Labo 12
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- Words: 2,193
- Pages: 8
Patricia Lobos Rodrigo Medina Mitchel Materola Rafael Moya
INTRODUCCIÓN
Existen muchos métodos para separar sustancias, muestras y componentes, como la cromatografía en columnas, cromatografía en papel y cromatografía en capa fina; en este laboratorio nos especificaremos en la cromatografía de filtración en gel. Aquí las macromoléculas pueden separarse en forma muy selectiva mediante su tamaño. En este primer práctico calibraremos una columna de 40x1 de Biogel y estimaremos el Vo y Vt. En este tipo de cromatografía se permite obtener mucha cantidad de proteínas pero el problema es que posee un menor poder resolutivo que la electroforesis, lo especial de esta cromatografía es su matriz solida porosa que consiste en un polímero que tiene la tendencia de ser muy hidratado y de diámetro 100 uM aproximadamente. Existen más matrices en el mercado, las más habituales son el sephadex, la sheparosa y el Biogel, esta última matriz posee la cualidad que las moléculas menores entran en esta esfera pero las que poseen un mayor peso molecular no. Por lo tanto las moléculas grandes fluyen con más rapidez a través de la columna y salen antes porque poseen un volumen menor. Esto nos advierte que el orden de aparición de las moléculas en la columna es inverso al orden de la electroforesis en el cual la trama continua del polímero impedía el movimiento de las moléculas mayores. En el segundo práctico se separaron y analizaron vesículas y micelas de bilis vesicular humano. Las micelas son de menor tamaño que las vesículas (alrededor de 30 a 60 A) constituidos por fosfolípidos y sales biliares, tienen como cualidad ser muy termodinámicamente estables pero estás transportan muy poco colesterol, en cambio las vesículas son más grandes (alrededor de 150 a 500 A), transportan muy bien el colesterol pero soy muy metaestables, es decir, de muy baja estabilidad. Lo característico de las micelas es que se rompen muy fácilmente durante la separación cromatografica es así que es indispensable la presencia de sales biliares en las distintas fracciones de elución. Luego se determinaran los fosfolípidos a través de la identificación de fosforo inorgánico por la reacción de Fiske y Subbarow, es importante mencionar que previo a esta reacción se debe mineralizar la muestra mediante procesos de oxido reducción con acido sulfúrico y peróxido de hidrogeno, a temperaturas muy altas de 150ºC a 200ºC y finalmente el fosforo al unirse con molibdato de amonio creará una solución de color azul y esta la leeremos en el espectrofotómetro a 830 nm. Paralelamente se determinará también las proteínas totales con el método de Lowry que consiste en una reacción de reducción de molibdeno en presencia de un agente reductor, contenidos en un reactivo comercial llamado Folin-Ciocalteu. Esta reacción ocurre principalmente en presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina y triptófano) y es exacerbada por la adición de cu+2, lo difícil de este método es que es muy sensible a interferentes, por lo tanto se le adicionará previo a la cuantificación acido tricloroacético y se lavará con dietiléter-etanol (2:1) para su delipidación del sedimento proteico obtenido. Luego de obtener los resultados de proteína y fosfolípidos se deberá hacer una grafica de “Fosfolípidos y proteínas versus número de fracción de elución”. Es aquí lo principal de nuestro trabajo ya que discutiremos los resultados y la probable asociación entre proteínas y las estructuras que transporta en colesterol biliar OBJETIVOS
Comprender la técnica de separación cromatografica Calibrar la comuna de Biogel Estimación del Vo y Vt del gel Separar una muestra de bilis humana Establecer la presencia de transportadores biliares de colesterol Determinar una eventual asociación entre proteínas y los transportadores de colesterol.
