Labo 6

INTRODUCCIÓN El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable. Es un polímero muy grande y ramificado de residuos de glucosa, unidos en su mayoría por enlaces glucosídicos α -1,4. Las ramificaciones se forman por enlaces α -1,6, los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada diez residuos. La presencia de glucógeno incrementa fuertemente la cantidad de glucosa disponible inmediatamente entre las comidas y durante la actividad muscular. Los lugares principales de almacenamiento del glucógeno son el hígado y el músculo esquelético, siendo en el hígado mayor la concentración (10% de la masa hepática y en los músculos 1% de la masa muscular). Además, pueden encontrarse pequeñas cantidades de glucógeno en ciertas células gliales del cerebro. El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos con un diámetro variable de entre 10 y 40 nm; estos gránulos contienen proteínas reguladoras y también las enzimas que catalizan la síntesis y degradación del glucógeno a glucosa, la cual es liberada al torrente sanguíneo rápidamente, en caso de necesidad; como en los casos de tensión o alerta, el glucógeno se degrada nuevamente a glucosa, que queda disponible para el metabolismo energético. Gracias a la capacidad de almacenamiento de glucógeno, se reducen al máximo los cambios de presión osmótica que la glucosa libre podría ocasionar tanto en el interior de la célula como en el medio extracelular. En el hígado la conversión de glucosa almacenada en forma de glucógeno a glucosa libre en sangre, está regulada por la hormona glucagón y adrenalina. El glucógeno se almacena dentro de vacuolas en el citoplasma de las células que lo utilizan para la glucólisis. Estas vacuolas contienen las enzimas necesarias para la hidrólisis de glucógeno a glucosa. La regulación del metabolismo del glucógeno se ejecuta a través de las dos enzimas; la glucógeno sintetasa que participa en su síntesis, y la glucógeno fosforilasa en la degradación. Tanto la glucógeno sintetasa como la glucógeno fosforilasa se regulan por un mecanismo de modificación covalente. Las hormonas adrenalina y glucagón activan las proteínas quinasas que fosforilan ambas enzimas, provocando activación de la glucógeno fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno; mientras que la glucógeno sintetasa disminuye su actividad, lo que inhibe la síntesis de glucógeno. La hormona insulina provoca la desfosforilación de las enzimas, en consecuencia la glucógeno fosforilasa se hace menos activa, y la glucógeno sintetasa se activa, lo que favorece la síntesis de glucógeno. Es decir, que hormonas como la adrenalina y el glucagón favorecen la degradación del glucógeno, mientras que la insulina estimula su síntesis. •

OBJETIVOS Determinar la variación de la concentración, en el tiempo, de glucógeno y glucosa en cortes de hígado de rata en solución de Krebs, para confirmar

• •

así el rol de éste en la regulación de la glicemia sanguínea, a través de procesos como la glucogenolisis. Perfeccionar la realización de la técnica de GOD-PAP para la determinación de glucosa. Aprehender a determinar cuantitativamente la concentración de glucógeno hepático.

Material es

MATERIALES Y MÉTODOS

Tubos de ensayo Gradilla para tubos de ensayo Pipetas de 2 mL Pipetas de 5 mL Propipeta verde Propipeta azul Micropipeta 200 – 1000µ L Puntas para micropipeta Recipiente para puntas usadas Papel filtro Marcador Vórtex Baño termorregulado para la Incubación Tubos Khan Espectrofotómetro Cubetas para espectrofotómetro Gradillas para Cubetas Mortero Embudo Balanza Cronómetro

Reactivos

Solución de Krebs (isotónica con el plasma) Ácido Tricloroacético 5% Reactivo de Lugol Kit para determinación enzimática de glucosa (GODPAP) (tampón fosfato, pH 7.3, 100mmol; fenol 16mmol/L; 4aminoantipirina 0.25mmol/L; glucosa oxidasa ≥ 20000U/L; peroxidasa ≥ 1000U/L). Solución estándar de glucógeno 0.05 g% Solución estándar 20 mg%

• PREPARACIÓN DE CORTES DE HÍGADO: Un momento antes del práctico algunos compañeros se ofrecieron, de forma voluntaria, a sacrificar las ratas1. Utilizando guantes de procedimiento, tijeras y pinzas, se extrajo el hígado y a continuación se puso en un vaso precipitado con suero fisiológico. Se hacen cortes delgados que se dejan sobre una placa petri sobre hielo. Se pesaron en la balanza2 tres porciones de cortes de aprox. 150 mg cada uno, los trozos no deben diferir entre sí en más de 10 mg. Se colocan las porciones en 3 tubos rotulados como: 0’, 10’ y 30’. • INCUBACIÓN: A cada tubo se le agregó 2 mL de solución de Krebs para su posterior incubación en el baño termorregulado a 37°C cronometrando diferentes tiempos: 0’, 10’ y 30’. Terminado dicho tiempo, se vacía el 1

