxinas, aglutininas, isoaglutininas y crioglobulinas y se pueden elevar en las enfermedades del tejido conectivo, alcoholismo, ictericia obstructiva y la cirrosis biliar primaria y, también pueden estimular el complemento por la vía alterna. Inmunoglobulina M. Es una macroglobulina que se ubica en la superficie de las células B; constituye el primer anticuerpo que se genera en la respuesta inmunológica (respuesta primaria aguda) y es el primero que se forma en el neonato. Es un excelente activador de la citolisis dependiente del complemento, por lo que es una defensa poderosa de primera línea contra las bacterias. Disminuye en el síndrome nefrótico y la agammaglobulinemia. Inmunoglobulina D. Constituye uno de los receptores de antígenos más importantes de la membrana de los linfocitos B. Inmunoglobulina E. Es la inmunoglobulina de menor concentración en el suero y la más importante en los trastornos alérgicos. Las células inflamatorias que forman parte de la respuesta alérgica (basófilos y mastocitos) poseen anticuerpos inmunoglobulina E absorbidos de la sangre y actúan como receptores de antígenos; cuando estas células entran en contacto con el antígeno, liberan sustancias mediadoras inflamatorias causantes de las manifestaciones clínicas de las enfermedades alérgicas. Por esta razón es importante en la hipersensibilidad inmediata (tipo I) y contiene los anticuerpos implicados en la anafilaxia y la sensibilidad cutánea. GAMMAPATÍAS Las gammapatías pueden presentarse en dos formas: la monoclonal (inmunoglobulina M), observada en el mieloma múltiple (MM), Macroglobulinemia de Waldenström y en la enfermedad de cadenas pesadas y, la policlonal con aumento de todas las inmunoglobulinas, en enfermedades inflamatorias crónicas como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la hepatitis activa crónica. En el mieloma múltiple cualquier inmunoglobulina puede elevarse, mientras que, la inmunoglobulina M es más frecuente en otras entidades malignas como la macroglobulinemia de Waldenström. Gammapatía monoclonal. La gammapatía monoclonal comprende un grupo de enfermedades por lo general de carácter maligno que se caracteriza por la elevación notable y exclusiva de las gammaglobulinas. La electroforesis de las proteínas séricas revela la proteína monoclonal característica (espiga-M) en el 80% de los casos. Otros exámenes que complementan el estudio de estos pacientes son la cuantificación de las inmunoglobulinas séricas, la inmunoelectroforesis de las proteínas en la orina, el calcio sérico, examen de la médula ósea, macroglobulina alfa2, viscosidad sanguínea y crioglobulinas del suero. En líneas generales, la gammapatía monoclonal se pueden clasificar en: Gammapatías monoclonales malignas. Mieloma múltiple. Formas especiales de mieloma múltiple: mieloma indolente, mieloma quiescente, no secretor, biclonal, osteoesclerótico (síndrome de POEMS), mieloma con mielofibrosis. Plasmocitoma localizados: óseo solitario y extramedular. Enfermedades linfoproliferativas malignas: Macroglobulinemia de Waldenström, linfoma no Hodgkin con gammapatía monoclonal, leucemia linfoide crónica con gammapatía monoclonal. Enfermedades de las cadenas pesadas: gamma, alfa, mu, delta. Gammapatías monoclonales de significado desconocido. Gammapatía monoclonal idiopática o esencial. Proteinuria de Bence-Jones. Gammapatía monoclonal asociada a carcinoma (pulmón, colon, próstata).

5. TECNICA DE ESTUDIO DEL LIQUIDO ARTICULAR

Es una técnica mucho mas invasiva, donde se realiza una punción en la articulación inflamada con los cuidados asépticos necesarios para no llevar una infección a la articulación. Se le realiza un estudio físico químico, citológico y con cristales con luz polarizada. El liquido articular es un ultrafiltrado que presenta todos los factores del plasma excepto el factor de coagulación, para obtener la muestra se realiza una artrocentesis aséptica. Se utiliza para el diagnostico de artritis inflamatorias, artritis sépticas y por cristales. Lo principal que se quiere encontrar es una artritis séptica o descartar si presenta cristales y es gota o si simplemente es inflamatoria. También sirve para evacuar la articulación que presenta una gran inflamación. Se utiliza un microscopio de luz polarizada para ver la presencia de cristales. normal

no inflamatorio

inflamatorio

viscosidad

alta

alta

baja

séptico baja

color

incoloro

pajizo

amarillo

variable

aspecto

transparente

transparente

translucido/ turbio

opaco/ purulento

leucocito/mm3

<200

200-2000

2000-100000

>100000

%PMN

< 25

25-50

50-75

>75

microbiológico

negativo

negativo

negativo

positivo o negativo

cristales

negativo

negativo

positivo o negativo

negativo

mucina

firme

firme

friable

friable

glucosa

ídem plasma

ídem plasma

hasta 25% menor

<40%

6. Otras técnicas Reacciones de aglutinación donde se junta el reactivo con el suero del paciente y se ve a simple vista. Reacciones de precipitación que también se ven a simple vista. Como la citometría de flujo, que se utiliza para ver las células alteradas, anemias, para medir la CD4. Reacciones radioactivas para descartar la reacción antigeno anticuerpo que se produce en el examen de Anti DNA[ ] que es mucho mejor que la medición del antiDNA nativo en el protozoo.