Curso De Inmunologia General

CURSO DE INMUNOLOGÍA GENERAL 1. Introducción al sistema inmune 1.1 INTRODUCCIÓN AL SISTEMA INMUNITARIO 1.1.1 UNA APROXIMACIÓN A CONCEPTOS DE LA INMUNOLOGÍA

LOS

Los animales superiores son atacados por microorganismos y partículas extrañas. Pero poseen sistemas defensivos frente a tales patógenos; dichos mecanismos tienden a distinguir lo propio de lo extraño Concepto de inmunidad: Conjunto de mecanismos de defensa de los animales frente a agentes externos extraños. Se adquiere al nacer, y va madurando y consolidándose durante los primeros años de vida. Inmunología: Ciencia biológica que estudia todos los mecanismos fisiológicos de defensa de la integridad biológica del organismo. Dichos mecanismos consisten esencialmente en la identificación de lo extraño y su destrucción. La inmunología también estudia los factores inespecíficos que coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales. Respuesta inmune: Actuación integrada de un gran número de mecanismos heterogéneos de defensa contra sustancias y agentes extraños. En general, a las sustancias extrañas se las denomina como antígenos, y son ellos los que desencadenan en el organismo una serie de eventos celulares que provocan la producción de los mecanismos de defensa. Como veremos, los mecanismos de respuesta tienen una componente celular y otra molecular.

1.1.2 DESARROLLO HISTÓRICO DE LA INMUNOLOGÍA La inmunología es, en la actualidad, una ciencia autónoma y madura, pero sus orígenes han estado estrechamente ligados a la Microbiología. Su objeto consiste en el estudio de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasión por microorganismos o partículas extraños, aunque su interés se ha volcado especialmente sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no propios, así como de su neutralización y degradación. Como tantas otras ciencias, la Inmunología presenta un prolongado período pre-científico, de observaciones y aproximaciones meramente empíricas. La resistencia a ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la antigüedad; el historiador griego Tucídides (464-404 a.C.) narra que en una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por aquellos que habían sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que éstos no volverían a ser contagiados. Igualmente, en la antigua China se había observado que las personas que en su niñez habían padecido la viruela no la adquirían más adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo XI a. C., fueron los primeros en intentar una aplicación de estas observaciones que indicaban la inducción de un estado protector por medio de una forma suave de la enfermedad: la inhalación de polvo de escaras de viruela provocaba un ataque suave que confería resistencia ante infecciones posteriores. Una modificación\n fue introducida en Occidente en el siglo XVIII por Pylarini y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaña por Lady Mary Wortley Montagu, esposa del embajador inglés en Constantinopla, tras una serie inicial de pruebas sobre "voluntarios" (prisioneros). Sin embargo, este tipo de prácticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban exentas de riesgos, entre los cuales figuraba la posibilidad de transmisión de otras enfermedades. El primer acercamiento a la inmunización con criterios racionales fue realizado por el médico inglés Edward Jenner (1749-1823), tras su constatación de que las vaqueras que habían adquirido la viruela vacunal (una forma benigna de enfermedad que sólo producía pústulas en las manos) no eran atacadas por la grave y deformante viruela humana. En mayo de 1796 inoculó a un niño fluido procedente de las pústulas vacunales de Sarah Nelmes; semanas después el niño fue inyectado con pus de una pústula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la enfermeda.

Jenner publicó sus resultados en 1798 ("An enquiry into the causes and effects of the variolae vaccinae..."), pronosticando que la aplicación de su método podría llegar a erradicar la viruela. Jenner fue el primero en recalcar la importancia de realizar estudios clínicos de seguimiento de los pacientes inmunizados, consciente de la necesidad de contar con controles fiables. La falta de conocimiento, en aquella Época, de las bases microbiológicas de las enfermedades infecciosas retrasó en casi un siglo la continuación de los estudios de Jenner, aunque ciertos autores, como Turenne, en su libro "La syphilization" (1878) lograron articular propuestas teóricas de cierto interés. El primer abordaje plenamente científico de problemas inmunológicos se debió, a Louis Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del cólera aviar (más tarde conocida como Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la inoculación en gallinas de cultivos viejos, poco virulentos, las protegía de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Fue precisamente Pasteur quien dio carta de naturaleza al término vacuna, en honor del trabajo pionero de Jenner. En los años siguientes Pasteur abordó la inmunización artificial para otras enfermedades; concretamente, estableció de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por incubación a 45 grados C conferían inmunidad a ovejas expuestas a contagio por carbunclo. Una famosa demostración pública de la bondad del método de Pasteur tuvo lugar en Pouilly le Fort, el dos de junio de 1881, cuando ante un gentío expectante se pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados. Años después, abordaría la inmunización contra la rabia, enfermedad de la que se desconocía el agente causal. Pasteur observó que éste perdía virulencia cuando se mantenían al aire durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos extractos se podían emplear eficazmente como vacunas. Realizó la primera vacunación antirrábica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el niño Joseph Meister, que había sido mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo que valió a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su método de inmunización, que abría perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creación del Instituto Pasteur, que muy pronto reunió a un selecto grupo de científicos, que enfocarían sus esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biológicas. A su vez, los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los métodos serológicos de Pasteur, lo que les permitió producir y conservar más fácilmente sueros tipificados contra la peste porcina.

A finales del siglo XIX existían dos teorías opuestas sobre los fundamentos biológicos de las respuestas inmunes. Por un lado, el zoólogo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-1916), que había realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua, estableció, a partir de 1883, su "Teoría de los fagocitos", tras estudiar fenómenos de englobamiento de partículas extrañas por los leucocitos de conejo y de humanos. Informó que existían fenómenos de eliminación de agentes patógenos por medio de "células devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y explicó la inmunización como una "habituación" del hospedador a la fagocitosis. Más tarde, ya integrado en el Instituto Pasteur, propugnó la idea de que los fagocitos segregan enzimas específicos, análogos a los "fermentos" digestivos (1900). Esta teoría de los fagocitos constituyó el núcleo de la teoría de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo. Por otro lado, la escuela alemana de Koch hacía hincapié en la importancia de los mecanismos humorales (teoría de la inmunidad humoral). Emil von Behring (1854-1917) y Shibasaburo Kitasato (1856-1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del tétanos y de la difteria, observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (más tarde conocidas como anticuerpos) que tendían a neutralizar las toxinas de forma específica, y evidenciaron que el suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una dosis letal de la toxina correspondiente (1890). La intervención de Ehrlich permitió obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una protección eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la "antitoxina" presente en suero. Ehrlich dirigió desde 1896 el Instituto Estatal para la Investigación y Comprobación de Sueros, en Steglitz, cerca de Berlín, y, a partir de 1899, estuvo al frente del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental, en Frankfurt. Durante este último periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra científica, en la que va ahondando en la comprensión de la inmunidad humoral. En 1900 da a luz su "Teoría de las cadenas laterales", en la que formula una explicación de la formación y especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base química para la interacción de éstos con los antígenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez, en 1897, una reacción antígeno-anticuerpo, al observar el enturbiamento de un filtrado bacteriano al mezclarlo con un suero inmune específico (antisuero). Durante cierto tiempo se creyó que el suero posee distintas actividades inmunes humorales, cada una denominada de forma diferente: antitoxina (neutralización de toxinas), precipitina (precipitación de toxinas), aglutinina (aglutinación de bacterias) y bacteriolisina (lisis de bacterias). Hubo que esperara a los años 30 para caer en la cuenta que todas estas

actividades se debían a un único tipo de entidad, que fue bautizado como anticuerpo. En 1898 Jules Bordet (1870-1961) descubre otro componente sérico relacionado con la respuesta inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo, por su termolabilidad e inespecificidad. (Más tarde se impondría el nombre de complemento, propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarrolló, en 1901, el primer sistema diagnóstico para la detección de anticuerpos, basado en la fijación del complemento, y que inició una larga andadura, que llega a nuestros días. La conciliación de las dos teorías (celular y humoral) se inició con los trabajos de Almorth Wrigth y Stewart R. Douglas, quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la capacidad fagocítica de los leucocitos. En los años 50 se reconoce que los linfocitos son las células responsables de los dos componentes, humoral y celular, de la inmunidad. El área de la inmunopatología inicia su andadura con la descripción del fenómeno de anafilaxia producido por introducción en un animal de un suero de una especie distinta (Portier y Richet, 1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abriría la posibilidad de métodos de serodiagnóstico, con aplicaciones múltiples en Medicina, Zoología y otras ciencias biológicas. En 1905 Pirquet sugiere que la enfermedad del suero (un fenómeno de hipersensibilidad) tiene relación directa con la producción de anticuerpos contra el suero inyectado, introduciendo el término de alergia para referirse a la reactividad inmunológica alterada. La inmunoquímica cobra un gran impulso en las primeras décadas del siglo XX con los trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribución de importancia había sido la descripción, mediante reacciones de aglutinación, del sistema de antígenos naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboración con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmisión hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estímulo para avanzar en el desentrañamiento de la especificidad química de los antígenos que determinan la formación de anticuerpos. Landsteiner estudió sistemáticamente las características de inmunogenicidad y especificidad de reacción de antígenos con anticuerpos, valiéndose de la modificación química de antígenos, denominando haptenos a aquellos grupos químicos que por sí mismos no desencadenan formación de anticuerpos, pero sí lo hacen tras ser conjugados a proteínas portadoras.

La cuestión de las reacciones antígeno-anticuerpo se convirtió en otra polémica entre escuelas hasta finales de los años 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenían que estas reacciones tienen una base puramente química, Bordet y sus discípulos las explicaban como fenómenos físicos de reacciones entre coloides. La resolución del debate debió aguardar hasta finales de los años 30, al incorporarse avances técnicos como la electroforesis, la cromatografía en papel, la ultracentrifugación y el microscopio electrónico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociación de precipitados. Tiselius (1939) demostró que los anticuerpos constituyen la fracción gamma-globulínica del suero. Veinte años después R.R. Porter y G.M. Edelman establecen la estructura de las inmunoglobulinas. Durante este lapso de tiempo se descubre que la síntesis de anticuerpos ocurre en las células plasmáticas, aunque éstas no son puestas en relación aún con los linfocitos; durante muchos años se siguió creyendo que los linfocitos eran células pasivas, sin función inmune. Por aquella época se describe, también, la diversidad de inmunoglobulinas, llegándose al establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los múltiples experimentos sobre timectomía en ratones neonatos y sobre bursectomía en aves, así como los de reconstitución de animales irradiados, con timocitos y células de la medula ósea, y que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente. Una importante faceta de la inmunología de la primera mitad del siglo XX fue la obtención de vacunas. Se lograron toxoides inmunogénicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetánico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide diftérico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin. La utilización de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy. La inmunogenética nace cuando Bernstein describe en 1921 el modelo de transmisión hereditaria de los cuatro grupos sanguíneos principales, basándose en el análisis estadístico de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y Levène (1927) de los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones sanguíneas interespecíficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antígenos sanguíneos, explicables según unos 300 alelos múltiples. Otra de las grandes controversias de los primeros tiempos de la Inmunología se refería al tipo de mecanismos postulados para explicar la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. Se propusieron dos tipos de teorías: la selectiva y la instructiva. La

primera formulación de tipo instructivo se debió a Paul Ehrlich (teoría de las cadenas laterales): suponía que las células inmunes expresan en su superficie una gran variedad de cadenas laterales preformadas; la unión de un agente patógeno determinado con una cadena lateral adecuada sería análoga a la complementariedad entre una llave y su cerradura; dicha interacción originaría la liberación de la cadena lateral, e induciría a la célula a producir y liberar más cadenas laterales de ese tipo concreto. Como se ve, esta teoría supone que la selectividad de la cadena lateral está determinada previamente a la exposición al antígeno, que sólo actúa seleccionando la producción y liberación de la cadena adecuada. En cambio, durante los años 30 y 40 se daba más crédito a las teorías instructivas. En ellas, el antígeno juega un papel central a la hora de determinar la especificidad del anticuerpo correspondiente. Se sugería que el antígeno serviría como un molde alrededor del cual se plegaría la molécula del anticuerpo, que de esta forma adquiriría su especificidad. Estas teorías, popularizadas sobre todo por Linus Pauling, podían encajar en aquellos tiempos en que aún existían muchas lagunas de los conocimientos, pero en los años 50, tras los nuevos descubrimientos en Biología Molecular (ADN, ARN, código genético, etc.), fueron descartadas. Una contribución esencial a las ideas sobre el mecanismo de formación de los anticuerpos la realizó el australiano Macfarlane Burnet (1899-1985), al establecer su teoría de la selección clonal; ésta argumenta que cada linfocito B, previamente al contacto con el antígeno, sintetiza un único tipo de anticuerpo, específico para cada antígeno determinante antigénico), de modo que la unión del antígeno causa la proliferación clonal del linfocito B, con la consecuente síntesis incrementada de anticuerpos específicos. Esta teoría resucitó las ideas selectivas, y actualmente es el paradigma aceptado por todos los inmunólogos. Más recientemente Niels Jerne ha realizado nuevas aportaciones y refinamientos a la teoría de la selección clonal, proponiendo un modelo de regulación inmune conocido como teoría de las redes idiotípicas. Los avances en Inmunología durante los últimos años han sido espectaculares, consolidando a ésta como ciencia independiente, con su conjunto propio de paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiológico. Entre los hitos recientes hay que citar la técnica de producción de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas, desarrollada originalmente por Cesar Milstein y Georges Kohler en 1975, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el desentrañamiento de los fenómenos de reorganización genética responsables de la expresión de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa.

1.2 VISIÓN GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO El sistema principales:

inmunitario

consta

de

varias

"líneas

de

defensa"

Inmunidad innata (= natural o inespecífica): es una línea de defensa que permite controlar a mayor parte de los agentes patógenos. Inmunidad adquirida (= adaptativa o específica): suministra una respuesta específica frente a cada agente infeccioso. Posee memoria inmunológica específica, que tiende a evitar que el agente infeccioso provoque enfermedad en una segunda infección. Pero incluso antes de que actúe la inmunidad inespecífica, el organismo posee una serie de barreras naturales que lo protegen de la infección de los agentes patógenos, así como una protección biológica por medio de la microflora (microbiota) natural que posee. Comenzaremos nuestro estudio de la inmunidad precisamente por estas primeras líneas defensivas.

1.2.1 Barreras anatómicas y físicas 1.2.1.1 Barreras anatómicas (superficies corporales): la piel y membranas mucosas La parte externa de la epidermis está compuesta de varias capas de células muertas, recubiertas de la proteína queratina, resistente al agua. Dicha capa se renueva cada 15-30 días. La dermis subyacente contiene tejido conectivo con vasos sanguíneos, glándulas sebáceas y sudoríparas, y folículos pilosos. La piel es una auténtica barrera infranqueable para la mayor parte de los microorganismos. El papel de barrera de la piel se pone de manifiesto por contraste, por ejemplo al comprobar lo fácilmente que se producen infecciones a partir de quemaduras. Pero como contrapartida, en un organismo sano, las heridas se cierran rápidamente por coágulos. Algunos patógenos pueden obviar la barrera de la piel debido a que son inoculados por artrópodos vectores (ácaros, mosquitos, chinches, etc.). Por otro lado, existen zonas de la superficie del cuerpo no recubiertas por piel: ojos intestino tracto respiratorio tracto urinario En estas zonas hay fluidos (y en su caso tapizado ciliar) que colaboran a la eliminación de microorganismos

Algunos microorganismos han desarrollado estructuras para invadir el cuerpo del hospedador a partir de las mucosas. Por ejemplo, el virus de la gripe posee una molécula que le capacita para unirse firmemente a las células de la membrana mucosa y así escapar al efecto de las células ciliadas. Muchas bacterias patógenas logran adherirse a las mucosas a través de sus fimbrias, que se unen con ciertas glucoproteínas o glucolípidos de los epitelios de tejidos determinados.

1.2.1.2 Función del pH Por ejemplo, en el estómago, el pH bajo (alrededor de pH 2) impide que lo atraviese la mayoría de microorganismos, excepto algunos patógenos (p. ej., Salmonella, Vibrio cholerae, etc.). pH ligeramente ácido de la piel y de la vagina.

1.2.1.3

Función de la temperatura

Muchas especies no son susceptibles a ciertos microorganismos sencillamente porque su temperatura corporal inhibe el crecimiento de éstos. Así, los pollos presentan inmunidad innata al ántrax debido a que su temperatura es demasiado alta para que el patógeno pueda crecer.

1.2.1.4

Sustancias antimicrobianas del organismo

La lisozima aparece en muchas secreciones (nasofaringe, lágrimas, sudor, sangre, pulmones, tracto genitourinario...). beta-lisina, producida por las plaquetas. Espermina en el semen.

1.2.1.5

Secuestro de hierro,

que hace que el Fe libre en el organismo sea muy escaso (del orden de 10-8M). En las células, el Fe está "secuestrado" formando complejos con moléculas como hemoglobina, mioglobina, citocromos, ferritina, etc. En la sangre, el Fe está unido a la transferrina. Sin embargo, algunos patógenos han evolucionado mecanismos para obtener Fe a partir de algunas de estas proteínas: se trata de un tipo de moléculas llamadas sideróforos, que pueden captar Fe a partir de la transferrina. Como ejemplo, la enterobactina de miembros de la familia Enterobacteriáceas.

1.2.2

Protección de la microbiota normal

La microbiota normal del organismo evita la colonización del hospedador por microorganismos exógenos. Esa es la razón por la que una limpieza exagerada de la piel y de la vagina puede ser causa de infecciones por microbios exógenos. Recuérdese el papel de protección que confiere la bacteria Lactobacillus acidophilus en el hábitat de la vagina. Por otro lado, un abuso de antibióticos suministrados por vía oral puede llegar a alterar el equilibrio ecológico de la microflora intestinal.

En la piel existen dos tipos principales de "hábitat": la

superficie

de

la

piel

propiamente

dicha

es

un

medio

relativamente "hostil", ya que es seca y muy salada, de modo que normalmente sólo la pueden colonizar algunas bacterias bien adaptadas: Micrococcus, Staphylococcus epidermidis, S. aureus. Las glándulas: sudoríparas y sebáceas. En estas últimas, durante la adolescencia se desarrolla el típico acné (espinillas), producido por el ataque de Propionibacterium acnes. La boca posee una población heterogénea de bacterias, donde son importantes los representantes orales del género Streptococcus: S. salivaris (en la lengua), S. mitis (en los carrillos) y S. mutans (en los dientes). Este último es uno de los principales responsables de la placa dental y de la caries. El intestino grueso posee una abundantísima flora microbiana, con una concentración del orden de 1010 bacterias/ml. Funciona como si fuera un quimiostato.