Materiales Bomba peristáltica Columna de vidrio (50cm de altura x 1cm de diámetro)con el gel (Bio-Gel A 5 cm o equivalente) Colector de fracciones Buffer de elución: Tris 20 mM (ph:8.0), NaCl 140 mM, NaN3 0,03 % 0,5 ml de fase isotrópica (obtenida de la bilis nativa) H2SO4 10N H2O2 Molibdato de amonio Fiske 1: o Disulfito de sodio 3.425g en 25ml de H2O o Ac. 1-amino2hidroxinaftalensulfónico 0.0625g Fiske2: o Sulfito de sodio 1,5g en 25ml de H2O Estandar de fosfolípidos: Fosfatidilcolinadimiristoil 4mM Tubos de vidrio
Agua destilada Micropipeta Gradilla Agua destilada Vórtex Bloque metálico (termoblock) Espectrofotómetro Posillos para espectrofotómetro Ac. Tricloroacético (TCA) 20% Dietiléter:etanol (2:1, v/v) NaOH 1N y 2N Reactivo alcalino: o 50ml de NaCO3 2% o 1ml de CuSO4 1% o 1ml de Na-K-tartrato 2% Reactivo Folin- Ciocalteu:H2O (1:1, v/v) Estándar de BSA 1mg/ml Microcentrífuga Repipeteadores Lápiz marcador Ultrasonido Tubos plásticos Tubos Eppendorf
Métodos 1) Llenado de la columna con el gel (Paso realizado por profesores encargados) 2) Calibración del gel (realizado por profesor a cargo): No realizamos este paso del práctico descrito en la guía de laboratorio, la calibración fue previamente hecha por el profesor a cargo. La calibración nos sirve para saber desde que fracción el gel comienza a separar. El profesor nos dio de la fracción 9 en adelante. 3) Elución de la muestra bilar: El flujo de la bomba es de 0,15 ml/min. Se nos hizo la demostración de cómo se realizaba la elución de la muestra en el gel. Sin embargo, la elución de la muestra biliar estaba lista. Nuestras fracciones eran 9, 10, 11, 12, 13 y 14. Cada fracción debía ser sometida a procedimientos de extracción de fosfolípidos y proteínas.
4)
Observaciones: 1.- Proteger reactivo de la luz 2.- Se puede sacar el sobrenadante volteando el tubo ya que las proteínas (en el caso que las hubiese) quedan adheridas al fondo del tubo. 3.- Nos tocó hacer estándar 2mM 4.- Realizado por profesores encargados 5.- Realizado por profesores encargados
RESULTADOS
Absorbancia (*)
Gráfico de absorbancia vs fracción 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
Fosfolípidos Proteínas 2 per. media móvil (Fosfolípidos) 2 per. media móvil (Proteínas) 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
Fracción
(*) 830nm y 750nm respectivamente para fosfolípidos y proteínas Curva de calibraciñon para Proteínas
Curva de calibración para fosfolípidos 0,8
0,3 0,25
0,6
Absorbancia (750nm)
Absorbancia (830nm)
0,7
0,5 0,4 0,3 0,2
0,2 0,15 0,1 0,05
0,1 0
0 0
0,5
1
Concentración (m M)
1,5
2
2,5
3
3,5
0
0,2
0,4
Std fosfolípidos mM
0,6
0,8
1
1,2
Std Proteínas mg/ml Concentración (m g/m l)
Lineal (Std
Lineal (Std Proteínas
Ejemplos de Cálculo de Concentración de Fosfolípidos: (para la fracción nº 31) • • • •
Fórmula de concentración en base a la absorbancia según gráfico: (*) Concentración = 4,2603*(abs)-0,0321 Abs = 0,722 Resultado = 3,0438366
Ejemplos de Cálculo de Concentración de Proteínas: (para la fracción nº 31) • • • •
Fórmula de concentración en base a la absorbancia según gráfico: Concentración = 3,7015*(abs) Abs = 0,139 Resultado = 0,5145085
(*) La formula se obtiene de la línea de tendencia, por eso es que para algunos casos el resultado es incoherente Ej: para absorbancia de fosfolípidos 0,001 la concentración que da es de -0,0278397; Para el caso de las proteínas no ocurre esto ya que solo existen 2 puntos (el 0,0 y el obtenido en el práctico). Ica Indica el V y el Vt de izquierda a derecha respectivamente. 0
Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración fosfolípidos en mM Proteínas en mg/ml
Fracción 9
0
0
0
0
10
0
0
0
0
11
0
0
0
0
12
0
0
0
0
13
0
0
0
0
14
0,032
0,1042296
0
0
15