Por lo demás, bien alimentadas y en situación de stress controlado, para que no secreten adrenalina y no liberen el glucógeno de su hígado. 2 Tarada previamente con el respectivo tubo de ensayo para cada muestra del tejido

sobrenadante líquido en otra serie de tubos, con el cual se determinará la glucosa liberada, utilizando el método enzimático GOD-PAP. • Los trozos de tejidos que quedaron en los tubos incubados servirán para determinar el glucógeno. Tubos Cortes de Hígado (mg) Solución de Krebs (mL) Tiempo de incubación 37°C (minutos)

0’ 150 2.0 0

10’ 150 2.0 10

30’ 150 2.0 30

• DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GLUCÓGENO HEPÁTICO El tubo que corresponde al tiempo cero (F1) de nuestro experimento, contiene sólo el trozo de hígado. En él, rápidamente agregamos 5mL de TCA 5%, llevamos a vórtex, para luego vaciar el contenido3 a un mortero y triturar por aproximadamente 5 minutos, hasta homogeneizar completamente. Una vez filtrado4, se determina el contenido de glucógeno, tomando 0.5 mL del filtrado, agregándole 1.5 mL de TCA 5% y 0.25mL de Reactivo de Lugol, lo que se lleva a Vórtex para mezclar por agitación. Este procedimiento se repitió de forma exacta en los otros tiempos de incubación: 10’ y 30’, en los tubos F2 y F3, respectivamente. Para cuantificar el glucógeno, se prepararon dos estándar (Std) y un tubo Blanco (Bco). Se vació el contenido de los tubos en las cubetas para espectrofotómetro, previamente escogidas por los docentes a cargo, para leer a 540nm. Tubos Filtrado (ml) TCA 5% (ml) Glucógeno 0.05% (ml) Reactivo yodo (ml)

0’ 0.5 1.5

10’ 0.5 1.5

30’ 0.5 1.5

Estándar 1.0

Blanco 2.0

-

-

-

1.0

-

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

• DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GLUCOSA (GOD-PAP) La glucosa liberada desde el hígado al líquido de incubación (al detectar una falsa hipoglicemia, condicionada por la solución de Krebs) es determinada cuantitativamente a través del método enzimático GOD-PAP. Para llevar a cabo el procedimiento, colocamos 100µ L del sobrenadante a 3 tubos rotulados (S1, S2 y S3), posteriormente se agrega 1.5mL de Reactivo enzimático, se mezcla por agitación en Vórtex e incubamos 10 minutos a 37°C en el baño termorregulado. Finalmente, para leer a espectrofotómetro se preparan dos tubos Estándar y un Blanco, se vacía el contenido en cubetas para espectrofotómetro y se lee a 500nm. 3

Cuidadosamente, no bruscamente como dice la guía, pues sino, salta fuera del mortero. Aunque no lo hicimos en el práctico, antes del filtrado se puede centrifugar (para mejores resultados) 4

Sobrenadante Estándar 20mg% (µ L) Reactivo Enzimático (µ L)

0’ (S1)

10’ (S2)

30’ (S3)

100

100

100

Estándar (x2) -

-

-

-

100

-

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

Blanco -

RESULTADOS Realizamos una regla de 3 simple pues tenemos la concentración y absorbancia del estándar de glucosa y glucógeno, lo cual nos permite calcular la concentración de las otras muestras. Para glucógeno: 0.25 mg/ml --------> 0.316 X = 0.69 mg/ml X mg/ml --------> 0.869 GLUCOGENO (longitud de onda: 540nm) std1 0.321 std2 0.310 0’ 0.869 15’ 0.631 30’ 0.458

[mg/ml] glucógeno 0.25 0.25 0.69 0.50 0.36

De acuerdo a los resultados, la concentración de glucógeno va disminuyendo a medida que aumentan los minutos, debido a que el hígado gasta sus reservas con el fin de aumentar la concentración de glucosa en la solución. Para glucosa: 0.2 mg/ml --------> 0.387 X mg/ml --------> 0.340

X = 0.18 mg/ml

GLUCOSA (longitud de onda: 500nm) std1 0.388 std2 0.385 0’ 0.340 15’ 0.502 30’ 0.605

[mg/ml] glucosa 0.20 0.20 0.18 0.26 0.31

Según los resultados anteriores, la concentración de glucosa aumenta a medida que transcurre

el tiempo, pues el hígado regula la glicemia transformando el glucógeno en glucosa por el proceso de glucogenolisis.

* Para el cálculo de las concentraciones se utilizó el promedio de los estándares para glucosa y glucógeno.