1.2.3 Sistema (propiamente dicho)

inmunitario

1.2.3.1 Sistema de inmunidad innata, natural o inespecífica Elementos del sistema de inmunidad natural. Si el microorganismo o partícula extraños logran atravesar la piel y los epitelios, se pone en marcha el sistema de inmunidad natural (inespecífica o innata), en el que participan los siguientes elementos:

Células: Fagocitos (o sea, leucocitos del sistema retículo-endotelial, que se originan en la medula ósea):en la sangre: los PMN neutrófilos (de vida corta) y los monocitos; en los tejidos: los macrófagos, que se diferencian a partir de los monocitos. Todos ellos fagocitan y destruyen los agentes infecciosos que logran atravesar las superficies epiteliales. Células asesinas naturales (células NK): son leucocitos que se activan por interferones inducidos en respuesta a virus. Reconocen y lisan células "enfermas", infectadas por virus o malignizadas (cancerosas). Factores solubles: Proteínas de fase aguda: aumentan su concentración rápidamente unas 100 veces ante una infección Una de ellas (la proteína C-reactiva) se une a la proteína C de la superficie del neumococo, favoreciendo que éste sea recubierto por el sistema de proteínas del complemento (al que aludiremos enseguida), lo cual a su vez facilita la fagocitosis por los fagocitos. Sistema del complemento: se trata de un conjunto de unas 20 proteínas del suero que interaccionan entre sí y con otros componentes de los sistemas inmunes innato y adquirido. En el sistema de inmunidad innata el sistema se activa por la llamada ruta alternativa. He aquí un resumen de sus efectos: El complemento se activa por ruta alternativa al contacto con la superficie del microorganismo. El hecho de que el complemento quede activado tiene una serie de consecuencias: lisis directa del microorganismo quimiotaxis sobre fagocitos recubrimiento del microorganismo con una de las proteínas del complemento (la C3b), lo que facilita la fagocitosis (a este fenómeno se le llama opsonización)

la activación del complemento controla también la reacción de inflamación aguda. Funcionamiento del sistema de inmunidad natural Endocitosis La endocitosis es la ingestión de material soluble (macromoléculas) del fluido extracelular por medio de invaginación de pequeñas vesículas endocíticas. La endocitosis puede ocurrir de dos maneras distintas:

A) Pinocitosis La internalización de las macromoléculas ocurre por invaginación inespecífica de la membrana plasmática. Debido a esa inespecificidad, la cuantía de la internalización depende de la concentración de las macromoléculas. B) Endocitosis mediada por receptor Las macromoléculas son selectivamente internalizadas debido a su unión a un receptor específico de la membrana. En cualquiera de estos dos casos, tras la internalización, las vesículas endocíticas se fusionan entre sí y después con los endosomas. En el caso de endocitosis, el contenido ácido de los endosomas hace que se disocie la macromolécula de su receptor. El endosoma se fusiona con el lisosoma primario, para dar el lisosoma secundario. Los lisosomas primarios derivan del aparato de Golgi y transportan grandes cantidades de enzimas hidrolíticos (proteasas, nucleasas, lipasas, etc.). Dentro de los lisosomas secundarios, las macromoléculas ingeridas son digeridas hasta productos hidrolizados (péptidos, aminoácidos, nucleótidos y azúcres), que finalmente son eliminados de la célula. Fagocitosis La fagocitosis es la unión del microorganismo (o, en general, un agente particulado, insoluble) a la superficie de una célula fagocítica especializada (PMN, macrófago), por algún mecanismo inespecífico, de tipo primitivo (ameboide): emisión de pseudópodos y englobamiento, para crear un fagosoma (10-20 veces mayor que el endosoma) al que se unen lisosomas; a partir de aquí el proceso es similar al descrito anteriormente. La fusión de los gránulos de los fagocitos origina la destrucción del microbio en unos pocos minutos. La expansión de la membrana en la fagocitosis (emisión de pseudópodos) requiere la participación de los microfilamentos, cosa que no ocurre en la pinocitosis-endocitosis. La destrucción del microorganismo en los lisosomas secundarios de los fagocitos se produce por dos tipos de mecanismos: Mecanismos dependientes de oxígeno: Se activa una ruta metabólica (hexosa monofosfato) que consume grandes cantidades de oxígeno, lo que a su vez produce grandes cantidades de radicales tóxicos antimicrobianos (como el O2-, H2O2, OH-, O21), que a su vez pueden reaccionar para dar otras sustancias tóxicas, como hipocloritos y cloruros. Estas sustancias provocan una intensa halogenación que afecta a muchas bacterias y virus. Mecanismos dependientes de óxido nítrico (NO). Mecanismos independientes de oxígeno: Liberación de enzimas hidrolíticos: lisozima, proteínas catiónicas, proteasas, etc., que ejecutan un efecto bactericida o bacteriostático.

Pero como hemos dicho, el paso inicial de la fagocitosis implica que el fagocito debe ser capaz de unirse al microorganismo y activar la membrana para poder englobarlo. Para ello, cuenta con una ayuda evolutiva que se ha "añadido" al sistema primitivo ameboide, y que aumenta su eficacia: el sistema de activación del complemento por la vía alternativa. Activación del complemento por la ruta alternativa: Como ya dijimos, el complemento es un conjunto de 20 proteínas del plasma, que interactúan entre sí y con otros elementos de los sistemas inmunitarios innato y adquirido, para mediar una serie de importantes respuestas inmunológicas. El complemento se activa por dos rutas diferentes: la ruta clásica, (que corresponde al sistema de inmunidad específica, y que depende de interacciones antígenoanticuerpo), y la ruta alternativa (perteneciente al sistema natural). Ambas rutas consisten en un sistema de activación enzimática en cascada, que sigue la lógica de que el producto de una reacción es a su vez una enzima para la siguiente reacción, produciéndose una respuesta rápida y amplificada del estímulo inicial. En la ruta alternativa podemos distinguir dos grandes fases: la iniciación por el componente C3 y el ensamblaje del complejo de ataque a la membrana (CAM). a) Iniciación de la ruta alternativa por el componente C3. La acción concertada del polisacárido microbiano y de la properdina del hospedador estabiliza a la C3-convertasa, que de esta forma comienza a producir grandes cantidades de C3b que se fijan a la superficie del microorganismo; a su vez, el C3b fijado provoca la producción y fijación de mayores cantidades de convertasa (C3bBb). b) Ensamblaje sobre la membrana del microorganismo del complejo de ataque a la membrana (CAM), por la "vía post-C3": Ahora comienzan a juntarse, junto al C3b, y en orden secuencial, una serie de otros componentes del sistema complemento, que finalmente constituyen el llamado complejo de ataque a la membrana (CAM), que representa un canal totalmente permeable a iones y agua. Como lo que acabamos de describir ocurre en toda la superficie del microorganismo, el resultado son innumerables complejos CAM ensamblados en la membrana citoplásmica, por los que entran grandes cantidades de agua con iones Na+, que pueden provocar la lisis del microorganismo. En este proceso se liberan algunos componentes solubles del complemento, de los cuales los más importantes son el C3a y el C5a.

Funciones biológicas alternativa:

del

complemento

activado

por

la

ruta

a) Como acabamos de ver, una primera secuela (aunque no siempre ocurre en todos los microorganismos) es la lisis celular por el CAM. El recubrimiento del microorganismo por numerosas unidades de C3b es un ejemplo de opsonización: facilita la unión de los fagocitos al agente extraño, para su inmediata fagocitosis. Papel de los pequeños péptidos solubles C3a y C5a: b) estimulan la tasa respiratoria de los PMN neutrófilos, lo que supone una activación de sus mecanismos destructivos dependientes de oxígeno (citados más arriba). estos péptidos son anafilotoxinas, es decir, estimulan la desgranulación de los mastocitos y de los PMN basófilos, lo cual supone la liberación de una variedad de sustancias i. ii. iii.

histamina: provoca vasodilatación y aumento de la permeabilidad de los capilares sanguíneos. heparina: efecto anticoagulante. factores quimiotácticos que atraen a PMN neutrófilos y eosinófilos.

Todo ello, como se puede ver, va encaminado a congregar hacia el foco de infección a las células fagocíticas, parte de las cuales se activan para mecanismos defensivos. Pero además, estas anafilotoxinas inducen el que los mastocitos sinteticen prostaglandinas (PG) y leucotrienos (LT), cuyos papeles fisiológicos son: intervenir en el mecanismo fisiológico del dolor favorecer aún más la quimiotaxis de los PMN favorecer más la vasodilatación. Reacción de inflamación aguda: La inflamación es una reacción ante la entrada de un microorganismo a un tejido, con síntomas de dolor (debido a PG y LT), enrojecimiento, hinchazón y sensación de calor, con un edema debido a la acumulación de líquido rico en leucocitos. Esta reacción deriva de algunos de los componentes citados en el anterior epígrafe: Los péptidos C3a y C5a, junto con los factores quimitácticos segregados por los mastocitos atraen hacia el tejido afectado a los PMN que están circulando por la sangre, que atraviesan los capilares ayudados por el efecto de vasodilatación de la histamina. Al llegar al foco del microorganismo invasor, las células atraídas despliegan todo su arsenal: los PMN neutrófilos reconocen (por medio de unos

receptores específicos) a los microorganismos "opsonizados" (recubiertos) por C3b, los fagocitan, y en el fagolisosoma formado descargan su "artillería química", entre ella los mecanismos dependientes de oxígeno, que han sido activados por C3a y C5a. La vasodilatación y el incremento en la permeabilidad capilar facilitan la entrada al tejido dañado de las enzimas del sistema de coagulación sanguínea: se activa una cascada enzimática que conduce a la acumulación de cadenas insolubles de fibrina, que constituyen el coágulo sanguíneo. Una vez ocurrida la respuesta de inflamación aguda, y eliminado el microorganismo por los fagocitos, tiene lugar la reparación del tejido dañado y la regeneración con tejido nuevo. La reparación comienza con el crecimiento de vasos capilares en el entramado de fibrina del coágulo sanguíneo. Conforme el coágulo se disuelve, va siendo sustituido por fibroblastos nuevos. La cicatriz es el resultado de la acumulación de nuevos capilares y de fibroblastos. Otros mecanismos de inmunidad inespecífica: A) Mecanismos humorales: Proteínas de fase aguda. Estas proteínas incrementan su concentración espectacularmente cuando se produce una infección. Una de las m<s importantes es la proteína C-reactiva (CRP), que se produce en el hígado ante daño en tejidos. Se une al llamado polisacárido C de la pared celular de una amplia variedad de bacterias y de hongos. Esta unión activa a su vez al complemento, lo que facilita su eliminación, bien sea por lisis dependiente del complemento (por el complejo de ataque a la membrana, CAM), bien sea por potenciación de la fagocitosis mediada por el complemento. Interferones (consultar lo estudiado en Virología). Los interferones modulan, además la función de las células NK. B) Mecanismos celulares: dependen de células que destruyen "desde fuera" (no por fagocitosis): células NK (asesinas naturales): son linfocitos grandes, distintos de los B y T que veremos más adelante, y que a diferencia de estos poseen gránulos citoplásmicos. Su papel es reconocer células tumorales o infectadas con virus, se unen a ellas y liberan al espacio que queda entre ambas el contenido de sus gránulos. una perforina, proteína que se ensambla en la superficie de la célula enferma y origina un canal parecido al de CAM, provocando la lisis. factores citotóxicos, que matan a la célula enferma PMN eosinófilos: especializados en atacar grandes parásitos, incluyendo helmintos.

1.2.3.2 específica

El

sistema

de

inmunidad

adaptativa

o

Algunos microorganismos no desencadenan activación del complemento por la ruta alternativa, y no pueden ser lisados porque no llegan a quedar opsonizados por la proteína C3b. Incluso existen microbios que escapan al control de los fagocitos. Para poder enfrentarse con estos "invasores", la evolución ha desarrollado en los vertebrados, y principalmente en los mamíferos, una barrera defensiva adicional, aún más sofisticada, consistente en un tipo de moléculas que funcionan como "adaptadores flexibles", que por un lado se unen a los fagocitos, y por el otro se unen al microorganismo, no importa de qué tipo se trate. Este tipo de adaptadores son los anticuerpos. En cada tipo de anticuerpos existen 3 regiones: una que reconoce específicamente a cada invasor dos con funciones biológicas: unión al complemento, activándolo por la ruta clásica; unión a fagocitos. En la inmunidad específica se dan dos tipos de respuesta: inmunidad específica humoral inmunidad específica celular. A continuación se expone un breve resumen de ambas respuestas, que nos servirá para "abrir boca" de cara al estudio con más detalle que emprenderemos más tarde. Los anticuerpos son los mediadores de la inmunidad específica humoral. La unión entre el antígeno (Ag) y el anticuerpo específico (Ac) provoca: la activación del complemento por la ruta clásica, que puede conducir, al igual que en la ruta alternativa, a la lisis del microorganismo invasor; opsonización (recubrimiento) de los fagocitos con complejos AgAc, lo cual facilita la fagocitosis; neutralización directa de ciertas toxinas y virus por la simple unión Ag-Ac. Obsérvese que los dos primeros efectos son formas que tiene el sistema específico de "aprovechar" elementos del sistema de inmunidad innata, mediante los cuales determinados elementos de este sistema inespecífico son "encarrilados" mediante los anticuerpos (que son específicos) hacia el foco de la infección de un determinado microorganismo, para su eliminación.

Los Ac están producidos por las células diferenciadas a partir de los linfocitos B.

plasmáticas,

Los Ag son las moléculas del microorganismo o partícula extaña que evocan y reaccionan con los Ac. Son los Ag los que seleccionan el Ac específico que les hará frente. Sin embargo, cada tipo de Ac está preformado antes de entrar en contacto por primera vez con el Ag. Cada linfocito B que se diferencia en la médula ósea está programado genéticamente para sintetizar un solo tipo de Ac, a la espera de contactar con el Ag específico. Tras su primer contacto con el Ag específico, cada linfocito B se multiplica y diferencia hasta dar un clon de células plasmáticas, que fabrican y excretan grandes cantidades del Ac específico para el que estaba programado el linfocito original. A este fenómeno se le conoce con el nombre de selección y expansión clonal. En cada individuo existen cientos de miles, o millones de tipos de linfocitos B, cada uno preparado para originar un clon productor del correspondiente Ac. La respuesta de formación de Ac provocada tras el primer contacto de cada Ag con el linfocito B se llama respuesta primaria. Este primer contacto confiere al individuo una memoria inmunológica, de forma que el cuerpo se encuentra preparado para afrontar la eventualidad de una segunda infección por el mismo agente. En la respuesta secundaria la formación de Ac es más rápida y más intensa. Ello se debe a que a partir del linfocito primario que tuvo el primer contacto, aparte del clon de células plasmáticas (responsable de la respuesta primaria), se generó en paralelo otro clon de células B de memoria: cuando el Ag entre por segunda vez, hay en el cuerpo m<s células preparadas que las que encontró en la primera ocasión. Además, estos linfocitos cebados de memoria necesitan menos divisiones celulares antes de poder diferenciarse a su vez en células plasmáticas productoras de Ac. La memoria inmunológica es específica para cada antígeno. Su base es que cada anticuerpo reconoce un solo antígeno (aún más: como veremos, reconocen porciones concretas de cada antígeno, denominadas epitopos). Cómo puede el organismo reconocer tan específicamente moléculas "extrañas", a las que ataca, y discriminarlas respecto de sus propias moléculas, a las que respeta? En 1960 Burnett y Fenner propusieron un hipótesis que se demostraría b<sicamente correcta años más tarde: El cuerpo desarrolla ontogenéticamente un sistema para distinguir lo propio y evitar reaccionar contra él. Cuando el sistema linfoide se está desarrollando (desde la fase fetal a la perinatal) van llegando a él componentes circulantes de las moléculas

de las distintas partes del cuerpo; así, el sistema inmune "aprende" a reconocer a estos componentes, y se provoca una incapacidad permanente para reaccionar contra ellos (se "suprimen" o inactivan los clones de linfocitos que reconocen "lo propio"). La inmunidad celular es la otra rama de la inmunidad específica La inmunidad humoral, por sí misma, sería de poca utilidad frente a patógenos intracelulares, bien sea los estrictos (virus) o facultativos (como los Mycobacterium o muchos protozoos, como las Leishmania). Para ello ha evolucionado un sistema de inmunidad celular, que está mediatizado por linfocitos T, parecidos citológicamente a los B, pero que se diferencian en el timo. Los linfocitos T reconocen al Ag extraño siempre que esté situado sobre la superficie de células del propio organismo hospedador. Pero no pueden reconocer al Ag por sí solo, sino que éste ha de estar en combinación con una molécula marcadora de la superficie celular, que le "dice" al linfocito que está en contacto con una célula "enferma". El receptor de los linfocitos T (TCR) es diferente a los Ac, aunque ambos comparten algunos rasgos estructurales. Las moléculas marcadoras de superficie pertenecen al llamado sistema principal de histocompatibilidad (MHC, de "Major Histocompatibility Complex"). Los linfocitos T, al igual que los B, se seleccionan y se activan combinándose con el antígeno (aunque necesitan junto a él moléculas MHC), lo que provoca su expansión clonal. Funcionalmente, existen dos tipos de linfocitos T: linfocitos T citototóxicos o matadores (TC); linfocitos T colaboradores o coadyuvantes ("helper") (TH); Los linfocitos T citotóxicos son los principales efectores de la inmunidad específica celular: destruyen células del propio organismo infectadas por virus. En el cuerpo existe multitud de clones distintos de TC, cada uno de los cuales posee en su superficie receptores distintos de los Ac, aunque con porciones parecidas a las de los Ac. Cada clon de TC está programado para fabricar un solo tipo de receptor, y reconoce la combinación de un determinado Ag junto con una molécula MHC de clase I, situados sobre la superficie de la célula diana enferma. De esta forma, el TC entra en estrecho contacto con la célula diana, tras de lo cual le da el llamado "beso de la muerte", consistente en la secreción de sustancias

citotóxicas, que la matan. También secreta interferón gamma (IFN-(), que tiende a reducir la diseminación del virus en caso de que éste no induzca bien el IFN-" o el IFN-8. Los linfocitos T colaboradores no tienen actividad matadora, sino que ocupan un papel central en el sistema inmune, activando a otras células: macrófagos, linfocitos TC y B. Se unen a una combinación de {Ag + MHC de clase II} presente en la superficie de macrófagos que tengan en su interior algún parásito que ha logrado sobrevivir intracelularmente. (En estos casos, el macrófago, aunque no ha logrado vencer por sí mismo al parásito, ha logrado al menos procesar y enviar a la superficie antígenos del invasor). Al unirse al macrófago de esta manera, se induce en el TH la producción de IFN-gamma y de linfocinas, que activan las funciones del macrófago, provocando la muerte intracelular del parásito. De nuevo nos encontramos con otro ejemplo de conexión entre el sistema de inmunidad natural y el adquirido. (El sistema de inmunidad adquirida, que es muy específico, y que supone un logro evolutivo "reciente" -apareció en los vertebrados- aprovecha lo que ya sabía hacer el más primitivo sistema de inmunidad natural, mejorándolo y confiriéndole especificidad de modo indirecto; esto es un buen ejemplo de que la evolución no suele desechar logros antiguos, sino que los reutiliza y modifica para integrarlos en sistemas cada vez más complejos y perfectos). Los linfocitos TH juegan un papel importante en la activación y expansión clonal de los linfocitos B para producir anticuerpos, y de los linfocitos T citotóxicos. Como se ve, la inmunidad innata y la adquirida no se dan independientes una de la otra, sino que interactúan estrechamente entre sí en toda respuesta inmune. Como ha quedado indicado, los macrófagos y otras células del sistema innato de inmunidad intervienen en la activación de la respuesta inmune específica (adquirida); por otro lado, varios factores solubles del sistema de inmunidad adquirida (citoquinas, componentes del complemento) potencian la actividad de las células fagocíticas del sistema innato. Resumiendo, podemos expresar así las principales características de las respuestas inmunes específicas: Especificidad hacia antígenos distintos. De hecho, como veremos oportunamente la especificidad es hacia porciones concretas del antígeno o partícula extraña, denominados epitopos o determinantes antigénicos. Dicha especificidad es anterior al contacto con el antígeno, y se produce durante las primeras fases de vida del individuo, en las que se originan clones diferentes de

linfocitos T y B, cada uno con un tipo de receptor capacitado para enfrentarse ulteriormente a epitopos concretos. Diversidad: el repertorio de linfocitos en cada individuo es gigantesco (se calcula que en humanos es al menos de mil millones), y se deriva de variaciones en los sitios de unión para el antígeno en los correspondientes receptores de células T y B. El origen de dichas variantes reside en un complejo conjunto de mecanismos genéticos. Memoria inmunológica, de modo que el organismo guarda recuerdo de cada agente o partícula extraña tras su primer contacto con él. En los ulteriores encuentros del sistema inmune con cada antígeno se producirá una respuesta secundaria más rápida, más intensa y en el caso de los anticuerpos, cualitativamente superior a la respuesta primaria. La memoria inmunológica se aprovecha para las técnicas de vacunación activa, que tan importantes son en la profilaxis de enfermedades infecciosas. Autolimitación, de modo que la respuesta va decayendo con el tiempo, conforme se va eliminando el agente extraño, debido a unos sistemas de retrorregulación que devuelven el sistema inmune a su nivel basal, preparándolo para nuevas respuestas. Existen varias patologías por hipersensibilidad, en las que se produce una reacción excesiva del sistema inmune, que puede ser lesiva para el hospedador. Discriminación entre lo propio y lo ajeno: durante las primeras fases ontogenéticas del individuo el sistema inmune específico "aprende" a reconocer lo propio, de modo que se induce un estado de autotolerancia (incapacidad de atacar a los componentes del propio individuo). Esto supone que los trasplantes de tejidos procedentes de donadores genéticamente distintos sean rechazados. Los fallos en este sistema de discriminación entre lo propio y lo ajeno puede desembocar en enfermedades por autoinmunidad (ataque a componentes propios). En los próximos capítulos veremos: la base celular del sistema inmune los desencadenantes de la respuesta: antígenos Anticuerpos y reacciones antígeno-anticuerpo Base genética de la diversidad de los anticuerpos Otras moléculas del sistema inmune que interactúan con los antígenos, así como el procesamiento de éstos Origen y selección de células T y sus papeles Visión global de la respuesta inmune (humoral y celular), incluyendo el contexto anatómico donde se producen Las citoquinas como factores solubles de la inmunidad adquirida Respuestas inmunes mediatizadas por inmunoglobulina IgE

Regulación de la respuesta inmunitaria y origen de la tolerancia Cómo se imbrica el sistema complemento en las respuestas inmunes A partir de este último punto entramos en aspectos más "aplicados" de la inmunología: trataremos las estrategias del sistema inmune frente a agentes externos concretos (virus, bacterias, protozoos, etc.), o hacia células cancerosas, así como diversas patologías derivadas de alteraciones del sistema inmune (hipersensibilidad, autoinmunidad, inmunodeficiencias), sin olvidar los métodos que la técnica nos suministra para manipular el sistema inmune (vacunas, injertos).