0,027
0,0829281
0,002
0,007403
16
0,017
0,0403251
0,004
0,014806
17
0,022
0,0616266
0,031
0,1147465
18
0,002
0
0
0
19
0,009
0,0062427
0,005
0,0185075
20
0,039
0,1340517
0,01
0,037015
21
0
0
0
0
22
0,017
0,0403251
0
0
23
0,022
0,0616266
0
0
24
0,026
0,0786678
0
0
25
0,016
0,0360648
0
0
26
0,04
0,138312
0
0
27
0,062
0,2320386
0,004
0,014806
28
0,077
0,2959431
0
0
29
0,164
0,6665892
0,061
0,2257915
30
0,419
1,7529657
0,121
0,4478815
31
0,722
3,0438366
0,139
0,5145085
32
0,681
2,8691643
0,086
0,318329
33
0,431
1,8040893
0,053
0,1961795
34
0,191
0,7816173
0,063
0,2331945
35
0,08
0,308724
0,028
0,103642
36
0,041
0,1425723
0,011
0,0407165
37
0,037
0,1255311
0,009
0,0333135
38
0,005
0
0,001
0,0037015
39
0,001
0
0
0
40
0,001
0
0
0
41
0,001
0
0
0
42
0
0
0
0
43
0
0
0
0
(*) Para efectos lógicos los valores que según la ecuación de la recta dieron negativo (imposibles) se cambiaron a 0.
CONCLUSIÓN La técnica bioquímica de Cromatografía en Gel, separa los componentes de una mezcla dado el tamaño de los componentes de ésta. En nuestro práctico, sometimos a análisis una muestra de bilis humana a partir de la cual, identificamos las concentraciones de fosfolípidos y proteínas, dado las características propias de éstos de acuerdo a su tamaño y concentración, y a partir de tal información analizaremos, su relación con dos moléculas de transporte conocidas previamente; micelas y vesículas. Éstas últimas son de mayor tamaño que las micelas, por lo que debieran aparecer antes en las fracciones obtenidas, y con tal información como premisa, inferiremos su composición o relación con proteínas y fosfolípidos. Comenzando con los fosfolípidos, pudimos observar en los resultados y luego plasmado en los gráficos, que las primeras fracciones no presentaban tal tipo de moléculas, comenzando a aparecer sólo en la fracción número 14, y mostrando un pequeñísimo peak entre las fracciones 14, 15, 16 y 17, para luego decrecer y llegar a concentraciones de 0 nuevamente, o en otras palabras, desaparecer. Usando la premisa mencionada anteriormente, podemos asociar este peak a la presencia de las vesículas; hubo una máxima concentración de fosfolípidos de 0.104mM en la fracción 14, por lo que podemos inferir que en dicha fracción encontramos la mayor cantidad de vesículas dado su tamaño. Luego de desaparecer la concentración de fosfolípidos, éste vuelve a ascender para llegar a un prominente peak entre las fracciones 25 y 38 aproximadamente, dentro del cual el punto más alto correspondió a la fracción número 31 en la cual había una concentración de fosfolípidos equivalente a 3.04 mM aproximadamente. Tal presencia corresponde a la de micelas, y comparando ambas podemos afirmar que la muestra entregada, presenta mayor concentración de micelas que de vesículas, debido a la gran diferencia entre ambos peaks. Analizando ahora los resultados obtenidos correspondientes a las concentraciones presentes de proteínas, podemos ver que entre las fracciones 15 y 20 aparece un pequeñísimo peak de proteínas, teniendo valores muy cercanos a 0, por lo que son casi nulos. Tales valores, se relacionan directamente con la presencia de fosfolípidos en estas mismas fracciones, por lo que podemos inferir que existe una pequeña proporción de proteínas en las vesículas, pero reiteramos, que esta proporción es bajísima sólo ya que su punto más alto fue de 0.037 mM aprox (desestimamos el valor de la fracción 17, situación que explicaremos en la discusión). A partir de la fracción número 21 vuelven a desaparecer, para luego encontrarse nuevamente entre las fracciones número 27 y 38, porción que debe corresponder a la de micelas, alcanzando su mayor peak en la número 31 (0.514mM), misma fracción que obtuvo el peak de