En el grafico se observa que la concentración de glucógeno disminuye a mayor tiempo, en cambio la de glucosa aumenta. Esto se debe a que el hígado, órgano que se encarga de regular la glicemia sanguínea entre sus funciones, trata de aumentar la concentración de glucosa en la solución de Krebs a partir del glucógeno disponible (glucogenolisis), razón por la cual la concentración de éste último disminuye. * Para determinar las variaciones de ambas concentraciones en el tiempo, se utilizaron cortes de hígado de rata.

CONCLUSIÓN

Desarrollado ya el práctico, por los resultados obtenidos, hemos podido cumplir el objetivo del estudio de glucógeno en tejido hepático junto con observar la relación entre la cantidad de glucógeno presente y la cantidad de glucosa que se obtenía de la misma muestra al pasar el tiempo. La relación que se obtuvo era la esperada en donde la cantidad de glucógeno disminuía conforme pasaba el tiempo debido al proceso de glucogenolisis el cual aumentaba la cantidad de glucosa en la muestra. Sucede con el corte de tejido hepático al ser sometido a un medio similar al plasma sanguíneo carente de glucosa. Tal como indica la teoría, se ve favorecida la glucogenólisis para liberar glucosa a la sangre, o, si fuera el caso de un paciente humano, para contrarrestar la hipoglicemia. Para la cuantificación de glucógeno y glucosa se detuvieron las reacciones con la aplicación de ATC al 5% el cual mantuvo constantes las cantidades de glucógeno mientras se procedía con la muestra de tejido hepático. Para esto se tomó el sobrenadante una vez incubada la muestra de tejido hepático a 37°C por distintos valores de tiempo, el que se procedió a estudiar por el método GOD-PAP para determinar la concentración de glucosa, el cual, como se trató en el práctico anterior, se fundamenta en la generación de un compuesto coloreado que es proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra y que es sometido a estudio espectrofotométrico. Los resultados como ya hemos mencionado fueron los esperados ya que conforme las muestras tenían un mayor tiempo de incubación se observaba un aumento en la cantidad de glucosa, esto debido a que el medio era el apropiado y, al no contener sustratos, predominaba el proceso de formación de glucosa. Para la cuantificación de glucógeno también se procedió con técnicas espectrofotométricas debido a la propiedad de este de dar coloración caoba con el yodo. Una vez detenida la reacción se procedió a sacar el glucógeno de las células con métodos mecánicos triturando el trozo de hígado. Luego se tomo un poco de la solución resultante y se le aplicó reactivo de lugol para dejar reposar por 5 minutos y llevar a espectrofotómetro. La tendencia de los resultados fue la esperable, donde la cantidad de glucógeno había disminuido mientras más tiempo de incubación había tenido la muestra, pues éste se había degradado a glucosa por el proceso de glucogenolisis. Situación que se observa en las personas cuando es necesario aumentar el nivel de glucosa en la sangre debido a un ayuno o ejercicio intenso, el hígado recurre a sus reservas de glucógeno el cual es degradado a glucosa y liberada a la sangre, para así mantener una glicemia constante, ya que el hígado cumple un importante rol en la regulación de ésta. Podemos concluir además, que la degradación de glucógeno es un proceso relativamente rápido; en un intervalo de aproximadamente 30 minutos la concentración de las reservas de glucógeno en el hígado ya había disminuido considerablemente, según los datos obtenidos mediante espectrofotometría, y, por el contrario, la concentración de glucosa liberada había aumentado DISCUSIÓN Una vez mas fue utilizado el método GOD-PAP del cual se conoce su aplicación en la determinación de presencia de glucosa en la orina, tema tratado en el práctico anterior. Al igual que con la glucosa, una vez más

debimos recurrir a técnicas espectrofotométricas para el estudio de glucógeno, de las cuales ya se conocen las ventajas y dificultades que presenta en su procedimiento, asociadas principalmente a la correcta preparación de la muestra a estudiar. Durante el práctico, no presentamos dificultad alguna en el procedimiento pues se tuvo cuidado en las etapas mas sensibles y también se estuvo muy atento al tiempo entre cada muestra para que los resultados obtenidos fueran lo mas certeros posibles. Es importante destacar que el aumento de glucosa en la solución, y la disminución de ésta en los hepatocitos no es exactamente proporcional, ya que durante el procedimiento puede ocurrir pérdida de ésta, como consecuencia del manejo de los instrumentos.

BIBLIOGRAFÍA • • • • • •

Dr. Reginald Del Pozo; Mg. Mirna Muñoz. “Guía de Trabajos Prácticos Bioquímica”; U.C.S.C., Fac. Medicina, 2003. Lehninger, Albert; Nelson, David; Cox, Michael. “Principios de Bioquímica”; Editorial Omega, segunda edición, 1995. Stryer, Lubert. “Bioquímica” Vol. 2; Editorial Reverté, S.A.; cuarta edición, 1995. http://www.scielo.cl/pdf/rcp/v56n6/art01.pdf http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2004/miranda_s/sources/miranda_s. pdf http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1994.pdf