2. Células del sistema inmune ÍNDICE: 2.1 INTRODUCCIÓN * 2.2 HEMATOPOYESIS * 2.2.1 Factores hematopoyéticos de crecimiento * 2.2.2 Regulación de la hematopoyesis * 2.2.3 Muerte celular programada * 2.3 MARCADORES DE SUPERFICIE DE LEUCOCITOS * 2.4 CÉLULAS LINFOIDES * 2.4.1 Linfocitos B * 2.4.2 Linfocitos T * 2.4.3 Células agresoras naturales (NK) * 2.5 CÉLULAS MIELOIDES * 2.5.1 Los fagocitos * 2.5.2 Células dendríticas * 2.5.3 Eosinófilos * 2.5.4 Basófilos y mastocitos * 2.5.5 Plaquetas *

2.1 INTRODUCCIÓN El Sistema inmune consta de una serie de órganos, tejidos y células ampliamente repartidos por todo el cuerpo. Funcionalmente, los órganos se clasifican en primarios y secundarios. Los primeros suministran el microambiente para la maduración de los linfocitos, mientras que los segundos se encargan de capturar el microorganismo o antígeno, suministrando el entorno adecuado para que los linfocitos interactúen con él. Los distintos órganos linfoides están interconectados por vasos sanguíneos y vasos linfáticos, de modo que se constituye un sistema unitario, entrelazado y bien comunicado. Estos vasos transportan células del sistema inmune, de las cuales el tipo central es el linfocito. Algunos datos: Los linfocitos constituyen el 25% de los leucocitos sanguíneos, y el 99% de las células linfáticas. Existen unos 10 billones de linfocitos en el cuerpo humano, que equivalen a la masa del cerebro.

Aunque en la respuesta inmune intervienen varios tipos de leucocitos, sólo los linfocitos presentan las siguientes características: Especificidad Variedad (diversidad) Memoria inmunológica Reconocimiento de lo propio y lo ajeno

2.2 HEMATOPOYESIS La hematopoyesis consiste en la formación y desarrollo de células sanguíneas a partir de la célula madre pluripotencial (stem cell). Durante las primeras semanas embrionarias se encuentran células madres en el saco vitelino, las cuales van diferenciándose en células eritroides, provistas de hemoglobina embrionaria. Desde el tercer mes hasta el séptimo de embarazo, las células madre migran, primero al hígado fetal, y después al bazo fetal, donde sigue la heamtopoyesis. Desde el séptimo mes, va disminuyendo la hematopoyesis en el hígado y bazo, hasta que desaparece para la época del nacimiento, y va adquiriendo preeminencia el papel de la médula ósea.

Todas las células sanguíneas proceden de la citada célula madre pluripotencial. En la médula ósea sólo hay una de tales células por cada 10.000 totales. Son células capaces de autorregeneración, de modo que durante la vida adulta se mantienen homeostáticamente. En circunstancias de alta demanda de células sanguíneas aumenta la capacidad proliferativa de la célula madre. Ejemplo: Un ratón irradiado con rayos X (950 rad) moriría al cabo de unos 10 días; pero si le infundimos sólo diez mil o cien mil células de médula ósea de un ratón singénico, se reconstituye todo su sistema hematopoyético.

Como se puede ver, tanto en el linaje linfoide como en el mieloide, los progenitores quedan "comprometidos" o determinados a seguir una determinada ruta de diferenciación; ello se debe a que adquieren la capacidad de responder a determinados factores de crecimiento. En la médula ósea adulta, las células de la línea hematopoyética van madurando y diferenciándose en el interior de un estroma compuesto por células no hematopoyéticas (células grasas, endoteliales, fibroblastos, etc.). La maduración se debe al microambiente suministrado por la matriz celular del estroma junto con factores difusibles o no difusibles. Entre los difusibles se encuentran diversos factores de crecimiento. Las células ya diferenciadas adquieren deformabilidad de membranas, lo cual les permite pasar a través de la pared sinusoidal, a los senos de la medula ósea, desde donde acceden a la circulación general.

2.2.1 Factores crecimiento

hematopoyéticos

de

Las células hematopoyéticas requieren factores de crecimiento se requieren para: supervivencia multiplicación diferenciación maduración Hay varios tipos de factores: 1. Factores estimuladores de formación de colonias (CSF), pertenecientes a la familia de las glucoproteínas ácidas. Ejemplos: multi-CSF (también llamado IL3, es un factor multilinaje; GM-CSF (estimulador de la línea granulocitomacrófago); M-CSF (de la línea que conduce al monocito-

macrófago); G-CSF (de la línea que desemboca en los granulocitos). 2. Eritropoyetina (EPO), que se produce en el riñón, y que estimula la línea que, vía progenitor eritroide conduce a los eritrocitos. 3. Otros factores: principalmente las interleuquinas IL-4 a IL-9, segregadas por células estromales, macrófagos activados, etc.

2.2.2 Regulación de la hematopoyesis La hematopoyesis se mantiene durante toda la vida del individuo, de modo que el número de células nuevas equilibra al de células que se pierden o mueren. Cada tipo celular tiene una vida media más o menos característica:

los eritrocitos viven unos 120 días, al cabo de los cuales son fagocitados por los macrófagos del bazo los neutrófilos duran unos pocos días algunos linfocitos T duran más de 30 años. El cuerpo humano produce unos 400 000 millones de células de la línea hematopoyética cada día. La hematopoyesis está regulada de forma muy fina, de modo que cada tipo celular tiene un control diferente, pero además, esta regulación es lo suficientemente flexible para permitir incrementos de 10 o 20 veces ante una infección o una hemorragia. La regulación de fase estacionaria (en ausencia de infección o de hemorragia) se logra por la producción controlada de citoquinas por parte de las células estromales de la médula ósea. Ante una infección o hemorragia se produce una hematopoyesis inducible (incrementada), por la acción de citoquinas segregadas por macrófagos y linfocitos TH: se incrementa la cantidad de células específicas de la médula ósea, que al madurar tenderán a migrar al foco de infección o lesión.

2.2.3 Muerte celular programada Como ya dijimos, en cada linaje hematopoyético existe un equilibrio entre la producción de células nuevas y la destrucción de células adultas. Esta destrucción ocurre por la llamada muerte celular programada o apoptosis: la célula disminuye de tamaño (se encoge);

se modifica su citoesqueleto, lo cual se refleja en que la membrana celular se arruga; la cromatina se condensa en varias zonas del núcleo (fenómeno de picnosis); el ADN se fragmenta en múltiplos de unos 200 pb, el equivalente al que existe en cada nucleosoma, debido a la acción de nucleasas, que cortan por la región internuclesómica (ello se ve bien por el patrón "en escalera" del ADN sometido a electroforesis en gel de agarosa); los núcleos se fragmentan. Al final, la célula se descompone en varios trozos, los llamados cuerpos apoptósicos, que rodeados de membrana, pueden contener orgánulos intactos. Los fagocitos profesionales (macrófagos y leucocitos polimorfonucleares) finalmente fagocitan y degradan los cuerpos apoptósicos: de esta forma se logra que el contenido de las células viejas no se libere al exterior, con lo que se evita la respuesta inflamatoria. Este mecanismo de muerte celular programada se opone al fenómeno de la necrosis (por ejemplo, la que se genera por algún daño tisular). En la necrosis las células se hinchan y terminan estallando, liberando sus contenidos al exterior, lo cual produce efectos citotóxicos en otras células, desarrollándose una inflamación junto con destrucción de tejido. ¿Qué hace que una célula moribunda o un cuerpo apoptósico sea reconocido por los fagocitos para su ingestión y destrucción intracelular? Al parecer, existe una serie de cambios en su superficie que permiten ese reconocimiento: la célula pierde ácido siálico, de modo que quedan expuestos los azúcares de la membrana, los cuales son reconocidos por lectinas de los fagocitos; los fagocitos liberan la trombospondina, que sirve de puente entre el fagocito y la célula moribunda (tiene un sitio de unión que reconoce un receptor de la célula apoptósica, y otro sitio que se engarza con integrinas del fagocito); se exponen al exterior cadenas de fosfatidil-serina de la célula a eliminar, que son reconocidos por un receptor de los fagocitos. La apoptosis posee un claro sentido evolutivo y adaptativo: evita daños inflamatorios de la necrosis; el suicidio ("altruismo citológico") de las células es beneficioso para el individuo. Esto es especialmente cierto para los linfocitos, que tienen per se una gran capacidad proliferativa, y que están casi en el límite de su "potencial cancerígeno".

Al menos en algunos casos, la apoptosis es una muerte celular programada genéticamente, que forma parte del repertorio de respuestas adaptativas de la célula ante ciertos estímulos o ante la ausencia de otros. Existen dos clases principales de genes implicados: myc, p53: inductores de la apoptosis en ausencia de ciertas señales de supervivencia; bcl2 y otros: inhibidores de apoptosis en presencia de ciertas señales de "rescate"

2.3 MARCADORES DE SUPERFICIE DE LEUCOCITOS Los linfocitos y otros leucocitos, así como sus precursores hematopoyéticos, presentan patrones característicos de moléculas de superficie, que pueden ser aprovechadas como marcadores para distinguir y caracterizar distintas poblaciones celulares. Esta caracterización se realiza mediante anticuerpos monoclonales (AcMo); cada anticuerpo monoclonal distingue un solo tipo de molécula, e incluso partes específicas y variantes de cada tipo de molécula. Durante varios años, cada grupo de investigación bautizaba a las moléculas según su propia nomenclatura, lo que creó un auténtico galimatías de denominaciones sinónimas de las mismas moléculas. Afortunadamente, en 1982 se celebró un "Taller de antígenos de diferenciación de leucocitos humanos" que llegó a una nomenclatura unificada así como a normas para la aceptación y denominación de nuevos marcadores. Dicha nomenclatura se basa en los llamados grupos de diferenciación (CD, "cluster of differentiation"): consisten en todos los AcMo que reconocen una determinada molécula de membrana leucocitaria. En la práctica, se concede la denominación de "CDx" (siendo "x" un guarismo árabe determinado) a cada molécula de superficie caracterizada por ese conjunto de anticuerpos monoclonales. Podemos considerar varias clases de marcadores: de linaje (p. ej., el CD3 sólo existe en el linaje que conduce a los linfocitos T); de maduración (ej.: el CD1 sólo aparece en las fases madurativas de células T en el timo); de activación (p. ej., el CD25 es el receptor de la citoquina IL-2, y sólo se expresa en aquellas células T estimuladas previamente por el antígeno).

Como veremos oportunamente, a pesar de la gran diversidad de CDs, muchas de ellas presentan homologías mutuas, pudiéndose agrupar en familias e incluso superfamilias que comparten un origen evolutivo común, por medio de los mecanismos de duplicación de algún gen ancestral, con ulterior divergencia de secuencias de cada copia. A título ilustrativo, veamos algunas familias de marcadores:

Superfamilia de las inmunoglobulinas , donde se incluyen CD2, CD3, CD4, CD8. Familia de las integrinas: cada miembro de esta familia consta de dos cadenas, α y β . Se distinguen distintas subfamilias, dependiendo del tipo de cadena ß. Selectinas (que tienen especificidad de lectinas). Proteoglucanos (como el CD44), que se unen a componentes de la matriz extracelular.

2.4 CÉLULAS LINFOIDES Los linfocitos T y B son los responsables de la respuesta inmune específica. Se producen en los órganos linfoides primarios a razón de 1000 millones al día, y de allí migran a órganos linfoides secundarios y a espacios tisulares. En el adulto existe un billón de linfocitos, equivalentes a un 2% del peso corporal. Suponen del 20 al 40% de los leucocitos totales. Existen tres poblaciones de linfocitos funcionalmente distintas, caracterizada cada una por un juego de marcadores, pero son difíciles de reconocer morfológicamente entre sí: 1. células T 2. células B 3. células NK Los linfocitos T y B vírgenes (no cebados) son pequeños (unas 6 μ m de diámetro), con poco citoplasma, que forma un estrecho anillo alrededor del núcleo. Poseen cromosomas condensados, con abundante heterocromatina; albergan pocas mitocondrias, y apenas nada de retículo endoplásmico ni de complejo de Golgi. En sí mismos, en ausencia del Ag específico, tienen vida corta (de unos días a unas pocas semanas), y fácilmente sufren muerte celular programada. En cambio, si entran en contacto con el Ag a partir de sus

receptores específicos, sales de la fase G0 y entran en el ciclo celular (G0 Æ G1 -Æ S Æ G2 Æ M). En la fase G2 corresponden a linfoblastos: aumentan su tamaño (15 μ m), aumenta algo la eucromatina, aparece un nucleolo patente y aumenta la proporción del citoplasma, donde se puede observar un A. de D. bien desarrollado. Estos linfoblastos proliferan y finalmente se diferencian en dos subpoblaciones: 1. células efectoras, de vida corta, con REr bien desarrollado en capas concéntricas, y vesículas de A. de G. 2. células de memoria, que están en G0, con vida larga (algunas duran toda la vida del individuo).

2.4.1 Linfocitos B En los mamíferos, los linfocitos B se diferencian en la médula ósea, mientras que en las aves lo hacen en la bursa o bolsa de Fabricio. Constituyen del 5 al 15% de los linfocitos circulantes. Reconocen al antígeno en forma soluble, por medio de sus inmunoglobulinas de membrana (mIg), que forman parte del complejo receptor de las células B (BCR). En cada linfocito hay unas 150.000 moléculas de mIg (de las clases M y D), que han sido sintetizadas por él. Todas estas moléculas poseen la misma especificidad antigénica. Acompañando a cada mIg, unidas no covalentemente con ésta, existen dos tipos de cadenas acompañantes, llamadas Igα e Igβ , que son invariantes. Otros marcadores de superficie: MHC II receptores para el complemento: CD35 (=CR1) y CD21 (=CR2) receptor para IgG exógena: CD32 (=FcγRII), que juega un papel en las señales negativas para el linfocito B En ausencia de estímulo antigénico, estos linfocitos B maduros vírgenes mueren por apoptosis al cabo de unos pocos días. Si, en cambio, se une por su BCR al Ag complementario específico (y con la ayuda de señales de macrófagos y células T), se pone en marcha la selección y proliferación clonal, que termina (al cabo de 4-5 días) con la diferenciación de dos subpoblaciones: una de células plasmáticas secretoras de Ac, y otra de células B de memoria (cebadas). Las células plasmáticas poseen las siguientes características: carecen de Ig de membrana. Son mayores y con más proporción de citoplasma que las B de las

que proceden. Su RE está muy desarrollado. Esto explica la gran cantidad de Ac secretados que producen; esos anticuerpos poseen la misma especificidad antigénica que la de las mIg de la célula B original. No circulan por la sangre ni por los vasos linfáticos, sino que se localizan en los órganos linfoides secundarios y los lugares de la respuesta inmunológica. Viven unos pocos días; al ser células en fase de diferenciación terminal, carecen de capacidad mitótica, y mueren por apoptosis. Los linfocitos B cebados de memoria, en cambio, pueden vivir en reposo durante largos períodos (más de 20 o 30 años). Cuando se exponen al Ag específico, dan una respuesta inmunitaria más rápida, más intensa, y con mayor afinidad. Su aspecto es similar al de los linfocitos B vírgenes.

2.4.2 Linfocitos T Durante la infancia, se diferencian en el timo, pero al llegar la adolescencia, el timo regresiona, y entonces la diferenciación ocurre sobre todo en la piel y mucosa intestinal. Poseen un receptor de membrana (TCR) asociado no covalentemente al llamado complejo CD3, lo que conjuntamente se denomina complejo receptor de las células T. Aunque el TCR es diferente estructuralmente a las Ig, posee zonas homólogas. Una diferencia importante del modo de reconocimiento antigénico del TCR respecto del BCR es que aquél sólo interacciona con el Ag dispuesto en la superficie de células del propio organismo (de hecho, el antígeno procede de procesamiento proteolítico, y le es "enseñado" al linfocito T asociado a moléculas de MHC). Existen dos tipos de TCR, que definen dos poblaciones diferentes de linfocitos T: TCR2 TCR1 La mayoría (85%) de las células T poseen el TCR2, y a su vez se pueden dividir en dos tipos: Las TCR2 CD4+ funcionan como células cooperadoras (TH): reconocen el Ag expuesto por el MHC-II propio de células presentadoras de Ag (APC), y al hacerlo, se activan y expanden clonalmente, secretando citoquinas que juegan un papel clave en la activación de otras células (B, T, etc.). A microscopio, la mayoría muestran el llamado corpúsculo de Gall (un grupo de lisosomas primario junto con gotitas de lípidos). Las TCR2 CD8+ generalmente funcionan como células T citotóxicas o matadoras (Tc). Un 65% de ellas poseen cuerpo de Gall. Reconocen el Ag expuesto en moléculas MHC-I de células propias infectadas con virus o cancerosas, lo cual, junto con las señales

adecuadas de citoquinas, provoca la activación y proliferación clonal, con diferenciación a linfocitos T citolíticos (CTL), que matan extracelularmente a las células propias enfermas. Por supuesto, en cada uno de estos casos de activación, proliferación y diferenciación, se genera paralelamente una subpoblación de linfocitos de memoria.

Durante mucho tiempo se habló de una tercera categoría de linfocitos T, los llamados supresores (Ts), pero su existencia como población diferenciada parece estar descartada. Los linfocitos TCR1 se descubrieron hace poco. Suponen sólo el 15% de los T totales, pero no son circulantes, sino que se localizan en ciertos epitelios (por ejemplo, los linfocitos intraepiteliales del intestino). Parece que están especializados en reconocer ciertos patógenos (por ejemplo, micobacterias), que tienden a entrar por las mucosas.

2.4.3 Células agresoras naturales (NK) A diferencia de otros linfocitos, carecen de especificidad y de memoria, por lo que forman parte del sistema de inmunidad natural o inespecífico. Representan el 15-20% de los linfocitos sanguíneos. Sus marcadores distintivos son CD16 y CD57, pero carecen de marcadores de los linfocitos del sistema específico. Su maduración es extratímica. La mayoría (no todos) son linfocitos granulares grandes (LGL), con mayor proporción de citoplasma que los linfocitos T o B. Poseen mitocondrias y ribosomas libres, pero poco REr. Exhiben gran A. de G. Lo que más destaca a microscopio es la existencia de unos gránulos azurófilos densos a los electrones, delimitados por membrana. Poseen dos tipos de funciones: acción citotóxica acción reguladora del sistema inmune a través de las citoquinas que producen. Como células citotóxicas, su papel fisiológico se está empezando a comprender sólo recientemente: existen buenos indicios de que eliminan por inducción de apoptosis a células propias infectadas con virus o células tumorales. Ello lo realizan porque reconocen células propias enfermas en base a que éstas poseen menos moléculas MHC-

I. También pueden desarrollar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

2.5 CÉLULAS MIELOIDES Las células mieloides son: Fagocitos: leucocitos polimorfonucleares neutrófilos monocitos, que a su vez se diferencian a macrófagos. Células dendríticas. Eosinófilos Basófilos Mastocitos

(PMN)

y

2.5.1 Los fagocitos Los granulocitos neutrófilos y los monocitos/macrófagos poseen un origen común. Su antecesor ontogenético es la célula pruripotencial mielo-monocítica (CFU-GM), que se diferencia en dos líneas.

2.5.1.1 Polimorfonucleares neutrófilos Constituyen más del 90% de los granulocitos (polimorfonucleares) Son de vida corta (2-3 días), y se producen en la médula ósea a razón de unos cien mil millones al día. Son circulantes, salvo cuando son reclutados a tejidos en inflamación. Su núcleo es multilobulado (de 2 a 5 lóbulos). Posee gránulos citoplásmicos de dos tipos: los azurófilos (primarios) y los específicos (secundarios). Tras salir de la médula ósea, circulan por la sangre durante 7-10 horas, y luego pasan a tejidos, donde mueren a los 2-3 días. Cuando hay infección, la médula ósea produce más cantidad de neutrófilos (la leucocitosis de neutrófilos es un indicio clínico de infección). Son los primeros fagocitos en llegar a la zona de infección, atraídos por quimiotaxis debida a sustancias liberadas en el foco de la infección. Al llegar al foco, actúan como fagocitos: ingieren la partícula extraña, incluyéndola en un fagosoma, al que fusionan sus gránulos: Gránulos azurófilos (primarios): son mayores y más densos, con típica morfología de lisosoma. Contienen mieloperoxidasa y agentes antimicrobianos no oxidantes (defensinas, catepsina G y algo de

lisozima). Gránulos específicos (secundarios): son más pequeños y menos densos a los electrones; contienen la mayor parte de la lisozima de la célula, así como lactoferrina y fosfatasa alcalina. Ambos tipos de gránulos se fusionan con el fagosoma, para digerir y eliminar la partícula extraña, con mecanismos dependientes de oxígeno más potentes que los del macrófago. Estas células constituyen una buena barrera defensiva frente a bacterias piogénicas.