fosfolípidos, aunque la proporción entre éstos y proteínas es muy desigual: 6:1(utilizando las concentraciones obtenidas en este punto). De todas formas podemos observar que existe una mayor concentración de proteínas en la porción correspondiente micelas que a la de vesículas, a partir de lo cual concluimos que existe algún tipo de asociación entre proteínas y micelas. DISCUSIÓN Los valores obtenidos en éste práctico fueron acordes a los esperados, sin embargo debemos considerar, un factor para nada despreciable; el error humano. A pesar de que en un principio este proceso fue automatizado gracias al fraccionador, la adición de reactivos fue totalmente responsabilidad nuestra, por lo que pudimos observar algunos errores en las mediciones, que revelan tal factor. Específicamente se observa en la fracción 17 de proteínas, una elevadísima concentración de éstas, en comparación a las fracciones contiguas a ésta (16 y 18) y dado esto decidimos desestimar dicho valor, pudiéndose deber tanto al error humano como a algún tipo de problema con la cubeta utilizada. Así también obtuvimos dispares resultados en lo que a estándares se refiere, aunque se mantuvieron dentro de un margen racional. Sólo en el caso del estándar 4mM tuvimos que no considerar 2 valores ya que éstos arrojaron una absorbancia de 0.008, muy distante a los 0.667 y 0.746 de otro grupo. Dado esto es que al calcular algunos valores de concentraciones, utilizando la ecuación de la recta obtenida al graficar, es que se obtuvieron valores levemente negativos por lo que debimos aproximarlos a 0, situación que no alteró en absoluto los resultados que esperados. A pesar de todo lo anteriormente mencionado, los resultados fueron exitosos y a partir de ellos pudimos realizar un correcto análisis de concentraciones de fosfolípidos y proteínas.
Bibliografía Bibliografía
•
Guía de laboratorio de bioquímica año 2009.
•
Libro del Curso de bioquímica.
•
Libro Lehninger.
INTRODUCCIÓN
Existen muchos métodos para separar sustancias, muestras y componentes, como la cromatografía en columnas, cromatografía en papel y cromatografía en capa fina; en este laboratorio nos especificaremos en la cromatografía de filtración en gel. Aquí las macromoléculas pueden separarse en forma muy selectiva mediante su tamaño. En este primer práctico calibraremos una columna de 40x1 de Biogel y estimaremos el Vo y Vt. En este tipo de cromatografía se permite obtener mucha cantidad de proteínas pero el problema es que posee un menor poder resolutivo que la electroforesis, lo especial de esta cromatografía es su matriz solida porosa que consiste en un polímero que tiene la tendencia de ser muy hidratado y de diámetro 100 uM aproximadamente. Existen más matrices en el mercado, las más habituales son el sephadex, la sheparosa y el Biogel, esta última matriz posee la cualidad que las moléculas menores entran en esta esfera pero las que poseen un mayor peso molecular no. Por lo tanto las moléculas grandes fluyen con más rapidez a través de la columna y salen antes porque poseen un volumen menor. Esto nos advierte que el orden de aparición de las moléculas en la columna es inverso al orden de la electroforesis en el cual la trama continua del polímero impedía el movimiento de las moléculas mayores. En el segundo práctico se separaron y analizaron vesículas y micelas de bilis vesicular humano. Las micelas son de menor tamaño que las vesículas (alrededor de 30 a 60 A) constituidos por fosfolípidos y sales biliares, tienen como cualidad ser muy termodinámicamente estables pero estás transportan muy poco colesterol, en cambio las vesículas son más grandes (alrededor de 150 a 500 A), transportan muy bien el colesterol pero soy muy metaestables, es