2.5.1.2 Fagocitos mononucleares El sistema fagocítico mononuclear (SFM) está constituido por los monocitos circulantes y los macrófagos tisulares. Los promonocitos de la médula ósea, al madurar salen de ella, diferenciándose en monocitos circulantes, que al cabo de unas 8 horas emigran a distintos tejidos, donde se convierten en macrófagos. 1) Monocitos Son células de unos 10-18 μ m de diámetro, con núcleo en forma de herradura o de pera. Su membrana, vista al microscopio electrónico, aparece con finas rugosidades. Su citoplasma posee gránulos azurófilos, que al microscopio electrónico son densos y homogéneos. Dichos gránulos son lisosomas que contienen peroxidasa e hidrolasas ácidas importantes para el mecanismo de muerte intracelular de microorganismos. El aparato de Golgi está bien desarrollado, y se observan mitocondrias. 2) Macrófagos Como ya dijimos, al cabo de unas 8 horas de su salida de la médula, los monocitos migran a tejidos y se diferencian a macrófagos. Los macrófagos pueden ser residentes (fijos en tejidos) o libres. residentes: cumplen misiones concretas en cada uno de los tejidos, pudiendo recibir, en su caso, denominaciones peculiares. Por ejemplo: células de Kupffer, en las paredes vasculares de los sinusoides hepáticos células mesangiales de los glomérulos renales macrófagos alveolares de los pulmones

macrófagos de las serosas (p. ej., de la cavidad peritoneal) células de la microglía del cerebro osteoclastos de los huesos histiocitos del tejido conjuntivo libres: están estratégicamente situados para atrapar material extraño en órganos linfoides secundarios: macrófagos de los sinusoides esplénicos (en el bazo) macrófagos de los senos medulares (en los ganglios linfáticos) Características principales: Los macrófagos son células de vida más larga que los neutrófilos (meses e incluso años). Poseen un núcleo en herradura. En su citoplasma se ve un abundante retículo endoplásmico rugoso y gran número de mitocondrias. Están especialmente adaptados a luchar contra virus, bacterias y protozoos intracelulares. Los fagocitos mononucleares constituyen el mejor ejemplo de células que, siendo en principio del S.I. natural, en el curso de la evolución se han adaptado a jugar papeles centrales en el S.I. adaptativo: A) En la respuesta inmune natural: los fagocitos presentan dos tipos de actividades: como tales fagocitos como productores de citoquinas 1) Actividad fagocítica: Los fagocitos engullen (fagocitan) partículas extrañas (microorganismos macromoléculas extrañas), células propias lesionadas o muertas y restos celulares.

y

El fagocito se ve atraído por quimiotaxis, se adhiere por receptores al microorganismo o partícula extraña, con lo que se activa la membrana del fagocito, emitiendo pseudópodos (basados en el sistema contráctil de actina-miosina), que finalmente se fusionan, cerrándose y creándose una vesícula membranosa que engloba al antígeno, denominada fagosoma. La destrucción intracelular de la partícula extraña comienza con la entrada del fagosoma en la ruta endocítica: el fagosoma se fusiona con los gránulos, para formar el fagolisosoma. El contenido vertido de los gránulos, junto con otras actividades del macrófago, supone una batería de mecanismos microbicidas y microbiostáticos, además de enzimas hidrolíticas que digieren las macromoléculas. El material de desecho se elimina por

exocitosis. Este sería el mecanismo fagocítico básico (muy similar al ya existente en protozoos amebianos), pero dicho mecanismo primitivo se ve mejorado (unas 4.000 veces) por medio de otros componentes del sistema inmune: se trata de un conjunto de moléculas, denominadas opsoninas, que recubren al microorganismo, y que sirven de vínculo de unión entre la partícula invasora y el fagocito. Como ejemplo de opsoninas se cuentan la IgG (para la que el fagocito posee el receptor Fcγ R) y el componente C3b del complemento (para el que el fagocito dispone del receptor CR1). Las actividades antimicrobianas serán estudiadas en detalle en un capítulo posterior (veáse 13.2). Aquí sólo daremos una clasificación de las mismas: I. II.

mecanismos dependientes de oxígeno: A. intermediarios reactivos de oxígeno (ROI) B. intermediarios reactivos de nitrógeno (RNI) mecanismos independientes de oxígeno: proteínas antimicrobianas preformadas: A. péptidos catiónicos como las defensinas B. catepsina G (proteinasa neutra) C. lisozima D. lactoferrina (secuestra Fe y altera las proteínas de FeS

2) Producción de citoquinas: Los macrófagos producen citoquinas que atraen a otras células, sobre todo a PMN neutrófilos. Como veremos, dichas citoquinas son las responsables de muchos de los efectos sistémicos de la inflamación (p. ej., la fiebre). También producen factores para fibroblastos y células endoteliales, que promueven la reparación de los tejidos dañados. B) Papel de los fagocitos como células accesorias en las respuestas inmunes específicas 1. Como células presentadoras de antígeno (APC): Como dijimos, no todo el Ag se degrada totalmente en la ruta endocítica. Como veremos oportunamente, quedan péptidos de unos 10 aminoácidos de longitud, que se asocian dentro del endosoma con moléculas MHC de tipo II. Los complejos {MHC-II + péptido} de la vesícula emigran a la membrana citoplásmica, con lo que quedan expuestos en la superficie del macrófago, listos para ser reconocidos por los linfocitos TH específicos, para su activación. 2. Los macrófagos son activados por los linfocitos THLos linfocitos TH activados tras su contacto con las células presentadoras secretan a su vez citoquinas que activan a los macrófagos, con

lo que éstos mejoran sus capacidades fagocíticas y destructivas. De esta forma, los macrófagos activados por citoquinas sirven como células efectoras de la inmunidad celular. 3. Los macrófagos activados son a menudo los efectores finales de las respuestas humoralesConforme avanza la respuesta inmune, se produce IgG y se activa el complemento, los cuales sirven como opsoninas que ayudan al macrófago a sus funciones fagocíticas y citotóxicas (mejoras en un factor de 4.000). Por ello, el macrófago es frecuentemente en encargado final de eliminar al microorganismo en la rama humoral de la inmunidad. En resumen, el macrófago cumple un papel central en el sistema inmune, participando tanto en la fase de reconocimiento como en la de presentación del Ag y en la efectora.

2.5.2 Células dendríticas Son células con morfologías características: del cuerpo celular salen unas prolongaciones alargadas, lo que le da aspecto parecidos a los de las células dendríticas nerviosas. Existen dos tipos de células dendríticas, con funciones y propiedades diferentes, aunque ninguna presenta una actividad fagocítica importante. 2.5.2.1 Células dendríticas interdigitantes Aparentemente derivan de precursores mieloides de la médula ósea, quizá como un rama "hermana" de las células del SFM. Están presentes en los intersticios de la mayor parte de los órganos (corazón, pulmón, hígado, riñón, tracto gastrointestinal). El prototipo es la célula de Langerhans de la piel, muy rica en MHC-II. Cuando entran en contacto con un Ag, migran como células "a vela" por los vasos linfáticos aferentes hasta llegar a la paracorteza de los ganglios linfáticos regionales, donde se convierten en células dendríticas interdigitantes. Allí presentan el Ag a los linfocitos TH, para que se inicie la respuesta inmune. Parece ser que las células de Langerhans son también las precursoras de las células dendríticas interdigitantes de los órganos citados anteriormente, y de las de las áreas ricas en células T del bazo y del timo. Estas células dendríticas son las más potentes inductoras de respuestas inmunes restringidas por MHC-II.

Además, son mejores que otras células presentadoras en la misión de presentar autoepitopos procesados a las células T restringidas por MHC-II, por lo que juegan un papel importante en la autotolerancia.

2.5.2.2 Células dendríticas foliculares No derivan de la médula ósea, y no parece que tengan que ver con las dendríticas interdigitantes. Están presentes en los folículos secundarios de las áreas ricas en células B de los ganglios y del bazo, así como en los folículos linfoides asociados a mucosas. No tienen moléculas MHC-II en su superdicie, pero presentan gran cantidad de receptores para el complemento (CR1 y CR2) y para las IgG (el Fcγ R). Los inmunocomplejos (complejos Ag-Ac) llegan a las áreas de células B de estos órganos linfoides secundarios, y allí quedan retenidos un cierto tiempo: se unen a los receptores para Fc de estas células, que son muy abundantes en sus "perlas" (engrosamientos esféricos espaciados regularmente a lo largo de sus prolongaciones). Parece que estas células desempeñan un papel esencial en el desarrollo de las células B de memoria.

2.5.3 Eosinófilos Son granulocitos (es decir, PMN) presentes en sangre y tejidos, y constituyen del 1 al 3% de los leucocitos del individuo sano. Poseen núcleo bilobulado, citoplasma con abundantes gránulos de contenido básico, por lo que se tiñen regularmente con colorantes ácidos como la eosina. Estos gránulos están rodeados de membrana, pero al microscopio electrónico muestran en su interior unos cristaloides. Son células móviles que pueden migrar desde la sangre a los tejidos, atraídas por factores quimiotácticos (como el ECF-A) Aunque tienen algún papel fagocítico, éste es mucho menos importante que en los neutrófilos. Su función principal es la defensa inespecífica frente a grandes parásitos, como helmintos: se unen a las larvas esquistosómulas de helmintos previamente recubiertas por IgE o IgG, y entonces se degranulan, vertiendo una toxina (proteína básica) y enzimas que controlan la respuesta inflamatoria, hidrolizando factores anafilácticos liberados por los mastocitos.

2.5.4 Basófilos y mastocitos Constituyen menos del 1% de los leucocitos. Su núcleo es bi- o multilobulado (basófilo)

o

redondeado

(mastocito). Poseen abundantea gránulos azul-violeta, densos a los electrones. Carecen de función fagocítica. Parece que los mastocitos derivan de la misma rama que los basófilos, pero mientras estos últimos son circulantes, los mastocitos residen en los tejidos. Ambos poseen abundantes receptores Fcε RI Papel central en la hipersensibilidad inmediata (llamada de tipo I, que incluye las alergias): el entrecruzamiento de alergeno con dos o más moléculas de IgE unidas a la célula provoca la rápida y total desgranulación, con lo que se liberan sustancias farmacológicamente activas, incluyendo la histamina, que es la responsable principal de los síntomas alérgicos. A pesar de este papel "negativo", su misión natural positiva estriba en proporcionar protección frente a parásitos multicelulares.

2.5.5 Plaquetas Son células anucleadas, que derivan de los megacariocitos de la médula ósea. Su papel no inmune consiste en colaborar en la coagulación de la sangre. Su papel inmune se centra en los fenómenos de inflamación: cuando existe daño a las células endoteliales, las plaquetas se adhieren al tejido lesionado y se agregan, liberando sustancias que incrementan la permeabilidad, y factores que activan el complemento, con lo que logran atraer a leucocitos.

3. Órganos y sistema inmune

tejidos

del

ÍNDICE: 3.1 INTRODUCCIÓN * 3.2 ÓRGANOS LINFOIDES PRIMARIOS * 3.2.1 Timo * 3.2.2 Sitios de desarrollo de linfocitos B: médula ósea (mamíferos) y bolsa de Fabricio (aves). * 3.3 ÓRGANOS LINFOIDES SECUNDARIOS * 3.3.1 Sistema linfático y ganglios linfáticos * 3.3.2 Bazo * 3.3.3 El sistema linfoide mucosal, no capsulado (MALT) * 3.3.4 Células linfoides de la piel * 3.3.5 La médula ósea como órgano linfoide secundario * 3.4 ÁREAS INMUNOLÓGICAMENTE PRIVILEGIADAS * 3.5 RECIRCULACIÓN LINFOCITARIA *

3.1 INTRODUCCIÓN El sistema linfoide está formado por varios tipos de células: linfocitos células accesorias, principalmente macrófagos y otras células presentadoras de antígenos (APC) (en algunos casos) células epiteliales y funcionalmente está organizado en dos tipos de órganos linfoides: I.

órganos linfoides primarios o centrales, que A. proporcionan el entorno para la maduración de linfocitos (linfopoyesis), de modo que los linfocitos adquieren su repertorio de receptores específicos para cada tipo de antígeno; B. los linfocitos se seleccionan de modo que poseen autotolerancia (evitación de la autoinmunidad). Los órganos linfoides primarios son: el timo, donde maduran los linfocitos T la médula ósea en el adulto como órgano de maduración de los linfocitos B En el feto temprano esta función la toma el hígado, aunque paulatinamente se ve sustituido por la medula. En las aves, el equivalente funcional de la médula es la Bolsa de Fabricio.

II.

Órganos linfoides secundarios o periféricos, que A. proporcionan el entorno para que los linfocitos interaccionen entre sí, o con las APC y otras células accesorias, y para que entren en contacto con el antígeno; B. diseminan la respuesta inmune al resto del cuerpo. Los órganos linfoides secundarios son: los ganglios linfáticos, que recogen Ag de los tejidos el bazo, que recoge Ag de la sangre tejidos linfoides asociados a mucosas (MALT), que recogen Ag

de las mucosas en la respuesta secundaria, la médula ósea actúa igualmente como órgano secundario.

3.2 ÓRGANOS LINFOIDES PRIMARIOS 3.2.1 Timo Es un órgano plano y blando situado en la cavidad torácica, por encima del corazón. Está formado por dos lóbulos rodeados por cápsula de tejido conjuntivo. A su vez, los lóbulos están divididos en lobulillos separados entre sí por trabéculas de tejido conjuntivo. Cada lobulillo tímico está relleno de células linfoides denominadas timocitos, dispuestas en una corteza de gran densidad celular y una médula (interior) de menor densidad celular. Desde la corteza hasta la médula existe un gradiente de diferenciación, de modo que en la corteza se encuentran los timocitos más inmaduros, mientras que en la médula se localizan los timocitos en fases madurativas más avanzadas. Tanto la corteza como la médula están rellenas de una red de células no linfoides que constituyen el estroma tímico, y que consta de varios tipos celulares: A. tres tipos de células epiteliales: 1. en la corteza más éxterna, las células nodriza 2. en la corteza, células corticales epiteliales 3. en la médula, células medulares epiteliales. B. Células dendríticas interdigitantes sobre todo en el límite cortico-medular. C. Macrófagos, con una localización similar a las dendríticas. Todas estas células no linfoides del estroma expresan en sus superficies moléculas MHC de tipo I y/o II, y participan en la maduración y selección de los timocitos hacia células T maduras. En la médula tímica aparecen los denominados corpúsculos de Hassall: acúmulos concéntricos de células epiteliales. Su función es desconocida, pero su número va aumentando con la edad. En un capítulo ulterior veremos en detalle el proceso de maduración intratímica de los linfocitos, pero daremos aquí un breve adelanto: Los progenitores linfoides de los linfocitos, procedentes de la médula ósea, entran en el timo y comienzan a dividirse activamente en la corteza; sin embargo, allí mueren por apoptosis

más del 95% de las células generadas, que son eliminadas por los macrófagos. Los sobrevivientes van emigrando hasta la médula, donde terminan de madurar, y salen del timo como células T vírgenes maduras (inmunocompetentes), por medio de las vénulas postcapilares del timo. Durante todo este proceso los timocitos han ido interactuando con células estromales provistas de MHC en sus membranas (células nodriza Æ células corticales epiteliales Æ células dendríticas), produciéndose dos fases de selección de timocitos: selección positiva: sólo sobreviven aquellos timocitos que hayan generado receptores TCR capaces de reconocer moléculas MHC propias; los demás mueren por apoptosis. selección negativa: se eliminan por muerte celular programada los timocitos que habiendo superado la selección positiva hayan resultado autorreactivos, es decir, los timocitos que reconozcan moléculas del propio individuo (autoantígenos) presentadas por el MHC propio, o que tengan una afinidad demasiado alta hacia el MHC propio solo De esta forma sólo salen como linfocitos T maduros aquellas célula autotolerantes (no inmunidad a lo propio) y capaces de reconocer antígenos (moléculas extrañas al propio individuo) en el contexto del haplotipo propio del MHC.

El timo de los mamíferos va involucionando con la edad, a partir de la pubertad. En humanos, al nacer, el timo pesa 10-15 g, alcanza su orto en la adolescencia, época en la que llega a pesar 40-70 g, y va regresionando, de modo que en la vejez sólo pesa 3 g, aunque siempre queda un remanente de zona medular.

Por lo tanto, en la vida adulta, la producción de linfocitos T en el timo decae bastante, aunque siempre existe una actividad residual. Evidencias sobre la relación entre función tímica y respuesta inmune: 1. La timectomía neonatal en ratones provoca que disminuyan acentuadamente los linfocitos T circulantes, y se induce una ausencia de inmunidad específica celular. 2. Los ratones transgénicos noqueados ("ratones K.O.") de tipo nude ("desnudos") tienen un defecto genético que impide el desarrollo del timo. Estos ratones presentan una sintomatología similar a la descrita en el párrafo anterior.

3. En humanos existe una enfermedad genética conocida como síndrome de DiGeorge, en el que no se desarrolla el timo: los efectos son igualmente la carencia de linfocitos T y la ausencia de respuesta inmune celular específica. En la fase adulta, cuando el timo ha involucionado, sigue habiendo maduración de linfocitos T en otros lugares, principalmente en el epitelio intestinal, donde se produce linfopoyesis de célula T γδ y T αβ, que permanecen en el epitelio intestinal o migran a la lámina propia.

3.2.2 Sitios de desarrollo de linfocitos B: médula ósea (mamíferos) y bolsa de Fabricio (aves). La Bolsa (bursa) de Fabricio es una porción especial dorsal de la cloaca, con una estructura a base de corteza y médula. La médula ósea en los adultos de los mamíferos es un equivalente "disperso" de la Bolsa de Fabricio. La porción implicada en la maduración de los linfocitos B está constituida por islas de tejido hematopoyético. Precisamente por su carácter difuso es más difícil de estudiar que la Bolsa.(Estudiaremos la maduración de los linfocitos B en el capítulo 8).

3.3 ÓRGANOS LINFOIDES SECUNDARIOS Los linfocitos maduros vírgenes que salen de los órganos linfoides primarios emigran a los órganos y tejidos linfoides periféricos: I.

II.

III.

Capsulados: en ellos se produce la secreción de Ac que se distribuirán por la circulación; también se dan respuestas celulares locales. A. ganglios (recogen Ag de la piel y de superficies internas) B. bazo (recoge Ag de la sangre) Órganos no capsulados asociados a mucosas (MALT): protegen del Ag que entre directamente a través de mucosas (gastrointestinal, respiratoria, genitourinaria). Su respuesta es la secreción de inmunoglobulina A secretoria (sIgA), que recubrirá la superficie mucosal (epitelial). .Acúmulos más o menos difusos (no capsulados), dispersos por casi todo el cuerpo.

3.3.1 Sistema linfático y ganglios linfáticos El componente fluido de la sangre (plasma) se extravasa desde los capilares a los tejidos, generando el líquido intersticial. Parte de éste retorna a la sangre a través de las membranas capilares, pero el resto, llamado linfa, fluye desde los tejidos conectivos a una red de finos capilares linfáticos abiertos, y de allí va pasando a vasos cada vez mayores (vasos linfáticos). Finalmente, la linfa llega al mayor vaso linfático, denominado conducto torácico, que descarga a circulación sanguínea a nivel de la subclavia izquierda (cerca del corazón). De este modo se cumple una de las funciones del sistema de vasos linfáticos: capturar fluido procedente de los tejidos y reingresarlo en la sangre, asegurando niveles estables de fluido en el sistema circulatorio. El corazón no influye sobre la circulación de la linfa: ésta avanza en un solo sentido debido a los movimientos de los músculos del cuerpo y a la disposición unidireccional de las válvulas de los ganglios linfáticos.

La otra función (y la que nos interesa aquí) del sistema linfático es capturar antígenos de los líquidos intersticiales de los tejidos y llevarlos a algunos de los órganos linfoides secundarios, donde quedarán retenidos para su interacción con las células del sistema inmune. El antígeno queda retenido en alguno de los ganglios interpuestos a lo largo del sistema de vasos, pero en el caso de que "pase de largo" entrará en circulación sanguínea y tendrá la oportunidad de ser captado por el bazo.(A los ganglios y al bazo se les califica como órganos linfoides secundarios sistémicos). Aparte de estos órganos sistémicos existen folículos linfoides difusos. Son agregados de células linfoides rodeados de capilares linfáticos que drenan al folículo. Existen miles de tales folículos dispersos por casi todos los órganos y tejidos, siendo especialmente abundantes a lo largo del tracto gastrointestinal, bronquios, tracto respiratorio superior y tracto genital. Pero como dijimos, el Ag puede entrar desde el líquido intersticial, pasando a los capilares linfáticos, y de ellos a los vasos linfáticos, por los que accede a algún ganglio linfático regional. Vamos, pues a describir este tipo de órgano linfoide secundario. Ganglios linfáticos Están intercalados en la red de vasos linfáticos, frecuentemente en la confluencia de ramificaciones de vasos. Hay grupos de ganglios especialmente abundantes y estratégicamente situados en: cuello (ganglios cervicales)

axilas (axilares) ingles (inguinales) mediastino cavidad abdominal Estos ganglios drenan regiones superficiales (piel) y profundas del cuerpo (excepto el interior de la cavidad craneal). Son la primera estructura linfoide organizada que se encuentra un antígeno que proceda de los espacios tisulares, y están especialmente diseñados para retener antígeno, (bien sea solo o formando parte de inmunocomplejos) cuando la linfa percola por el interior de ellos, y para que interaccione con los linfocitos y otras células que van a iniciar la respuesta inmune específica. Los ganglios humanos suelen medir entre 2 y 10 mm de diámetro, y tienen forma de judía, con una parte cóncava denominada hilio, a donde entra una arteria que se ramifica Æ arteriolas, Æ vénulas postcapilares Æ vena que sale por el hilio. La linfa llega al ganglio por los varios vasos linfáticos aferentes, y sale por un único linfático eferente a la altura del hilio. Histológicamente distinguimos varias zonas dentro del ganglio: A. corteza: es el área rica en células B (con macrófagos). En ella se pueden distinguir: 1. folículos primarios, ricos en linfocitos B maduros en reposo 2. folículos secundarios (que se forman a partir de los primarios tras la estimulación antigénica), con su manto y su centro germinal. B. Paracorteza: es el área rica en células T (donde además se localizan células dendríticas interdigitantes). C. Médula: con células B, abundantes macrófagos.

T,

células

plasmáticas

y

D. Seno subcapsular, a donde van a parar los antígenos timo-independientes. El antígeno llega solo o transportado por células de Langerhans o similares. En la paracorteza las células de Langerhans se convierten en células dendríticas interdigitantes, que procesan el Ag y lo presentan en sus MHC-II (abundantes en sus largos procesos membranosos) a los linfocitos, provocando la activación de las células TH, las cuales activan ya a algunas células B. Al cabo de 3 o 4 días, algunas células B se diferencian a células plasmáticas secretoras de IgM e IgG.

Pero la mayor parte de las células B en trance de activación (y algunas células T) emigran a la corteza, a los folículos primarios. Allí se producen interacciones entre células dendríticas foliculares, macrófagos, células TH y células B, que hacen pasar al folículo a folículo secundario, con su centro germinal. Allí continúa la activación de las células B, que proliferan (centroblastos) y se diferencian en dos subclones: A. células B de memoria B. células plasmáticas secretoras de anticuerpos. Dichas células emigran a la médula, y las grandes cantidades de Ac secretados salen a la circulación linfática. Tanto para la activación de las células B como para la generación de células de memoria, las células dendríticas foliculares (FDC) del centro germinal, con sus largos procesos de membrana que atrapan complejos Ag-Ac, poseen un papel esencial. En resumen: La linfa llega vía linfáticos aferentes Æ seno subcapsular Æ va percolando lentamente (sentido corteza Æ paracorteza Æ médula), permitiendo la interacción del Ag con macrófagos y otras APCs (incluyendo las dendríticas foliculares, que atrapan complejos inmunes). En el centro germinal se produce la activación y proliferación y diferenciación de linfocitos B hasta: 1. células plasmáticas, que pasan a médula, produciendo Ac que salen por ellinfático eferente, para alcanzar finalmente la circulación sanguínea, que los distribuye a todo el organismo; 2. células B de memoria, que quedan en el folículo, sobre todo en la zona del manto. La linfa sale por el único linfático eferente, enriquecida en Ac y en linfocitos (aumento de 50 veces en el número de estas células). Este incremento de linfocitos que salen no sólo ni principalmente se debe a la proliferación dentro del ganglio, sino que la mayoría son linfocitos que habían entrado previamente al ganglio desde la sangre a través de las vénulas postcapilares de endotelio alto (HEV). Durante la estimulación antigénica la mayor entrada de linfocitos a través de las HEV hace que los ganglios se hinchen (a veces de modo ostensible, en algunas infecciones).

3.3.2 Bazo Es un órgano linfoide secundario grande (150 g en humanos

adultos), de forma ovoide, situado en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Está especializado en capturar antígenos transportados por la sangre (p. ej., en las situaciones de infecciones sistémicas). La arteria esplénica se ramifica en numerosas arteriolas, que descargan a los sinusoides esplénicos; de allí arrancan las vénulas, que finalmente se unen en una sola vena esplénica que sale del órgano. Posee una cápsula de tejido conectivo, de la que salen hacia el interior numerosas trabéculas que delimitan compartimentos. En cada compartimento se distinguen dos tipos principales de tejidos: la pulpa blanca y la pulpa roja. 1. La pulpa blanca está constituida por tejido linfoideo, repartido en:un tejido más denso alrededor de las arteriolas, llamado vaina o manguito linfoide periarteriolar (PALS), que constituye la zona T del bazo; 2. por fuera del PALS, una zona más difusa llamada zona marginal, rica en linfocitos B y con macrófagos. Aquí se encuentran folículos linfoides primarios y secundarios, parecidos a los vistos en el ganglio. 3. La pulpa roja es una red de sinusoides venosos que continen macrófagos residentes especializados (macrófagos de los senos esplénicos), que se encargan de destruir eritrocitos y plaquetas viejos (proceso de hematocatéresis). El bazo carece de vasos linfáticos. El Ag llega a través de la arteria esplénica, que entra al órgano por el hilio. La arteria se divide en arteriolas, que a su vez conducen a capilares, que se abren y vacían su contenido en la zona marginal de la pulpa blanca. En ausencia de estímulo, la zona marginal posee folículos linfoides primarios, parecidos a los de los ganglios, ricos en células B vírgenes. En la zona T del bazo (PALS) las células dendríticas interdigitantes captan y procesan el antígeno, presentándolo en sus MHC de clase II a los TH en reposo, activándolos. A su vez, los TH activados activan a las células B. Las B activadas, junto con algunos linfoctitos T migran a la zona marginal, convirtiendo los folículos linfoides primarios en folículos secundarios, con sus centros germinales poblados de centroblastos en multiplicación. El bazo recibe cada día más linfocitos que la suma de todos los de los ganglios linfáticos.

La esplenectomía, sobre todo en la infancia, conlleva un mayor riesgo de bacteriemias, principalmente por Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae.

3.3.3 El sistema linfoide mucosal, no capsulado (MALT) Las mucosas de los tractos digestivo, respiratorio y urogenital suponen una enorme superficie (unos 400 m2) y constituyen posibles sitios de entrada de numerosos patógenos. Así pues no puede extrañar que la evolución haya desarrollado para ellos defensas inmunitarias especializadas. Desde el punto de vista histológico, estas consisten en tejidos que van desde acúmulos dispersos de linfocitos hasta estructuras organizadas, pero nunca rodeadas de cápsula. Por ello reciben el nombre de tejido linfoide asociado a mucosas (no capsulado), MALT. Este conjunto de tejidos reviste una grandísima importancia, habida cuenta de la gran superficie potencial que ha de defender frente a la entrada de patógenos. Otra idea de su relevancia la suministra el hecho de que las células plasmáticas de los tejidos MALT son más numerosas que la suma de las células plasmáticas de bazo, ganglios y médula ósea. El MALT consiste en agregados de tejido linfoide no capsulado que se localizan en la lámina propia y áreas submucosas de los tractos gastrointestinal, respiratorio y genitourinario. Los más sencillos son simples acúmulos difusos de linfocitos, células plasmáticas y fagocitos, localizados en los pulmones y en la pared intestinal. Folículos linfoides aislados. 1. Folículos linfoides que forman grupos más o menos densos:amígdalas: linguales (en la base de la lengua), palatinas (en la parte posterior de la boca) y faríngeas o adenoides. Constan de nódulos linfoides no capsulados, con linfocitos, macrófagos, granulocitos y mastocitos. Las células B se organizan en numerosos folículos, incluyendo secundarios con sus centros germinales. Poseen un papel defensivo frente a patógenos que entran por los epitelios nasales y orales. 2. Placas de Peyer del íleo: son 30 a 40 nódulos no capsulados en esta parte del intestino delgado. 3. Apéndice, en el inicio del intestino grueso. 4.

Los tejidos MALT mejor estudiados son los asociados con el tracto gastrointestinal. A grandes rasgos encontramos células linfoides en tres partes: 1. En el mismo epitelio existen linfocitos intraepiteliales (IEL), que en una buena proporción (incluso mayoritaria) son fenotípicamente TCR-1 (γδ) y CD8+. Se trata de un tipo de linfocitos con poca diversidad antigénica, pero adaptados frente a ciertos patógenos que frecuentemente pueden intentar la entrada por este epitelio. 2. En la lámina propia de todo el intestino se localizan miles de folículos linfoides, donde encontramos linfocitos TH con TCR-2 (αβ), células B, células plasmáticas secretoras de sIgA y macrófagos. 3. Más abajo, ya en la capa submucosa, encontramos las Placas de Peyer del intestino delgado, especie de nódulos, cada uno compuesto de unos 30 a 40 folículos linfoides. En algunos de estos casos (tracto respiratorio, digestivo y urogenital) el epitelio respectivo está especializado en transportar antígenos desde la luz del conducto al tejido linfoide subyacente. Como ejemplo, veamos cómo funciona un acúmulo de este tipo ligado al intestino delgado: 1. En el intestino delgado, el Ag entra a través de unas células epiteliales especializadas, denominadas células M, que tienen una membrana muy invaginada (ribete en cepillo) hacia la luz intestinal y una concavidad (llamada bolsillo basolateral) que alberga varios linfocitos B, T y macrófagos. Estas células M se sitúan en los llamados sitios inductivos: cortas regiones de la membrana mucosa emplazadas sobre folículos linfoides. 2. Los Ag endocitados por la célula M son transportados al bolsillo basolateral. Como la célula M es rica en MHC-II, probablemente el Ag llega procesado al bolsillo, para ser presentado a alguno de los linfocitos TH. 3. Posteriormente se estimulan los linfocitos B del folículo subyacente al sitio inductivo. Algunos de estos linfocitos B sensibilizados viajan por la linfa, atraviesan los ganglios linfáticos mesentéricos, pasan por el conducto torácico a la sangre; desde la circulación sanguínea regresan por capilares a la lámina propia del intestino, donde se distribuyen de modo difuso pero extenso, y se diferencian a células plasmáticas especializadas en secretar sIgA, que atraviesa la capa de células epiteliales y recubre la zona apical que da a la luz intestinal. Allí, la sIgA puede interaccionar con el Ag que dio origen a la respuesta. El resto de los linfocitos B activados se

diferencia in situ y las células plasmáticas liberan la IgA en la misma zona. Algunos patógenos (como algunas cepas de Salmonella, Vibrio cholerae y el virus de la polio) pueden "aprovecharse" de la misma célula M para atravesar el epitelio intestinal.

3.3.4 Células linfoides de la piel Aparte del papel de la piel como barrera inespecífica frente a los patógenos, desempeña un papel también como "órgano" del sistema inmune: 1. Células de Langerhans: se trata de un tipo de célula dendrítica, dispersa entre las células epiteliales de la epidermis. Captan antígenos por endocitosis o fagocitosis, y tras ello emigran como célula "a vela" por los linfáticos, hasta que al llegar a la paracorteza de los ganglios regionales se diferencian en células dendríticas interdigitantes, con altos niveles de moléculas de clase II del MHC. Allí funcionan como potentes presentadoras de antígeno procesado a los linfocitos TH vírgenes, a los que activan. 2. Linfocitos intraepidérmicos, parecidos, que al igual que los IEL del MALT son en buena proporción de tipo γδ, e igualmente especializados en determinados patógenos que pueden entrar por la piel. 3. Los queratinocitos (la célula epitelial de la epidermis) pueden, llegado el caso, secretar citoquinas, con un papel en la inducción de una reacción inflamatoria local. 4. Dispersos en la dermis se pueden encontrar macrófagos y células B y T activadas o de memoria.

3.3.5 La médula ósea como órgano linfoide secundario Aunque durante mucho tiempo pasó casi desapercibida en este papel, la médula ósea es importante para la producción de anticuerpos durante la respuesta secundaria humoral. Durante esta respuesta, los órganos secundarios "clásicos" responden rápidamente, pero durante poco tiempo. En cambio, la médula ósea "arranca" lentamente, pero da una respuesta más prolongada de producción de anticuerpos, llegando a ser responsable del 80% de estos durante la respuesta secundaria.

3.4 ÁREAS INMUNOLÓGICAMENTE PRIVILEGIADAS Se conocen como áreas inmunológicamente privilegiadas aquellas en las que normalmente no existe respuesta inmune: cerebro, testículos y cámara anterior del ojo. Están protegidas por fuertes barreras entre sangre y tejido (p. ej., la barrera hematoencefálica) y bajas permeabilidades o sistemas específicos de transporte. Su significado adaptativo estriba en evitar respuestas inflamatorias en lugares donde sería lesivo para la integridad del individuo.

3.5 RECIRCULACIÓN LINFOCITARIA Una vez que los linfocitos llegan a un órgano linfoide periférico, no se quedan allí permanentemente, sino que se mueven de un órgano linfoide a otro a través de la sangre y de la linfa. Existe, pues, un tráfico linfocitario entre tejidos, sistema linfático y sangre. Cada hora del 1 al 2% del "pool" de linfocitos recircula por el circuito. Ello supone que aumentan las probabilidades de que las células específicas para cada Ag puedan entrar en contacto con éste en los órganos periféricos. Cuando entra un antígeno, los linfocitos específicos "desaparecen" de circulación sanguínea antes de 24 horas: esto es lo que se llama "atrapamiento", porque estos linfocitos han sido reclutados a los órganos linfoides secundarios, donde hacen contacto con el Ag presentado y procesado por APC. Al cabo de unas 80 horas, tras su proliferación, los linfocitos abandonan el órgano linfoide. En el caso de los linfocitos B, al llegar al tejido donde se produjo la entrada del Ag se diferencian a células plasmáticas productoras de Ac. El endotelio vascular como "portero" de leucocitos: El endotelio vascular regula el paso a tejidos de moléculas y leucocitos. Para que éstos pasen desde la sangre al tejido inflamatorio o al órgano linfoide, deben de atravesar la línea de células endoteliales. Para ello deben adherirse a estas células y luego pasar entre ellas (un proceso llamado extravasación). Esto lo

consiguen por medio de contactos específicos entre el leucocito y la célula endotelial, a través de moléculas de adhesión celular (CAM). Existen tres familias de CAM: 1. de la superfamilia de las Ig: ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 2. de la familia de la integrina (subfamilia con cadenas tipo β 2): VLA-4, LFA-1 3. de la familia de las selectinas: L-selectina, E-selectina, Pselectina. Como veremos, en la inflamación se producen factores que activan a las células endoteliales normales, que producen selectinas E y P, y que inician la extravasación de granulocitos neutrófilos (véase tema 17). En cambio, los linfocitos en reposo tienen la capacidad de extravasarse desde circulación a ganglios y MALT a través de las vénulas de endotelio alto (HEV). Las células de este endotelio especial son cuboidales, pero de hecho no son más que producto de la diferenciación de células de endotelio normal de los órganos linfoides secundarios, ante citoquinas producidas en respuesta a antígenos. Esto lo podemos demostrar de dos maneras: Los animales de experimentación libres de gérmenes carecen de vénulas de endotelio alto. Si cortamos el vaso aferente de un ganglio linfático, se evita la entrada de antígenos. Al cabo de un tiempo, desaparece el HEV.

Las células del HEV poseen moléculas de adhesión celular de las citadas antes, pero además cuentan con diriginas vasculares (VA=vascular addressins). Son específicas de cada tejido linfoide y sirven para dirigir la extravasación de linfocitos de distintas subpoblaciones. A su vez, los linfocitos en reposo reconocen las HEV por medio de sus receptores de alojamiento (homing). Ello hace que cada subpoblación de linfocitos se dirija a órganos linfoides secundarios concretos (p. ej. selectina-L). Además, los linfocitos vírgenes expresan receptores de alojamiento diferentes de los linfocitos de memoria y efectores. Los linfocitos T activados van a parar preferentemente a los sitios inflamatorios de los tejidos (sitios terciarios): dejan de producir selectina-L (receptor de alojamiento), por lo que ya no tienden a pasar por el HEV. En cambio, aumentan sus niveles de receptores de unión a moléculas de superficie del endotelio inflamado. Por ejemplo,

aumentan en su membrana la cantidad de integrina VLA-4, que al unirse al VCAM-1 endotelial colabora en la entrada al tejido inflamado (con el foco de infección).

4. Antígenos ÍNDICE: 4.1 PROPIEDADES GENERALES * 4.2 FACTORES QUE CONDICIONAN LA INMUNOGENICIDAD * 4.2.1 Factores de la molécula inmunogénica * 4.2.1.1 Carácter de no-propia

4.2.1.2 Tamaño molecular

*

*

4.2.1.3 Heterogeneidad en la composición química

4.2.1.4 Degradabilidad

*

*

4.2.2 Factores del sistema biológico * 4.2.2.1 Genotipo del receptor

*

4.2.2.2 Dosis y ruta de administración del antígeno

4.2.2.3 Adyuvantes ( coadyuvantes)

*

*

4.3 EPITOPOS * 4.3.1 Propiedades de los epitopos de células B *

4.3.2 Propiedades de los epitopos reconocidos por células T * 4.4 HAPTENOS * 4.5 MITÓGENOS Y SUPERANTÍGENOS * 4.5.1 Mitógenos * 4.5.2 Superantígenos *

4.1

PROPIEDADES GENERALES

Se definen como antígenos aquellas sustancias capaces de inducir una repuesta inmune específica. Los antígenos exhiben (o pueden mostrar) una serie de propiedades inmunológicas: inmunogenicidad: capacidad de inducir una respuesta inmune específica, humoral y/o celular. En este sentido, antígeno sería sinónimo de inmunógeno. células B + Ag Æ células plasmáticas + células B de memoria células T + Ag Æ células T efectoras + células T de memoria. antigenicidad: capacidad de combinarse con anticuerpos y/o con receptores de células T (TCR). si una molécula es inmunogénica, también es antigénica; sin embargo, la inversa no siempre es verdad: p. ej., más adelante en este capítulo hablaremos de los haptenos, que por sí mismos no desencadenan respuesta inmune, pero que pueden ligarse a Ac preformados. alergenicidad: capacidad de inducir algún tipo de respuesta alérgica. Los alergenos son inmunógenos que tienden a activar ciertos tipos de respuestas humorales o celulares que dan síntomas de alergia. tolerogenicidad: capacidad de inducir una falta de respuesta específica en la rama celular o en la humoral.

4.2 FACTORES QUE CONDICIONAN LA INMUNOGENICIDAD El sistema inmune reconoce moléculas de los microorganismos, pero no todos los tipos de moléculas tienen la misma capacidad inmunogénica: las más inmunogénicas son las proteínas los hidratos de carbono poseen menor capacidad inmunogénica los lípidos y los ácidos nucleicos sólo son inmunogénicos cuando van unidos a proteínas o a carbohidratos. Por otro lado, hay que tener ya presente que en la rama humoral pueden actuar de inmunógenos todos los tipos moleculares que acabamos de citar, mientras que en la rama celular sólo lo son las proteínas. A continuación trataremos los factores que condicionan la inmunogenicidad de los antígenos, diferenciando los que dependen de la propia molécula antigénica y los que dependen del sistema biológico (el hospedador donde ocurre la respuesta inmune).