decir, de muy baja estabilidad. Lo característico de las micelas es que se rompen muy fácilmente durante la separación cromatografica es así que es indispensable la presencia de sales biliares en las distintas fracciones de elución. Luego se determinaran los fosfolípidos a través de la identificación de fosforo inorgánico por la reacción de Fiske y Subbarow, es importante mencionar que previo a esta reacción se debe mineralizar la muestra mediante procesos de oxido reducción con acido sulfúrico y peróxido de hidrogeno, a temperaturas muy altas de 150ºC a 200ºC y finalmente el fosforo al unirse con molibdato de amonio creará una solución de color azul y esta la leeremos en el espectrofotómetro a 830 nm. Paralelamente se determinará también las proteínas totales con el método de Lowry que consiste en una reacción de reducción de molibdeno en presencia de un agente reductor, contenidos en un reactivo comercial llamado Folin-Ciocalteu. Esta reacción ocurre principalmente en presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina y triptófano) y es exacerbada por la adición de cu+2, lo difícil de este método es que es muy sensible a interferentes, por lo tanto se le adicionará previo a la cuantificación acido tricloroacético y se lavará con dietiléter-etanol (2:1) para su delipidación del sedimento proteico obtenido. Luego de obtener los resultados de proteína y fosfolípidos se deberá hacer una grafica de “Fosfolípidos y proteínas versus número de fracción de elución”. Es aquí lo principal de nuestro trabajo ya que discutiremos los resultados y la probable asociación entre proteínas y las estructuras que transporta en colesterol biliar OBJETIVOS
Comprender la técnica de separación cromatografica Calibrar la comuna de Biogel Estimación del Vo y Vt del gel Separar una muestra de bilis humana Establecer la presencia de transportadores biliares de colesterol Determinar una eventual asociación entre proteínas y los transportadores de colesterol.
Materiales Bomba peristáltica Columna de vidrio (50cm de altura x 1cm de diámetro)con el gel (Bio-Gel A 5 cm o equivalente) Colector de fracciones Buffer de elución: Tris 20 mM (ph:8.0), NaCl 140 mM, NaN3 0,03 % 0,5 ml de fase isotrópica (obtenida de la bilis nativa) H2SO4 10N H2O2 Molibdato de amonio Fiske 1: o Disulfito de sodio 3.425g en 25ml de H2O o Ac. 1-amino2hidroxinaftalensulfónico 0.0625g Fiske2: o Sulfito de sodio 1,5g en 25ml de H2O Estandar de fosfolípidos: Fosfatidilcolinadimiristoil 4mM Tubos de vidrio
Agua destilada Micropipeta Gradilla Agua destilada Vórtex Bloque metálico (termoblock) Espectrofotómetro Posillos para espectrofotómetro Ac. Tricloroacético (TCA) 20% Dietiléter:etanol (2:1, v/v) NaOH 1N y 2N Reactivo alcalino: o 50ml de NaCO3 2% o 1ml de CuSO4 1% o 1ml de Na-K-tartrato 2% Reactivo Folin- Ciocalteu:H2O (1:1, v/v) Estándar de BSA 1mg/ml Microcentrífuga Repipeteadores Lápiz marcador Ultrasonido Tubos plásticos Tubos Eppendorf
Métodos 1) Llenado de la columna con el gel (Paso realizado por profesores encargados) 2) Calibración del gel (realizado por profesor a cargo): No realizamos este paso del práctico descrito en la guía de laboratorio, la calibración fue previamente hecha por el profesor a cargo. La calibración nos sirve para saber desde que fracción el gel comienza a separar. El profesor nos dio de la fracción 9 en adelante. 3) Elución de la muestra bilar: El flujo de la bomba es de 0,15 ml/min. Se nos hizo la demostración de cómo se realizaba la elución de la muestra en el gel. Sin embargo, la elución de la muestra biliar estaba lista. Nuestras fracciones eran 9, 10, 11, 12, 13 y 14. Cada fracción debía ser sometida a procedimientos de extracción de fosfolípidos y proteínas.