4.2.1 Factores de la molécula inmunogénica 4.2.1.1 Carácter de no-propia Ante todo, la molécula ha de ser reconocida como una molécula extraña, ajena al individuo. Tenemos pues, que un primer rasgo condicionador de la inmunogenicidad es el grado de falta de parecido entre el antígeno con respecto a moléculas propias. En general, moléculas que han divergido ampliamente en los distintos linajes evolutivos actúan como buenos inmunógenos en especies heterólogas. En cambio, moléculas evolutivamente conservadas (como el colágeno, el citocromo c) no son buenas inmunógenas. Por otro lado, ciertas moléculas propias pueden actuar como autoantígenos, debido a que proceden de órganos inmunológicamente privilegiados (secuestrados respecto del sistema inmune) en las fases tempranas del desarrollo (p. ej., del esperma, tejido de la córnea).

4.2.1.2 Tamaño molecular En general, se puede decir que, a mayor tamaño, mayor inmunogenicidad. Sustancias de unos 100.000 dalton (Da) suelen ser

buenos inmunógenos, mientras que las de menos de 5.000-10.000 Da son malos inmunógenos.

4.2.1.3

Heterogeneidad en la composición química

A mayor heterogeneidad inmunogenicidad.

de

composición

química,

mejor

Los copolímeros sintéticos repetitivos de un solo aminoácido, o los polisacáridos a base de un solo azúcar son malos inmunógenos. La poli [glu-lys] requiere tener 30-40 kDa de p.m. para ser inmunogénica; pero el poli {[glu-lys]-tyr} sólo requiere 10 kDa; si al anterior copolímero lo volvemos más complejo añadiendo unidades de phe, ya sólo se necesitan tamaños moleculares de 4 kDa para desencadenar respuesta inmune.

La complejidad química se expresa también en el hecho de que contribuye la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas.

4.2.1.4 Degradabilidad Sólo las moléculas degradables por el hospedador son buenas inmunógenas. Como veremos, ello se debe a que la inmunidad humoral y la celular dependen de la activación de los linfocitos TH, que a su vez depende de que éste reconozca antígeno degradado, procesado y presentado por moléculas MHC-II de las células presentadoras de antígeno (APC). Las moléculas no degradables no son buenas inmunógenas. Por ejemplo, los polímeros de D-aminoácidos no pueden ser degradados por los macrófagos (éstos no tienen enzimas hidrolíticas adecuadas), por lo que no pueden se procesados y presentados a los linfocitos TH. En general, las moléculas grandes e insolubles son inmunógenos, ya que son mejor fagocitadas y procesadas.

mejores

4.2.2 Factores del sistema biológico 4.2.2.1 Genotipo del receptor La influencia del genotipo del hospedador se puede comprobar en experimentos usando razas puras de animales de laboratorio. Supongamos que disponemos de una raza pura A que induce altos niveles de Ac en respuesta a un determinado Ag, y otra raza B que produce bajos niveles de Ac ante ese mismo Ag. Los individuos de la F1 procedentes del cruce de AxB exhiben niveles intermedios de Ac al ser enfrentados con el citado Ag.

Por análisis de retrocruzamiento se comprobó que los genes que controlan la mayor o menor respuesta se cartografiaban en una zona concreta de un cromosoma, dentro del llamado complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las proteínas sintetizadas por dicho complejo MHC funcionan para presentar el Ag procesado a las células T, y juegan un papel esencial en determinar el grado de respuesta a cada antígeno. Aparte de la dotación de alelos del complejo MHC que cada individuo posee, existen otros genes que también influyen en el grado de respuesta inmune, como los que codifican el BCR, el TCR y los de citoquinas. Esto será tratado en el capítulo dedicado a la regulación de la respuesta inmune.

4.2.2.2 Dosis y ruta de administración del antígeno Para cada inmunógeno experimental existe un protocolo de administración más adecuado, que supone usar una determinada ruta y cierta dosis, lo que condiciona una respuesta inmune óptima. Determinar estos parámetros reviste un especial interés a la hora de la administración de las vacunas. Dosis: dosis muy bajas de Ag pueden no estimular a los linfocitos (falta de respuesta); dosis demasiado altas pueden provocar un estado activo de tolerancia inmunológica, por el que los linfocitos entran en una situación de no respuesta. dosis adecuadas son capaces de estimulación. Un protocolo de dosis repetidas espaciadas a lo largo de varias semanas es mejor que una dosis única, porque provoca una mayor proliferación clonal de linfocitos t y B específicos. Rutas de administración: determinan a qué organo linfoide irá a parar el antígeno. por vía oral se estimula sobre todo el MALT del tracto digestivo (pero al mismo tiempo se puede inducir tolerancia sistémica: véase tema 15). por vía parenteral: intravenosa: el antígeno podrá quedar retenido en el bazo intradérmica subcutánea: el antígeno terminará en algún ganglio regional intramuscular intraperitoneal

4.2.2.3 Adyuvantes ( coadyuvantes) Los adyuvantes son sustancias que cuando se mezclan con un Ag y se inyectan con él, mejoran la inmunogenicidad de ese antígeno. Algunos adyuvantes y sus mecanismos de acción: Alúmina: sales insolubles de sulfato alumínico-potásico. Actúa mediante varios mecanismos: 1. precipita el antígeno. Al inyectarse va liberando el antígeno lentamente, con lo que se suministra un estímulo persistente (el Ag dura varios días en el lugar donde se inoculó). 2. El Ag precipitado tiene mayor tamaño, por lo que puede ser fagocitado más fácilmente, y por lo tanto es presentado más efectivamente. 3. Inducción de granulomas. Adyuvantes de Freund: el adyuvante incompleto de Freund consiste en una solución acuosa con el Ag, junto con un aceite mineral y un agente dispersante (p. ej., el manoleato). El adyuvante completo de Freund es como el incompleto, pero incorpora una suspensión de Mycobacterium muertos por calor. 1. Ambas versiones liberan lentamente el Ag, con lo que se logra un estímulo persistente. 2. El macrófago aumenta en su superficie el número de moléculas B7, lo que facilita su interacción con el receptor CD28 del linfocito TH. Como veremos en otro capítulo, ello suministra la llamada señal coestimulatoria, que potencia la interacción entre MHC (del macrófago), Ag procesado y TCR (de la célula T). 3. Además, el completo es más potente porque suministra muramil-dipéptidos de la pared celular de las micobacterias: ello permite una buena activación de macrófagos, que liberan la citoquina IL-1, que a su vez activa a los linfocitos TH. 4. El completo induce igualmente mejor los granulomas. El granuloma es una infiltración celular, con una masa densa y rica en macrófagos, con lo que se mejora el procesamiento y presentación del Ag. Se provoca una buena liberación de IL-1 de los macrófagos, que activan a los linfocitos TH. Polirribonucleótidos sintéticos: inespecífica de linfocitos.

estimulan

la

proliferación

Lipopolisacárido bacteriano (LPS): igual efecto que el anterior.

Recientemente se están ensayando los liposomas: el antígeno se encierra en liposomas o se une a la bicapa lipídica de este tipo de vesículas membranosas.

4.3

EPITOPOS

Los epitopos o determinantes antigénicos son cada uno de los sitios discretos de una macromolécula que son reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un TCR específico. Son las regiones inmunológicamente activas de un inmunógeno (las que se unen de hecho a un receptor de linfocitos o a un Ac libre). Por lo tanto, a partir de ahora habremos de acostumbrarnos a pensar en los antígenos como estructuras complejas que suelen constar de varios tipos de epitopos, cada uno de ellos capaz de unirse con un Ac o un TCR específico diferente. En este sentido, las macromoléculas son antígenos multivalentes, con muchos tipos de determinantes antigénicos distintos. Si hablamos de Ag proteicos, esta unión suele implicar varios niveles de la estructura del antígeno, desde la primaria a la terciaria (y, en su caso) a la cuaternaria. En el caso de los polisacáridos, las ramificaciones debidas a distintos enlaces glucosídicos suponen conformaciones peculiares que son reconocidas de modo específico.

Diferencias en el modo de reconocimiento por parte de células ByT Epitopos de células Epitopos de células B T unión con el Ag

binaria: Ig - Ag

ternaria: TCR - AgMHC (reconocimiento restringido por el haplotipo)

¿se une a Ag soluble?

Sí

No

¿requiere MHC?

No

Sí

naturaleza química del epitopo

Proteína

únicamente proteínas

Lípido Polisacárido

Propiedades del epitopo

parte externa, accesible

parte interna, desnaturalizada

hidrófilo

anfipático

movilidad (flexibilidad)

péptido lineal; unión a MHC

secuencial o conformacional

4.3.1 Propiedades de los epitopos de células B 1. El tamaño de un epitopo depende del tamaño del sitio de unión que posea la inmunoglobulina específica respectiva. Cada sitio de unión a un epitopo en una inmunoglobulina se denomina paratopo. 2. Los epitopos de células B de proteínas nativas suelen consistir en varios aminoácidos hidrófilos de la superficie de la proteína, y son los que están más accesibles al Ac libre o al Ac de membrana (del BCR). 3. Los epitopos reconocidos por células B pueden ser secuenciales (es decir, una serie de aminoácios contiguos) o no secuenciales (también llamados conformacionales). Los epitopos secuenciales suelen depender de regiones en forma de bucle, situadas entre cadenas α consecutivas. Los epitopos conformacionales dependen de la configuración nativa de la proteína.

4. Si desnaturalizamos una proteína, se perderán los epitopos conformacionales pero permanecerán los secuenciales. 5. Los epitopos de B tienden a situarse en regiones flexibles de la molécula, capaces de "moverse" molecularmente. Parece que ello tiende a facilitar el encaje con las regiones complementarias (paratopo) del Ac. 6. La mayor parte de la superficie de una proteína globular es potencialmente antigénica, y consiste en numerosos epitopos parcialmente superpuestos. Ahora bien, dada una determinada proteína, no todos los epitopos son igualmente inmunogénicos para distintos individuos de la misma especie. Para cada individuo y para cada Ag suele existir un epitopo llamado inmunodominante.

4.3.2 Propiedades de los epitopos reconocidos por células T Antes de desarrollar las características de estos epitopos describiremos sucintamente una serie de estudios clave que señalaron las diferencias esenciales entre el modo en que las células T reconocen los epitopos respecto a lo visto para las células B: Estudios de Benacerraf (1959):

si inmunizamos un animal por primera vez con una proteína nativa, se puede observar una respuesta celular primaria. Si inmunizamos al mismo animal una segunda vez con la misma proteína nativa, se La "sorpresa" (para las expectativas de la época) llega cuando esa segunda inoculación se hace con la proteína desnaturalizada: también ocurre una respuesta celular secundaria (algo que no ocurre con la respuesta humoral). La explicación a este fenómeno no llegó hasta los años 80: fue entonces cuando se descubrió que los linfocitos T no reconocen Ag soluble, sino Ag procesado, de modo que los péptidos resultantes son presentados en asociación con MHC. 1. El tamaño del epitopo de células T queda determinado por el tamaño del surco de unión al Ag de la molécula de MHC. Las moléculas de MHC-I unen péptidos de entre 8 y 11 aminoácidos. Las moléculas de MHC-II unen péptidos de entre 11 y 17 aminoácidos. 2. Los péptidos antigénicos reconocidos por células T forman un complejo trimolecular junto con el TCR del linfocito T y el MHC de la célula presentadora o diana. El antígeno reconocido por células T tiene dos zonas de unión: una para ligarse al TCR,

denominada epitopo, y otra para engarzar al MHC, denominada agretopo. 3. Los péptidos antigénicos implicados en el complejo trimolecular proceden del procesamiento intracelular del inmunógeno proteico original. 4. Los antígenos reconocidos por las células T presentan péptidos anfipáticos. Precisamente, quizá la función del procesamiento sea "desplegar" el Ag y exponer estas regiones internas anfipáticas, de modo que la porción hidrófoba suele actuar de agretopo, mientras que la porción hidrófila actúa de epitopo propiamente dicho. Por programas de ordenador es posible predecir en una proteína aquellas regiones anfipáticas de tamaño adecuado que teóricamente podrían actuar como péptidos antigénicos. Esto se refleja en el llamado "índice anfipático", y se está aplicando actualmente al diseño de vacunas sintéticas peptídicas (como en el caso de la malaria). También se puede recurrir por ordenador a medir el "índice de protrusión" de distintas partes de las proteínas: las zonas con menor protrusión son mejores candidatas a funcionar como péptidos de células T. 5. Debido a que los Ag reconocidos por células T lo son unidos a las moléculas de MHC del individuo, y debido a que a su vez existe una gran diversidad de alelos de MHC en las poblaciones de una especie, los epitopos inmunodominantes en cada individuo dependen en parte del juego de moléculas MHC de ese individuo (lo cual, depende de su dotación genética, obviamente). En una proteína sólo una minoría de zonas peptídicas tienen capacidad para unirse a las moléculas MHC de cada individuo, y de esas zonas, sólo algunos estimulan de hecho a la célula T.

4.4 HAPTENOS Se define como hapteno aquel grupo químico definido, de pequeño tamaño, que por sí mismo es incapaz de desencadenar una respuesta inmune (es decir, no es inmunógeno), pero que unido covalentemente a una molécula portadora se comporta como inmunógeno (llegando a constituir el único determinante inmunodominante del conjugado).

En los años 20 y 30 Karl Landsteiner realizó unos famosos experimentos que mostraron por primera vez la asombrosa especificidad del sistema inmune. como haptenos empleó una serie de derivados del benceno, como el dinotrofenol (DNP), en configuraciones distintas (orto, meta, para), así como distintos derivados a base de distintos sustituyentes en determinadas posiciones conocidas. Como molécula portadora empleó la seroalbúmina bovina (BSA). Obtenía así distintas versiones de conjugados BSA-DNP. Inyectaba conjugados BSA-DNP en un animal de laboratorio, esperaba a que se produjera la respuesta inmune, y tras una sangría, obtenía suero enriquecido en anticuerpos frente al hapteno (antisuero específico). Finalmente, ponía en contacto el antisuero con el hapteno original, y en paralelo, con otros haptenos consistentes en variantes del original (lugar del localización de algún radical, naturaleza química del radical). Las conclusiones que se pueden extraer de estos experimentos son: Casi más importante que la naturaleza química concreta del hapteno es la configuración global del mismo (obsérvese que el hapteno equivale a un epitopo inmunodominante) a la hora de determinar si dicho hapteno puede reaccionar (y en qué cuantía) con el antisuero (anticuerpos). En los experimentos se puede comprobar igualmente la existencia de algunas reacciones cruzadas, sobre todo cuando dos haptenos comparten una configuración parecida. Igualmente se puede advertir de estos experimentos la enorme diversidad posible de anticuerpos: cualquier estructura química definida, natural o artificial, puede dar origen, si va unida a un portador, a anticuerpos específicos.

4.5 MITÓGENOS Y SUPERANTÍGENOS 4.5.1 Mitógenos Los mitógenos son agentes capaces de inducir la proliferación de una gran cantidad de clones de linfocitos T y/o B, de modo inespecífico (por lo que también se denominan activadores policlonales).

Ejemplos de mitógenos: Lectinas: conllevan la aglutinación de células (entre ellas linfocitos), pero aquí nos interesan sobre todo por su capacidad de activación policlonal de células T, B, o de ambas. Como ejmplos de lectinas tenemos: concanavalina A (conA), que es mitógeno de células T fitohemaglutinina (PHA), que es mitógenos de células T mitógeno de fitolaca (PWM), que es mitógeno tanto de T como de B. Lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram negativas. Su actividad como mitógeno reside en la porción de lípido A.

4.5.2 Superantígenos Los superantígenos son unos potentes activadores policlonales de células T que expresan secuencias comunes en sus receptores: llegan a activar hasta la quinta parte del total de estos linfocitos). Esta activación es independiente de la especificidad hacia una combinación particular de Ag procesado-MHC. Unen la porción Vβ del TCR y lo entrecruzan con la parte externa del MHC, fuera del surco que normalmente sirve para exponer y presentar el antígeno. De esta forma, entrecruzan de modo inespecífico las células TH con las APC, de modo que los linfocitos T se activan sin haber reconocido Ag procesado y presentado en el surco de MHC-II de las APC. El resultado es que un gran número de clones de células T segregan grandes niveles de citoquinas, lo que puede llevar a shock y a muerte. Ejemplos de superantígenos son ciertas toxinas de Staphylococcus aureus, como la toxina del síndrome del choque tóxico (TSS-1), o la enterotoxina.

5. Inmunoglobulinas y otras moléculas de células B ÍNDICE: 5.1 INTRODUCCIÓN A LAS MOLÉCULAS QUE RECONOCEN ANTÍGENOS * 5.2 APROXIMACIÓN HISTÓRICA AL ESTUDIO DE LAS INMUNOGLOBULINAS * 5.3 ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS * 5.3.1 Estructura general de las cadenas de las inmunoglobulinas * 5.3.1.1 Cadenas L

*

5.3.1.2 Cadenas H

*

5.3.2 Estructura en detalle de las Inmunoglobulinas * 5.3.2.1 Estructura en detalle de un dominio típico de inmunoglobulina

5.3.2.2 Estructura y función de los dominios variables

*

*

5.3.2.3 Estructura y función de los dominios constantes

*

5.4 INMUNOGLOBULINAS DE MEMBRANA Y COMPLEJO RECEPTOR-CORRECEPTOR DE CÉLULAS B *

5.5 VARIANTES ANTIGÉNICAS DE LAS INMUNOGLOBULINAS * 5.5.1 Isotipos y determinantes isotípicos * 5.5.2 Alotipos y determinantes alotípicos * 5.5.3 Idiotipos y determinantes idiotípicos * 5.6 ESTUDIO DE LOS ISOTIPOS HUMANOS DE INMUNOGLOBULINAS * 5.6.1 Inmunoglobulina G (IgG) * 5.6.2 Inmunoglobulina A (IgA) * 5.6.3 Inmunoglobulina M (IgM) * 5.6.4 Inmunoglobulina D (IgD) * 5.6.5 Inmunoglobulina E (IgE) * 5.7 RECEPTORES CELULARES PARA Fc DE LAS Ig * 5.7.1 Receptores para Fcγ * 5.7.1.1 Fcγ IR (=CD64)

*

5.7.1.2 Fcγ RII (=CD32)

*

5.7.1.3 Fcγ RIII (=CD16)

*

*

5.7.1.4 Fcγ Rn

5.7.2 Receptores para Fcε * 5.7.2.1 Fcε RI

*

5.7.2.2 Fcε RII

*

5.8 LA SUPERFAMILIA GÉNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS *

5.1. INTRODUCCIÓN A LAS MOLÉCULAS QUE RECONOCEN ANTÍGENOS El punto clave del sistema inmune adaptativo es su capacidad de reconocimiento específico de cualquier tipo de molécula o partícula extraña. Para ello, el sistema inmune cuenta con las inmunoglobulinas (Ig) y con los receptores de los linfocitos T (TCR), los cuales exhiben tres importantes propiedades: diversidad heterogeneidad procedencia a partir de reordenaciones de genes. Las inmunoglobulinas funcionan como 1. la parte específica del complejo de las células B, a nivel de membrana, que reconoce al antígeno; 2. moléculas circulantes, es decir anticuerpos secretados por las células plasmáticas procedentes de activación, proliferación y diferenciación de células B. Estos anticuerpos se localizan en el suero, en los líquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo ciertos epitelios internos. Estas Ig circulantes son los efectores de la rama humoral del sistema inmune específico (de hecho inician la fase efectora, pero como veremos, la eliminación

definitiva del anticuerpos).

Ag

no

suelen

hacerla

directamente

los

Los receptores de células T aparecen sólo como moléculas de membrana de los linfocitos T. Reconocen al antígeno restringido por el MHC de la célula diana o de la célula presentadora. Suministran la base de la inmunidad celular específica (en el caso de los linfocitos TC) y del mecanismo de los linfocitos T colaboradores (TH).

5.2 APROXIMACIÓN HISTÓRICA AL ESTUDIO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Experimentos de Kabat & Tiselius (1939): demostraron que la llamada fracción γ -globulínica de las proteínas del suero era la responsable de la actividad anticuerpo (por eso, a los anticuerpos se les ha denominado durante mucho tiempo como γ -globulinas). Porter y Edelman (por separado, en los años 50 y 60) realizaron diversos experimentos usando ultracentrifugación para separar las γ -globulinas, obteniendo una fracción que poseía un coeficiente de sedimentación de 7S, a la que llamaron IgG, con un peso molecular de unos 150.000 Da.Porter sometió la IgG a digestión breve con la enzima papaína, tras de lo cual realizó con los fragmentos resultantes una separación cromatográfica en carboximetil-celulosa. Dedujo que cada molécula de IgG había sido escindida por la papaína en dos fragmentos idénticos, capaces de unir antígeno (fragmentos Fab) y un fragmento cristalizable (Fc). Nisonoff realizó experimentos parecidos a los de Porter, pero en lugar de digerir la IgG con papaína, empleó pepsina. Del ulterior análisis cromatográfico dedujo que la pepsina había roto cada molécula de IgG en un fragmento capaz de unir Ag pero con doble valencia [fragmento F(ab’)2], y una serie de pequeños fragmentos pequeños no cristalizables, procedentes del Fc original.

Edelman sometió la IgG a un tratamiento reductor con mercaptoetanol (que provoca la rotura de los puentes disulfuro), con posterior electroforesis desnaturalizante de los péptidos resultantes. Sus resultados indicaban que la IgG estaba compuesta de dos tipos de cadenas polipeptídicas, una pesada (cadena H) y otra ligera (cadena L). Ensamblando todos estos resultados se obtenía el primer modelo de la estructura de una inmunoglobulina: cada molécula de IgG está compuesta de Dos cadenas H, cada una de unos 50.000 Da. Dos cadenas L, cada una de unos 25.000 Da. Cada cadena L está unida a una H por un puente disulfuro. A su vez, las dos cadenas H está unidas entre sí por puentes disulfuro. Estudios de secuenciación de las inmunoglobulinas. El abordaje de la secuenciación de las Ig se encontró con un problema de base: aunque la estructura general de las todas las inmunoglobulinas es parecida, existe una enorme diversidad de secuencias y especificidades frente a distintos antígenos. ¿Cómo obtener y purificar una Ig concreta homogénea que permitiera la secuenciación de sus aminoácidos? En principio hubo que recurrir a muestras de pacientes aquejados de mieloma múltiple: en esta enfermedad un tipo concreto de células plasmáticas (con una especificidad concreta) se ha vuelto canceroso, y secretan grandes cantidades de la correspondiente Ig, que llega a representar el 95% del total de inmunoglobulinas del individuo. Otra ventaja es que los pacientes presentan en la orina las llamadas proteínas de Bence-Jones, que son cadenas L en exceso procedentes del mieloma. De esta forma fueron posibles los primeros análisis de secuencia de las inmunoglobulinas. Recientemente la secuenciación se ha facilitado notablemente por la disponibilidad de los anticuerpos monoclonales.

5.3 ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS 5.3.1 Estructura general de las cadenas de las inmunoglobulinas

5.3.1.1 Cadenas L Cuando se comparan distintas proteínas de Bence-Jones se observa que los 100 a 110 primeros aminoácidos difieren entre unas y otras, mientras que los 100-110 últimos son prácticamente idénticos. Ello permite distinguir dos regiones claramente diferenciables en las cadenas ligeras: región carboxi-terminal, constante (región C) región amino-terminal, variable (región V) Además, existen dos posibles versiones de cadenas L, según dos variantes en la región C: cadenas κ (kappa) cadenas λ (lambda) En una misma Ig existen dos cadenas κ o dos cadenas λ , pero nunca una de cada tipo. Porcentaje de cadenas κ y λ en humanos y en ratón cadenas κ cadenas λ Humanos 60

40

Ratones

5

95

Comparando diversas cadenas λ se ha visto que existen varios subtipos según la especie: en la especie humana, existen cuatro subtipos, denominados λ 1 a λ 4. En ratones, existen tres subtipos (diferentes a los humanos): λ 1 a λ 3.

5.3.1.2 Cadenas H La cadena pesada posee unos 440 aminoácidos (menos dos tipos, que poseen unos 550). Cada cadena pesada posee una región aminoterminal de 100 a 110 aminoácidos, cuya composición es variable (VH). El resto de la cadena H muestra en humanos cinco patrones básicos de secuencia, distinguibles entre sí, que configuran cinco tipos de cadenas pesadas según la porción constante (CH). La longitud de esta porción constante suele ser de 330 aminoácidos, salvo en dos tipos, que poseen 440 aminoácidos.

Cada uno de los tipos de cadena pesada recibe una denominación a base de una letra griega, y determinan lo que se denomina clases o isotipos de inmunoglobulinas: cadena H longitud de la porción C clase o isotipo de Ig según la (en aminoácidos) porción C γ

330

IgG

μ

440

IgM

α

330

IgA

δ

330

IgD

ε

440

IgE

En el caso de las IgG e IgA, se pueden distinguir, además, pequeñas diferencias de secuencias dentro de cada clase, que dan origen a subclases, que en humanos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA, IgA2. En otras especies de mamíferos también se han detectado subclases de IgG e IgA, pero las subclases de las diferentes especies son distintas entre sí. Esto nos sugiere que las subclases han ido apareciendo tardíamente durante la evolución dentro de cada línea filogenética, por lo que no son comparables entre distintas especies. Cada tipo (o en su caso, cada subclase) de cadena pesada H puede combinarse por separado con cada una de las dos versiones (κ o λ ) de cadenas L.

5.3.2 Estructura Inmunoglobulinas

en

detalle

de

las

Al ser proteínas formadas por dos tipos de cadenas polipeptídicas, en las inmunoglobulinas podemos distinguir estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria: 1. La estructura primaria (la secuencia lineal de aminoácidos) explica que existan regiones V y regiones C tanto en cadenas H como en L. 2. Estructura secundaria: existen abundantes láminas β antiparalelas, cada una de ellas formadas por 3 o 4 cadenas β

antiparalelas, mantenidas por puentes de hidrógeno entre grupos -NH- y -CO-. 3. La estructura terciaria es a base de dominios globulares compactos. Cada dominio globular consta de dos capas (láminas) β conectadas entre sí por un puente disulfuro característico. Dos dominios globulares consecutivos se conectan entre sí por secuencias cortas de aminoácidos sin estructura especial. 4. Estructura cuaternaria: los dominios globulares de cadenas L y H adyacentes interectúan dando la conformación global característica de las inmunoglobulinas. Cada cadena L se conecta con la H adyacente por un puente disulfuro, a nivel de la parte C-terminal de la cadena L. Las dos cadenas H se conectan entre sí por al menos un puente disulfuro (como veremos, hay clases y subclases con abundantes puentes disulfuro enlazando las dos cadenas pesadas). Además, muchas Ig poseen cadenas de polisacáridos unidos covalentemente a algun(os) dominio(s), lo cual evidentemente colabora a la estructra global tridimensional de la molécula. La estructura cuaternaria de la Ig es la que permite sus dos funciones características: unión al Ag y actividad biológica efectora. A continuación vamos a describir en detalle la estructura de los dominios de las inmunoglobulinas, comenzando con un estudio general, y continuando con la caracterización de los diferentes dominios o parejas de dominios.

5.3.2.1 Estructura inmunoglobulina

en

detalle

de

un

dominio

típico

de

Cada tipo de cadena (H y L) de Ig se puede considerar formado a partir de dominios globulares elongados. Cada dominio consta de unos 110 aminoácidos, y sus dimensiones son de 2,4 x 4,2 nm. Cada dominio está mantenido por un puente disulfuro que enlaza dos cisteínas invariantes, que en la secuencia lineal están separadas entre sí por unos 60 aminoácidos. Las cadenas L poseen un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Las cadenas H poseen un dominio variable (VH) y 3 o 4 (según clase) dominios constantes (CH1, CH2, CH3, y en su caso, CH4). La estructura en detalle de los dominios pudo ser puesta de manifiesto empleando la cristalografía y difracción de rayos X:

cada dominio presenta una estructura compacta característica, denominada pliegue de inmunoglobulina. El hecho de que existan determinados aminoácidos conservados que guardan su posición relativa implica que la estructura terciaria esté conservada en las distintas inmuglobulinas. Esta estructura terciaria peculiar consiste en un "sandwich" de dos láminas β paralelas respecto del eje longitudinal del dominio. Una de las láminas consta de 3 cadenas β antiparalelas, y la otra de 4 cadenas β antiparalelas. Entre dos cadenas β consecutivas existe un bucle, de longitud variable según los casos. Las dos capas β están estabilizadas entre sí por un puente disulfuro conservado (que une dos cys separadas en la secuencia por otros 60 aminoácidos aproximadamente), y por interacciones hidrofóbicas entre grupos químicos de las cadenas laterales de aminoácidos. Alguien ha comparado acertadamente esta estructura con un bollo de pan, partido longitudinalmente en dos rebanadas, pegadas entre sí por mantequilla (enlaces hidrófobos) y atravesadas por un palillo de dientes (enlace disulfuro).

El pliegue típico de la Ig condiciona a su vez interacciones no covalentes entre dominios emparejados de dos cadenas diferentes: entre dominios idénticos: CH2-CH2 y CH3-CH3. entre dominios no idénticos: VH-VL y CH1-CL.

5.3.2.2 Estructura y función de los dominios variables La variabilidad de secuencia de los dominios variables no está repartida uniformemente, sino en varias regiones denominadas regiones hipervariables: tres regiones en el dominio VL: L1, L2 y L3 tres regiones en el dominio VH: H1, H2 y H3. En cada caso, la suma de estas tres regiones no representa más que el 15-20% del total del dominio. El restante 80-85% es mucho menos variable. Las regiones hipervariables se denominan CDR (iniciales en inglés de regiones determinantes de complementariedad, ya que conjuntamente forman el sitio de unión al epitopo). Cada CDR consta de unos 10 aminoácidos. La CDR3 suele ser la más variable de las tres. Las regiones más constantes se denominan regiones FR, es decir, regiones de armazón o de entramado. Ellas son las que en este caso de los dominios V constituyen la estructura característica de dos láminas β unidas entre sí.

Las regiones CDR de las cadenas L y H están situadas espacialmente de modo que se proyectan hacia afuera, y están cercanas una a otra en la configuración global. Esto crea la estructura tridimensional adecuada para la unión con el antígeno. Obsérvese que la cadena L presenta dos cadenas β adicionales (c’ y c’’), pero su organización global es como acabamos de describir. Así pues, la región de entramado (FR) suministra un "andamio" que soporta las 6 regiones CDR (tres de cada cadena). Este andamio rígido es el que constituye el dominio globular carácterístico, mientras que el conjunto de las seis CDR de cada brazo Fab suministra una enorme variedad de tipos de Ac, cada uno de ellos con una especificidad antigénica diferente. Dicha especificidad depende de la longitud de las CDR y de la composición de aminoácidos de estas CDRs. La cristalografía de rayos X de alta resolución se ha aplicado hasta ahora a unos 20 complejos Fab-Ag, lo que ha permitido extraer varias generalizaciones sobre el sitio de unión al Ag: En el caso de Ag globulares, el Ac contacta con el Ag a través de una superficie amplia (de unos 700-900 Å2), relativamente plana y suavemente ondulada. Obsérvese en las imágenes cómo cada protrusión del Ac se corresponde con una depresión del Ag, y cada depresión del Ac lo hace con una protrusión del Ag. En estos casos, 15-20 aminoácidos del Ac contactan con un número similar de aminoácidos de la proteína globular antigénica. Entre 6 y 14% del epitopo se encuentra "enterrado" en alguna hendidura del Ac.

En el caso de antígenos pequeños (p. ej., fosforilcolina, angiotensinaII), el sitio de unión en el anticuerpo es más pequeño (200-700 Å2) y presenta alguna hendidura profunda, donde queda enterrada buena parte del epitopo (70-90%). De las 6 regiones CDR, al menos cuatro contactan con el epitopo, y frecuentemente lo hacen las seis. En general, parece que la contribución de las CDR de VH es más importante que las de VL. En algunos casos, la unión Ac-epitopo se produce con cambios conformacionales en uno o en ambos, lo que permite un mejor ajuste entre los dos.

5.3.2.3 Estructura y función de los dominios constantes

Los dominios constantes de la porción Fc de las Ig están relacionados con diversas funciones biológicas de los anticuerpos. Los dominios constantes se asocian por parejas: CL-CH1 CH2-CH2 CH3-CH3 Dominios CL-CH1 La interacción no covalente entre ambos dominios es más débil que la que existe entre VL y VH. Sin embargo, CL y CH1 se unen covalentemente entre sí por un enlace disulfuro situado a nivel del extremo C-terminal de la cadena L. La interacción entre estos dos dominios confiere una serie de propiedades a las moléculas de anticuerpos: La interacción CL-CH1 sirve a su vez para mantener unidos mejor a VL y VH entre sí. La existencia de esta pareja de dominios hace que el brazo Fab (cuya parte esencial para unirse al Ag estriba en los dominios V) sea más largo, lo cual facilita la rotación del brazo, que a su vez mejora la capacidad de interacción del brazo Fab con el Ag. Pueden contribuir a aumentar aún más la diversidad de Ac, al permitir más posibles asociaciones entre VH y VL. Región bisagra Las cadenas pesadas de tipo γ , α y δ presentan entre el primer y segundo dominios constantes una secuencia de aminoácidos sin homología con otros dominios, denominada región bisagra o región Fx. Se trata de una zona rica en prolina, que confiere flexibilidad, y que hace que los dos brazos Fab puedan rotar independientemente uno respecto del otro, formando ángulos variados respecto a Fc. Véase el experimento que demuestra esto: se tiene una molécula lineal de unos 25 Å , con dos moléculas de dinitrofenol (DNP), una en cada extremo. Si mezclamos esta molécula con anticuerpos anti-DNP, al microscopio electrónico se pueden ver trímeros, tetrámeros y pentámeros de anticuerpos unidos entre sí por puentes de esa molécula. Obviamente, el ángulo de los brazos Fab de cada molécula de Ac es diferente en cada tipo de multímeros, lo que demuestra que el brazo Fab puede girar debido precisamente a la región bisagra. Se recomienda volver a consultar las figuras de la estructura tridimensional de los Ac para comprobar la naturaleza extendida de esta región bisagra.

De esta forma los brazos Fab se pueden mover y girar para alinear mejor las regiones CDR con respecto a los epitopos a los que se van a

unir. Igualmente esto permite que la porción Fc se pueda mover para mejorar sus diversas funciones efectoras. En la región bisagra existen abundantes prolinas, lo cual determina su estructura desplegada, flexible y sensible al ataque por proteasas (recuérdese la actuación de la papaína y la pepsina). Igualmente existen algunas cisteínas, lo cual permite la formación de puentes disulfuro entre las dos cadenas pesadas a este nivel. Las cadenas pesadas μ y ε carecen de región bisagra, pero en su lugar poseen un dominio adicional (CH2) 110 aminoácidos, que cumple un papel semejante. Dominios CH2 de IgG, IgA e IgD (y los equivalentes CH3 de IgM e IgE) La pareja de dominios CH2 (o su equivalente) suele ser rica en carbohidratos, que suelen estar dispuestos de modo que separan entre sí a cada miembro de la pareja. Es decir, al contrario que las otras parejas de dominios globulares de las Ig, estos dominios no están superpuestos entre sí, sino uno adyacente al otro. Esto supone que estos dominios están más accesibles al entorno acuoso, lo cual explica en parte sus papeles biológicos: en el caso de la IgG y de la IgM activan el complemento por la ruta clásica. Dominios carboxiterminales (CH3 en IgG, IgA e IgD; CH4 en IgM e IgE) Aquí hay que distinguir entre las dos posibles versiones en que podemos encontrar cada inmunoglobulina: libre (es decir, anticuerpos circulantes) o Ig de membrana. Los Ac circulantes, tras el típico dominio globular poseen una pequeña porción hidrófila C-terminal. El dominio CH3 (o su equivalente), junto con el dominio anterior, es reconocido por receptores para Fc presentes en diversas células fagocíticas. De este modo, un fagocito puede reconocer y fagocitar fácilmente un microorganismo recubierto por Ac (fenómeno de opsonización). Las Ig de membrana, tras el dominio globular, presentan otro tipo de secuencia más compleja que en la versión circulante, y en la que podemos distinguir tres zonas: un espaciador extracelular (yuxtamembrana), de carácter hidrófilo; una secuencia transmembranal, hidrófoba, de unos 26 aminoácidos, probablemente en configuración de α -hélice. finalmente, una cola intracitoplásmica, hidrófila. Los papeles biológicos condicionados por este par de dominios son:

el ya comentado de servir para el reconocimiento por parte de receptores de fagocitos: algunas subclases de IgG se unen a receptores para Fc de la superficie de células de la placenta, lo cual les permite atravesar la barrera materno-fetal y conferir inmunidad pasiva al feto. La IgE se une por este dominio a receptores adecuados de la membrana de basófilos y mastocitos (véase el tema de la alergia). Como veremos, la IgA (y la IgM) interactúan con receptores de células epiteliales durante su proceso de secreción (receptor de poli-Ig). En la IgA e IgM existen ciertas cisteínas en este dominio Cterminal, lo cual condiciona la formación de puentes disulfuro entre dos o más monómeros de estas inmunoglobulinas, creándose formas multiméricas que cumplen papeles especiales.

5.4 INMUNOGLOBULINAS DE MEMBRANA Y COMPLEJO RECEPTOR DE CÉLULAS B Como ya dijimos, las Ig de membrana (mIg) se diferencian de sus correspondientes versiones circulantes en los respectivos extremos Cterminales. La versión de membrana posee una larga cola en la que existe un segmento extracelular, seguido de una zona transmembranal, de unos 26 aminoácidos, terminando en una secuencia intracitoplásmica de longitud variable, según la clase de inmunoglobulina. En las distintas fases de maduración de los linfocitos B existen distintos isotipos o combinaciones de isotipos de Ig (todos con la misma especificidad antigénica para cada clon de linfocitos): las células B inmaduras sólo poseen mIgM; las células B maduras vírgenes (en reposo) poseen mIgD y menos cantidad de mIgM; las células B de memoria pueden tener diversas combinaciones de diversas clases: mIgM, mIgG, mIgA y mIgE. Ahora bien, la Ig de membrana va acompañada de otras moléculas, formando el denominado complejo receptor de células C (BCR). Dicho complejo está formado por:

una molécula de mIg, unida no-covalentemente a dos heterodímeros Igα -Igβ , en los que las dos cadenas (α y β ) están unidas entre sí por puentes disulfuro. Parece que los dos dominios más C-terminales de la mIg establecen contactos con sendas cadenas α de cada uno de los heterodímeros Igα -Igβ . Las cadenas α y β presentan su correspondiente segmento tranmembranal, así como largas colas citoplásmicas (61 aminoácidos en el caso de la cadena α y 48 la cadena β ). Cuando un antígeno se entrecruza con las mIg de dos complejos (es decir, uno de los brazos Fab de una mIg se une al Ag y otro brazo Fab de otra mIg se enlaza con el mismo Ag), se inicia una serie secuencial de eventos moleculares en el citoplasma que finalmente conducen a la activación de la célula B: al unirse el Ag a la mIg, parece que ocurren cambios a nivel de la cola citoplásmica de dicha Ig, así como cambios en las colas citoplásmicas de las moléculas invariantes α y β del BCR, poniéndose en marcha una cascada de fosforilaciones y defosforilaciones que finalmente activan una serie de genes, cuya actividad redundará en la activación de las células B. Recientemente se ha identificado un nuevo complejo de membrana de células B, que puede intensificar la señal de activación transmitida por el BCR. Este grupo de moléculas, que recibe el nombre de complejo correceptor, consta de 3 proteínas: CD19: pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y posee una larga cola citoplásmica y tres dominios extracelulares de tipo Ig; CD21 (también conocida como CR2): se puede unir a C3b (un componente del complemento) y al CD23 de la superficie de las células dendríticas foliculares de los ganglios; CD81 (=TAPA-1): consta de cuatro segmentos transmembranales. El linfocito B se une por medio del CD21 del complejo correceptor al antígeno acomplejado con C3b o C3d, y por medio de la Ig del BCR al epitopo del antígeno. De este modo el BCR se entrecruza con el correceptor (a través de antígeno unido al componente del complemento). Entonces, este evento provoca que el CD19 del correceptor interaccione con los Igα/Igβ del BCR, de modo que se fosforilan varias tirosinas de la cola citoplásmica del CD19. A su vez ello provoca la unión de la quinasa Lyn, que se activa, interviniendo en una cascada de fosforilaciones y desfosforilaciones celulares que finalmente activará una serie de genes del linfocito B.

5.5 VARIANTES ANTIGÉNICAS DE LAS INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas son glucoproteínas; por lo tanto, se pueden comportar como antígenos al ser inyectados a receptores adecuados. El estudio de las Ig en su faceta de antígenos revela la existencia de tres tipos de determinantes antigénicos, cada uno de ellos localizado en partes características de la molécula: determinantes isotípicos determinantes alotípicos determinantes idiotípicos.