4)
Observaciones: 1.- Proteger reactivo de la luz 2.- Se puede sacar el sobrenadante volteando el tubo ya que las proteínas (en el caso que las hubiese) quedan adheridas al fondo del tubo. 3.- Nos tocó hacer estándar 2mM 4.- Realizado por profesores encargados 5.- Realizado por profesores encargados
RESULTADOS
Absorbancia (*)
Gráfico de absorbancia vs fracción 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
Fosfolípidos Proteínas 2 per. media móvil (Fosfolípidos) 2 per. media móvil (Proteínas) 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
Fracción
(*) 830nm y 750nm respectivamente para fosfolípidos y proteínas Curva de calibraciñon para Proteínas
Curva de calibración para fosfolípidos 0,8
0,3 0,25
0,6
Absorbancia (750nm)
Absorbancia (830nm)
0,7
0,5 0,4 0,3 0,2
0,2 0,15 0,1 0,05
0,1 0
0 0
0,5
1
Concentración (m M)
1,5
2
2,5
3
3,5
0
0,2
0,4
Std fosfolípidos mM
0,6
0,8
1
1,2
Std Proteínas mg/ml Concentración (m g/m l)
Lineal (Std
Lineal (Std Proteínas
Ejemplos de Cálculo de Concentración de Fosfolípidos: (para la fracción nº 31) • • • •
Fórmula de concentración en base a la absorbancia según gráfico: (*) Concentración = 4,2603*(abs)-0,0321 Abs = 0,722 Resultado = 3,0438366
Ejemplos de Cálculo de Concentración de Proteínas: (para la fracción nº 31) • • • •
Fórmula de concentración en base a la absorbancia según gráfico: Concentración = 3,7015*(abs) Abs = 0,139 Resultado = 0,5145085
(*) La formula se obtiene de la línea de tendencia, por eso es que para algunos casos el resultado es incoherente Ej: para absorbancia de fosfolípidos 0,001 la concentración que da es de -0,0278397; Para el caso de las proteínas no ocurre esto ya que solo existen 2 puntos (el 0,0 y el obtenido en el práctico). Ica Indica el V y el Vt de izquierda a derecha respectivamente. 0
Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración fosfolípidos en mM Proteínas en mg/ml
Fracción 9
0
0
0
0
10
0
0
0
0
11
0
0
0
0
12
0
0
0
0
13
0
0
0
0
14
0,032
0,1042296
0
0
15
0,027
0,0829281
0,002
0,007403
16
0,017
0,0403251
0,004
0,014806
17
0,022
0,0616266
0,031
0,1147465
18
0,002
0
0
0
19
0,009
0,0062427
0,005
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20
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0,01
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21
0
0
0
0
22
0,017
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0
0
23
0,022
0,0616266
0
0
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0
25
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0
0
26
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0
27
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0,004
0,014806
28
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0
0
29
0,164
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0,061
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30
0,419
1,7529657
0,121
0,4478815
31
0,722
3,0438366
0,139
0,5145085
32
0,681
2,8691643
0,086
0,318329
33
0,431
1,8040893
0,053
0,1961795
34
0,191
0,7816173
0,063
0,2331945
35
0,08
0,308724
0,028
0,103642
36
0,041
0,1425723
0,011
0,0407165
37
0,037
0,1255311
0,009
0,0333135
38
0,005
0
0,001
0,0037015
39
0,001
0
0
0
40
0,001
0
0
0
41
0,001
0
0
0
42
0
0
0
0
43
0
0
0
0
(*) Para efectos lógicos los valores que según la ecuación de la recta dieron negativo (imposibles) se cambiaron a 0.