5.5.1 Isotipos y determinantes isotípicos Se denominan isotipos al conjunto de variantes de inmunoglobulinas comunes a todos los miembros sanos de una determinada especie. Los isotipos dependen de las regiones constantes tanto de cadenas pesadas como de cadenas ligeras. Los isotipos también reciben el nombre de clases, y en determinados casos se pueden diferenciar subclases. Como ya vimos, en humanos se distinguen cinco isotipos según características de las porciones constantes de cadenas pesadas (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE). Cada isotipo puede encontrarse en dos versiones distintas, según que las cadenas ligeras sean de tipo κ o λ . Cada isotipo (y en su caso, cada subclase) viene determinado por un gen correspondiente de región constante. Todos los individuos de una especie cuentan con el mismo juego básico de genes de regiones constantes. ¿Cómo se ponen de manifiesto experimentalmente los isotipos? Se inyecta un Ac de una especie A en una especie B; esta última reconoce como "extraño" (antígeno) al Ac-A, y produce anticuerpos anti-isotípicos frente a los anticuerpos de la especie A. Los anticuerpos anti-isotípicos se emplean, obviamente, para determinar la clase y subclase de un Ac problema de una especie, así como para caracterizar las Ig de membrana de las células B.

5.5.2 Alotipos y determinantes alotípicos Los alotipos son el conjunto de variantes alélicas presentes en las poblaciones de una especie: hay individuos que para cada clase o subclase presentan una variante alélica distinta de otros individuos. Se deben a pequeñas diferencias (de uno a cuatro aminoácidos) que afectan a las regiones CH y CL.

Obviamente, los individuos pueden ser homozigóticos o heterozigóticos para cada variante, siendo estos alelos de expresión codominante. Ejemplo: si tenemos dos razas de ratón una homozigótica b4b4, y otra homozigótica b5b5, y las cruzamos, la F1 será heterozigota b4b5, y en ella se expresarán ambas versiones alotípicas de Ig de la misma clase. En humanos se han identificado 25 alotipos de cadenas γ , que se denominan con la letra G seguida del número de la subclase, de la letra m, y finalmente, entre paréntesis, una cifra alusiva al alotipo. Ejemplos: G1m(1), G2m(23), G3m(11), G4m(4 a). Existen dos variantes de IgA2 llamadas A2m(1) y A2m(2). Se han identificado tres variantes de cadenas κ : κ m(1), κ m(2) y κ m(3). ¿Cómo detectar los alotipos? Se inyecta anticuerpo de una clase o subclase de un individuo (A) a otro individuo (B) con distinto alotipo de la misma especie: éste produce anticuerpos antialotípicos frente a las variantes alotípicas del individuo A. Algunas veces, la madre gestante puede producir Ac anti-alotípicos en respuesta a determinantes alotípicos paternos heredados por el feto.

5.5.3 Idiotipos y determinantes idiotípicos Se define como idiotipo el conjunto de variantes antigénicas características de cada anticuerpo de un mismo individuo, debidas a las secuencias de aminoácidos de las porciones VH y VL. A su vez, cada uno de los determinantes características de un anticuerpo concreto se denomina idiotopo. El conjunto de los idiotopos es lo que define a cada idiotipo. El idiotopo puede coincidir o no con un paratopo (con un sitio de unión a un epitopo). Obviamente, los Ac producidos por un determinado clon de linfocitos B y las células plasmáticas derivadas de ellos llevan el mismo idiotipo. Normalmente, los distintos clones de linfocitos B producen idiotipos distintos entre sí, no compartidos entre ellos, a los que se llama idiotipos privados. Pero también puede ocurrir que determinados determinantes idiotípicos sean comunes a dos o más clones, por lo que en este caso se habla de idiotipos públicos o de reacción cruzada (a veces llamados idiotipos recurrentes). Ello se debe a que distintos clones de linfocitos B de un mismo individuo (o de la misma raza pura) pueden usar la misma región génica variable de la línea germinal para construir sus porciones variables. ¿Cómo detectar los idiotipos? En el caso de animales de laboratorio, se usan razas singénicas (para minimizar diferencias iso- y alotípicas). Se inyectan anticuerpos monoclonales o

anticuerpos de mieloma en un animal singénico; pasado un tiempo, de éste se recuperan anticuerpos anti-idiotípicos. Durante una respuesta inmune normal se producen anticuerpos anti-autoidiotípicos, que como veremos en el capítulo sobre regulación (tema 15), tienen un papel importante en el control de la respuesta inmune.

5.6 ESTUDIO DE LOS ISOTIPOS HUMANOS DE INMUNOGLOBULINAS Vamos ahora a abordar el estudio de la estructura y papeles biológicos de los distitintos isotipos (clases) de inmunoglobulinas de la especie humana.

5.6.1 Inmunoglobulina G (IgG) Es el isotipo más abundante en suero (8-16 mg/ml), constituyendo el 80% de las Ig totales. Existen cuatro subclases en humanos,que se diferencian estructuralmente entre sí por el tamaño de la región bisagra y el número de puentes disulfuro entre las cadenas pesadas. Algunos datos sobre las subclases de IgG Subclase de IgG

nº de concentración opsoninas Activación puentes S-S en suero (en del mg/ml) complemento

IgG1

2

9

+++

++

IgG2

4

3

+/-

+

IgG3

11

1

+++

+++

IgG4

4

0.5

-

-

Estas distintas subclases se deben a que en la línea germinal

existen cuatro genes Cγ , si bien éstos comparten 90-95% de sus secuencias. Ello nos indica, además, que han divergido hace poco tiempo en la escala evolutiva a partir de un gen ancestral común. Las IgG poseen gran capacidad de desarrollar elevada afinidad de unión al antígeno. Son las mayoritarias durante la respuesta secundaria. Difunden más fácilmente que los demás isotipos al espacio extravascular (hasta el 50% de las IgG se encuentran en los fluidos tisulares), donde son las principales responsables de neutralizar toxinas bacterianas (de hecho, son las únicas que funcionan como antitoxinas). Las IgG1 e IgG3 funcionan muy bien como opsoninas: se unen a receptores para Fc de la superficie de células fagocíticas (sobre todo macrófagos), ayudándolas a fagocitar y destruir el microorganismo. La IgG3 > IgG1 > IgG2 activan el complemento por la ruta clásica: el dominio Cγ 2 de dos moléculas de IgG se une al componente C1q del complemento, para iniciar la activación de éste. En humanos la IgG1, IgG3 e IgG4 cruzan fácilmente la placenta. En otras especies no humanas (como en el cerdo), las IgG del calostro de la madre es absorbida por el recién nacido desde la luz intestinal hasta la sangre. Ello se debe a que las crías poseen unos receptores únicos en sus células del epitelio intestinal, que reconocen la Fc de la IgG, y la transportan a circulación sanguínea, lo cual confiere inmunidad pasiva durante las primeras semanas de vida.

5.6.2 Inmunoglobulina A (IgA) En humanos existen dos subclases: IgA1 e IgA2. En el suero predomina la subclase IgA1, constituyendo del 10 al 15% de las Ig totales (1.4-4 mg/ml), y allí aparece como monómeros (sin embargo, en otros animales, la IgA suele ser dimérica. Pero en las secreciones seromucosas es muy abundante la IgA2, que aparece como dímero. Para dar una idea de la abundancia de la IgA de las seromucosas, bastará decir que cada día se secretan unos 40 mg/Kg de peso corporal, frente a los 30 mg/Kg de IgG.

Las secreciones donde aparece la IgA secretoria (sIgA) son: saliva lágrimas fluido nasal tracto bronquial tracto genitourinario tracto digestivo

leche materna y calostro La estructura de la sIgA dimérica consta de dos monómeros de IgA2 unidos "cola con cola" por medio de un péptido conocido como pieza de unión (J), y recubiertos por la llamada pieza secretora. Cada monómero presenta una cola adicional con 18 aminoácidos. La cola de cada monómero se une por un puente disulfuro a la pieza J. Esta pieza J es un polipéptido de 15 kDa sintetizado en la misma célula plasmática que está produciendo la IgA2. Dicha célula plasmática termina secretando el complejo de las dos unidades de IgA unidas cola con cola por la pieza J. El complejo {IgA-J-IgA} es entonces reconocido por el llamado receptor de poli-Ig, situado en la membrana basal de las células epiteliales. Este receptor de poli Ig pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y está constituido por 5 dominios típicos de Ig, y anclado a la membrana basal epitelial. Parece que reconoce a la pieza J ya engarzada a los dos monómeros de IgA. El receptor de poli-Ig se une entonces a cada monómero de IgA, probablemente formando puentes disulfuro con los respectivos dominios Cα 2, con lo cual comienza un fenómeno de endocitosis mediada por receptor: se forma una vesícula membranosa recubierta de clatrina, en cuyo interior se encuentra el complejo {IgA-J-IgA} unido a su vez al receptor de poli-Ig. Esta vesícula intracitoplásmica viaja por el citoplasma, desde el extremo basal hasta el apical, y termina fusionándose con la membrana que da a la luz del conducto. Entonces el receptor de poli-Ig se rompe a nivel del tramo que hay entre el último de sus dominios Ig y la membrana, con lo que queda libre la forma madura de la IgA secretada: un complejo de dos monómeros de IgA unidos por la pieza J, y todo ello recubierto del componente secretor, que como se ve, no es más que la porción mayor escindida del receptor de poli-Ig. La pieza secretoria recubre buena parte de los dos monómeros de IgA, enmascarando sus respectivas regiones bisagra. Ello hace que la sIgA esté mejor protegida contra las proteasas, lo que se manifiesta en que posea una alta vida media en el entorno del conducto al que ha sido secretada. Además, la IgA2 es intrínsecamente más resistente que otras inmunoglobulinas al ataque de las proteasas bacterianas. La sIgA cumple una misión importantísima en la protección del organismo frente a la entrada de numerosos agentes patógenos: al tener tetravalencia, es capaz de unirse a epitopos repetitivos de

la superficie de virus y bacterias, inhibiendo la colonización por estos de las mucosas. Parece que el componente secretor también tiene el efecto de evitar la adherencia de los microorganismos al epitelio (a esto se le ha llegado a llamar efecto Teflón™. Los complejos de sIgA y antígeno son atrapados eficazmente en el fluido mucoso del epitelio, y eliminados por el movimiento ciliar del tracto respiratorio o por el peristaltismo del intestino.

5.6.3 Inmunoglobulina M (IgM) Supone del 5 al 10% de las Ig séricas (1.5 mg/ml de media). Se secreta como pentámeros, con las Fc hacia adentro y los brazos Fab hacia afuera. Cada monómero lleva un dominio constante adicional (el Cμ 2). Las unidades del pentámero están unidas entre sí por puentes disulfuro entre dominios Cμ 3 adyacentes y entre Cμ 4 adyacentes, exceptuando dos de las 5 unidades, que usan unión mediante una pieza J similar a la ya vista para la IgA. Es la primera inmunoglobulina que sintetiza el neonato por sí mismo, y también es la primera en aparecer durante la respuesta primaria. Al ser un pentámero, tiene una gran valencia teórica (10), pero dicha valencia sólo se usa al máximo con pequeños haptenos. En el caso de haptenos o epitopos mayores sólo llega a usar 5 de esas valencias, debido a impedimentos estéricos. El tener gran valencia significa que posee una mayor capacidad que

otras

Ig

para

unirse

a

antígenos

particulados

multidimensionales: (p. ej., partículas de virus, eritrocitos de otro individuo), entrecruzándolos y provocando aglutinación, por lo que

las IgM son típicas aglutininas (son de 100 a 1.000 veces más eficaces que las IgG en este papel). Al unirse a este tipo de Ag particulados con epitopos repetitivos cambia de conformación: pasa de su configuración plana (forma de estrella) a una en forma de grapa o de cangrejo. Ello parece que a su

vez

sirve

para

que

se

pueda

activar

eficazmente

el

complemento por la ruta clásica. De hecho, fijan y activan muy bien el complemento (debido a que para activar el componente C1q se requieren dos moléculas de inmunoglobulinas cercanas, cosa que la pentamérica IgM logra "por definición"). Por ello, la IgM es muy buena citolítica. Están confinados en el torrente circulatorio (no se extravasan a tejidos), por lo que son muy buenos frente a bacteriemias.

5.6.4 Inmunoglobulina D (IgD) Supone el 0.2% de las inmunoglobulinas séricas (20 μ g/ml). Presenta una región bisagra bastante amplia, lo que puede ayudar a explicar el hecho de que es muy susceptible a proteolisis, siendo muy baja su vida media en sangre (unos tres días). En su forma libre en plasma, su función es desconocida. Aparece como Ig de membrana, junto con la mIgM, en los linfocitos B maduros vírgenes, donde parece que su función es constituir un receptor antigénico, tanto en activación como en supresión de los linfocitos B.

5.6.5 Inmunoglobulina E (IgE) Es la menos abundante en suero (0.3 μ g/ml) Presenta un dominio adicional (el que pasa a ser el Cε 2). Es la mediadora de las reacciones de hipersensibilidad inmediata (alergias), como la fiebre del heno, asma extrínseco o el choque anafiláctico. Para ello, las moléculas de IgE se unen a receptores específicos para Fc de IgE situados en las membranas de mastocitos tisulares y de basófilos sanguíneos. Cuando dos moléculas de IgE unidas a sus respectivos receptores en estas células se entrecruzan con el alergeno específico, se produce la desgranulación, lo que libera extracelularmente mediadores farmacológicamente activos, como histamina y ciertas citoquinas. También se provoca la síntesis de novo de eicosanoides

(prostaglandinas y leucotrienos). Todo ello colabora en los síntomas de alergia. Pero la IgE también juega un papel fisiológico, beneficioso: confiere protección local frente a ciertos patógenos grandes, como helmintos: sirve para reclutar células plasmáticas y efectoras a través de una reacción de inflamación aguda. Si el parásito ha logrado atravesar la barrera de las mucosas y la de la sIgA, puede ser reconocido por moléculas de IgE específicas previamente unidas a receptores de mastocitos. Ello desencadena una reacción de inflamación aguda en la que las aminas vasoactivas (histamina) y los factores quimiotácticos atraen a polimorfonucleares neutrófilos; a continuación entran en el tejido moléculas de IgG, componentes del complemento, granulocitos y eosinófilos. Estos últimos reconocen al parásito recubierto por IgG, y colaboran en su destrucción.

5.7 RECEPTORES CELULARES PARA Fc DE LAS Ig En apartados anteriores hemos venido aludiendo a diversos receptores de la superficie de distintas células que sirven para engarzar inmunoglobulinas a través de las porciones Fc de éstas. Son moléculas ancladas a membrana, y la mayoría de ellos poseen dominios de tipo inmunoglobulina.

5.7.1 Receptores para Fcγ 5.7.1.1 Fcγ IR (=CD64) Posee tres dominios de tipo Ig. Presenta una alta afinidad hacia la IgG monomérica y la IgG agregada (en inmunocomplejos). Está presente en monocitos, y algo menos en macrófagos sin estimular. La unión de inmunocomplejos {IgG-Ag} al Fcγ RI se produce por el dominio Cγ 2 del Ac, y elloestimula la muerte extracelular de la célula diana (en un mecanismo conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, ADCC).

5.7.1.2 Fcγ RII (=CD32) Posee dos dominios de tipo Ig. Presenta baja afinidad hacia la IgG. Aparece en la superficie de monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células B y plaquetas. No es capaz de unir IgG monomérica, pero es muy efectivo para captar inmunocomplejos (IgG agregada). El entrecruzamiento de varios de estos receptores con inmunocomplejos provoca la

activación de la célula respectiva, que en el caso de las células fagocíticas supone un aumento de esa actividad fagocitadora, y en el caso de las plaquetas, un aumento de la trombosis. Por otro lado, los linfocitos B presentan una isoforma diferente (conocida como Fcγ RIIB), que cuando se une a inmunocomplejos provoca la regulación negativa de estas células B (retrorregulación negativa sobre la capacidad de producción de Ac).

5.7.1.3 Fcγ RIII (=CD16) Es un receptor con dos dominios de tipo Ig. De baja afinidad. Presente en macrófagos, células NK, neutrófilos y eosinófilos. Responsable del mecanismo ADCC de las células NK y de la eliminación de los inmunocomplejos por parte de los macrófagos.

5.7.1.4 Fcγ Rn A diferencia de los anteriores, no pertenece a la familia de las inmunoglobulinas, sino a la del MHC-I (posee incluso β 2microglobulina). Presente en la cara luminal de las células del epitelio intestinal de neonatos de ciertas especies de mamíferos. Sirve para captar IgG de la leche materna en crías de ratones y de otros animales, y transportarlos al lado basal, de donde irán a la circulación. Existe otro receptor, aún mal caracterizado, en las células del sincitiotrofoblasto (en la placenta), que permite el paso de IgG al feto.

5.7.2 Receptores para Fcε 5.7.2.1 Fcε RI Consta de tres tipos de cadenas polipeptídicas: una α (con dos dominios de tipo Ig), una β y dos cadenas γ unidas por puentes disulfuro. Está presente en mastocitos. La cadena α se une muy ávidamente al dominio Cε 2 (es decir, el dominio adicional de la IgE). La cadena β y las dos γ parecen intervenir en la transducción intracelular de la señal. El entrecruzamiento de dos receptores Fcε IR (cada uno con su correspondiente molécula de IgE) con un mismo alergeno provoca la desgranulación del mastocito, iniciando la reacción de hipersensibilidad de tipo I (alergia).

5.7.2.2 Fcε RII No pertenece a la familia de las Ig, sino que presenta homología con varias lectinas animales, como la proteína de unión a la manosa (MBP). Tiene baja afinidad hacia la IgE. Presente en células inflamatorias y linfocitos B. Se une al dominio Cε 3.

5.8 LA SUPERFAMILIA GÉNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS A lo largo de este capítulo (y de sucesivos) estamos viendo aparecer en escena distintas moléculas (no sólo inmunoglobulinas) que poseen al menos un dominio típico de Ig. Estas proteínas están codificadas por genes que presentan homologías entre sí. Estos diferentes genes probablemente se originaron a partir de un gen ancestral que codificaba algo parecido al dominio de Ig. En el pasado, dicho gen debió de sufrir sucesivas duplicaciones, y partir de entonces, cada copia del gen original evolucionó de modo independiente; incluso algunas de las copias debieron fusionarse con genes o partes de genes diferentes. El resultado evolutivo es que hoy, sobre todo en los mamíferos, cada especie posee múltiples genes derivados del ancestral, que no están ligados genéticamente (localizados en sitios distintos del genoma), y que en cada caso cumplen misiones diferenciadas. Por todo ello, se habla de una superfamilia de genes que tienen en común el codificar al menos un dominio de tipo Ig. A nivel de proteína, el dominio de Ig posee, como ya hemos estudiado, de 100 a 110 aminoácidos, con un bucle característico entre dos cisteínas conservadas y separadas entre sí por unos 50 a 70 aminoácidos, y que forma en el espacio una estructura terciaria globular elongada a base de dos láminas β antiparalelas. La evolución molecular, a partir del dominio ancestral de tipo Ig ha generado tres tipos de variantes: dominios de tipo V: se parecen al dominio variable de las inmunoglobulinas; dominios de tipo C1: su prototipo es el dominio constante de las

inmunoglobulinas; dominios de tipo C2: poseen rasgos intermedios entre los dominios V y C1. Son muy abundantes los ejemplos de proteínas codificadas por miembros de esta superfamilia génica: Cadenas H y L de las inmunoglobulinas. Cadenas Igα e Igβ del complejo BCR. Cadenas del receptor de linfocitos T (TCR). Cadenas γ δ ε del complejo CD3, que acompaña al TCR. β 2-microglobulina, que forma parte del MHC-I. Dominio proximal del MHC-I. Dominios proximales del MHC-II. CD2, CD4, CD8, CD28 de los linfocitos T. Receptor de poli-Ig (y su versión "recortada" componente secretor de la sIgA). Varias moléculas de adhesión celular (VCAM, ICAM, etc.). PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas). Se ha lanzado la hipótesis de que ya los invertebrados (al menos desde los artrópodos) poseen moléculas de adhesión celular con dominios de tipo Ig. Probablemente en los primitivos vertebrados se produjeron repetidas duplicaciones y diversificaciones evolutivas del gen ancestral, de modo que la selección natural encontró una nueva utilidad a algunas de las moléculas resultantes en ese gran logro evolutivo que ha sido el sistema inmune de los vertebrados. Un rasgo común de todas estas proteínas (incluidas las inmunoglobulinas) es que, al igual que la proteína primitiva ya existente en invertebrados, son capaces de facilitar interacciones y contactos entre proteínas ancladas a membrana de distintas células (una reminiscencia de su papel original como moléculas de adhesión celular). Como ejemplos de interacciones entre distintos miembros de proteínas o dominios de estas superfamilia tenemos (algunos ya los hemos visto, y otros serán tratados más adelante): VH-VL CH1-CL CH3-CH3 poli Ig-Fc de IgA e IgM CD4-MHC II CD8-MHC I TCR-MHC Igα /Igβ -mIg