CONCLUSIÓN La técnica bioquímica de Cromatografía en Gel, separa los componentes de una mezcla dado el tamaño de los componentes de ésta. En nuestro práctico, sometimos a análisis una muestra de bilis humana a partir de la cual, identificamos las concentraciones de fosfolípidos y proteínas, dado las características propias de éstos de acuerdo a su tamaño y concentración, y a partir de tal información analizaremos, su relación con dos moléculas de transporte conocidas previamente; micelas y vesículas. Éstas últimas son de mayor tamaño que las micelas, por lo que debieran aparecer antes en las fracciones obtenidas, y con tal información como premisa, inferiremos su composición o relación con proteínas y fosfolípidos. Comenzando con los fosfolípidos, pudimos observar en los resultados y luego plasmado en los gráficos, que las primeras fracciones no presentaban tal tipo de moléculas, comenzando a aparecer sólo en la fracción número 14, y mostrando un pequeñísimo peak entre las fracciones 14, 15, 16 y 17, para luego decrecer y llegar a concentraciones de 0 nuevamente, o en otras palabras, desaparecer. Usando la premisa mencionada anteriormente, podemos asociar este peak a la presencia de las vesículas; hubo una máxima concentración de fosfolípidos de 0.104mM en la fracción 14, por lo que podemos inferir que en dicha fracción encontramos la mayor cantidad de vesículas dado su tamaño. Luego de desaparecer la concentración de fosfolípidos, éste vuelve a ascender para llegar a un prominente peak entre las fracciones 25 y 38 aproximadamente, dentro del cual el punto más alto correspondió a la fracción número 31 en la cual había una concentración de fosfolípidos equivalente a 3.04 mM aproximadamente. Tal presencia corresponde a la de micelas, y comparando ambas podemos afirmar que la muestra entregada, presenta mayor concentración de micelas que de vesículas, debido a la gran diferencia entre ambos peaks. Analizando ahora los resultados obtenidos correspondientes a las concentraciones presentes de proteínas, podemos ver que entre las fracciones 15 y 20 aparece un pequeñísimo peak de proteínas, teniendo valores muy cercanos a 0, por lo que son casi nulos. Tales valores, se relacionan directamente con la presencia de fosfolípidos en estas mismas fracciones, por lo que podemos inferir que existe una pequeña proporción de proteínas en las vesículas, pero reiteramos, que esta proporción es bajísima sólo ya que su punto más alto fue de 0.037 mM aprox (desestimamos el valor de la fracción 17, situación que explicaremos en la discusión). A partir de la fracción número 21 vuelven a desaparecer, para luego encontrarse nuevamente entre las fracciones número 27 y 38, porción que debe corresponder a la de micelas, alcanzando su mayor peak en la número 31 (0.514mM), misma fracción que obtuvo el peak de fosfolípidos, aunque la proporción entre éstos y proteínas es muy desigual: 6:1(utilizando las concentraciones obtenidas en este punto). De todas formas podemos observar que existe una mayor concentración de proteínas en la porción correspondiente micelas que a la de vesículas, a partir de lo cual concluimos que existe algún tipo de asociación entre proteínas y micelas. DISCUSIÓN Los valores obtenidos en éste práctico fueron acordes a los esperados, sin embargo debemos considerar, un factor para nada despreciable; el error humano. A pesar de que en un principio este proceso fue automatizado gracias al fraccionador, la adición de reactivos fue totalmente responsabilidad nuestra, por lo que pudimos observar algunos errores en las mediciones, que revelan tal factor. Específicamente se observa en la fracción 17 de proteínas, una elevadísima concentración de éstas, en comparación a las fracciones contiguas a ésta (16 y 18) y dado esto decidimos desestimar dicho valor, pudiéndose deber tanto al error humano como a algún tipo de problema con la cubeta utilizada. Así también obtuvimos dispares resultados en lo que a estándares se refiere, aunque se mantuvieron dentro de un margen racional. Sólo en el caso del estándar 4mM tuvimos que no considerar 2 valores ya que éstos arrojaron una absorbancia de 0.008, muy distante a los 0.667 y 0.746 de otro grupo. Dado esto es que al calcular algunos valores de concentraciones, utilizando la ecuación de la recta obtenida al graficar, es que se obtuvieron valores levemente negativos por lo que debimos aproximarlos a 0, situación que no alteró en absoluto los resultados que esperados. A pesar de todo lo anteriormente mencionado, los resultados fueron exitosos y a partir de ellos pudimos realizar un correcto análisis de concentraciones de fosfolípidos y proteínas.
Bibliografía Bibliografía
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Guía de laboratorio de bioquímica año 2009.
•
Libro del Curso de bioquímica.
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Libro Lehninger.
