Fcm

流式细 胞术简 介 中心实验室

陈家梁

流式细胞术发展史 • 1953 年 Croslannd-Taylor 应用分层鞘 流原 理，成 功设计红 细胞光学自 动计数器 • 1969 年 Van Dilla 及其同事在 Los Alamos, NM 发明第一台 荧光检测细 胞计 • 1972 年 Herzenberg 研制出 细胞分选器 • 1975 年 Kohler 等提 出单克隆抗 体技术，为 细胞研 究提供大 量的特异免 疫试剂 • 大量厂 家不断生 产流式细胞 仪

流式细胞仪 主要厂家

– Beckton Dickinson(BD) 公司（美国 ） – BACKMAN COULTER 公司（ 美国） – Partec 公司 （德国）

BD FACSCalibur

BD FACSCanto Ⅱ

BACKMAN COULTER EPICS-XL-MCL

Partec

FCM 中常见英文缩写含义 • • • • • • • •

FACS ： Fluorescence activated cell sorter FCM ： Flow Cytometry FSC ： Forward Angle Light Scatter SSC ： Side Angle Light Scatter FITC ：异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocyanate ） 488nm PI ：碘化丙锭 (propidium iodide ， ) 488nm PE ：藻红蛋白 (phycoerythrin) 488nm APC ：别藻 蓝蛋白（ allophycocyanin ） 633nm

流式细胞仪的特点 单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快： 10000 个细胞 ( 微粒 )/ 秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情 况 分选感兴趣的细胞或微粒

 流式细胞术是一 种可以快速 、准确、客 观 ，并且同时检测 单个微粒（ 通常是细胞 ） 的多项特性的技 术，同时可 以对特定群 体 加以分选  研究对象为生物 颗粒，如各 种细胞、染 色 体、微生物、及 人工合成微 球等  研究的微粒特性 包括多种物 理及生物学 特 征，并加以定量

流式细胞仪系统 • 通过流 式细胞仪 我们可以得 到以下信息 - 相对细胞大小 - 相对细 胞颗粒密度 和内部复杂度 - 染色过 细胞的相对 荧光强度

FCM 的检测范围 细胞结构

细胞功能

细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA 含量与细胞周 期 RNA 含量 蛋白质含量

细胞表面 / 胞浆 / 核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体

在上述 信号基础上 的细胞分选

流式细胞仪构造

• 流式细胞仪 (Flow Cytometer ， FCM) 的结 构分五部分： – – – – –

流动室 及液流 驱动 系统 激光光 源及光 束成 形系统 光学系 统 信号检 测与存 贮、 显示、 分析 系统 细胞分 选及浓 缩系 统

流式细胞仪构造模式图

流动室与液流驱动系统 • 流动室 是仪器 核心 部件， 被测 样品在 此与 激光相 交。 • 流动室 由石英 玻璃 制成， 中央 有一长 方形 小孔， 供单个 细胞通 过。 • 流动室 内充满 了鞘 液，其 作用 是将样 品环 形包绕 。 • 鞘液流 速稳定 ，样 品流在 鞘流 的环包 下形 成流体 动力学 聚焦，从而 得到准 确的 细胞荧 光信 息。 • 流动室 上装有 压电 晶体， 受到 振荡信 号可 发生振 动。

流动室与液流驱动系统

Injector Tip

Fluorescence signals Focused laser beam

Sheath fluid

样本的流速 Optical Cuvette

Low Sample Flow Rate 12 µL/min

60 µL/min

Laminar Flow

Laminar Flow

Sheat Sheath Sampl h e

High Sample Flow Rate

Sheath

Sheath Sampl e

激光光源及光束成形系统 • 目前台 式机 FCM ，大多采用氩 离子气体 激 光器。 • 激光光 束在到达 流动室前， 先经过透镜 聚 焦，形 成约 22×66μm 的光斑，这 样激光能 量较强 ，以激发 荧光染料。 • 台式机 的整个光 路是封闭的 ，在安装时 由 工程师 调试完毕 后，无需用 户作任何调 节 ，使用 十分方便 。

光学系统 • FCM 的光学 系统由若干 组透镜、滤光 片和 小孔组 成，它们 将不同波长 的荧光信号 分 别送入 到不同的 电子测控器 。 • 主要光 学原件： 滤光片 (Filter) – 长通滤 片 – 短通滤 片 – 带通滤 片

Long Pass Filter, LP Short Pass Filter, SP Band Pass Filter, BP

滤光片 Longpass 460 500 540 Bandpass

LP 500

Shortpass 460

500

SP 500

540

460

500

540

BP500/50

信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物 ，通过激 光照射时，产生代表细胞内不同物质 、不同波长的荧光信号，这些信号以 细胞为中心，向空间 360 度立体 角发 射，产生 散射光 和荧光信号。

散射光信号 • 散射光 信号不依 赖任何样品 的制备技术 （ 如染色 ），因此 称为细胞的 物理参数。 – 前向散 射角 (Forward Scatter ， FSC) ：与细 胞 的大小 有关， 在 FCM 应用 中，常 取 FSC 作阈 值，来 排除样 品中 的各种 碎片 。 – 侧向散 射角 (Side Scatter ， SSC) ：与激光 束正 交 90 度的散射 光信 号，与 细胞 粒度及 复杂 程度 正相关 。

• 散射光 信号波长 与激光相同 。

散射光信号示意图 Right Angle Light Detector α Cell Complexity

Incident Light Source

Forward Light Detector α Cell Surface Area

前向角散射光 —— FSC Forward Angle Light Scatter

Laser FALS Sensor

侧向角散射光—— SSC Side Angle Light Scatter Laser FALS Sensor

90LS Sensor

荧光信号 • 一种是 细胞自身在激光照射下发出微 弱的荧光信号，称 自发荧光。 • 一种 是经过特异荧光素标记后 ，受激 发光照射得到的荧光信号，通过对这 类荧光信号的检测和定量就能了解所 研究细胞参数的存在与定量。

荧光信号 荧光素 吸收激光 能量 荧光素 将吸收能 量释放，转 换为  振动能 和热能  释放较 入射光 波长 更长的 光量 子

荧光素 与特异抗 体结合 荧光抗 体与细胞 抗原结合越 多，产生的 荧 光信号越强

常用荧光染料 • 目前台 式机 FCM 配置 ： – 488nm 激光 管常用 染料 有 • PI (Propidium Iodide) • PE (Phycorey- thrin) • FITC (Fluorescein Isothiocyanate) • PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) • PE-CY5 等 – 633nm 激光 管常用 染料 有 • APC • APC-Cy

荧光信号示意图 以激 发光 光源波 长 488nm 为例 示意 图：

荧光检测器

Freq

FALS Sensor

Fluorescence

Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)

荧光信号的线性测量与对数测量 当携带荧光素的细胞与激光正交 时，受激发发出荧光，经过滤光片分离 不同波长的光信号分别到达不同的光电 倍增管 (PMT) ， PMT 将光信号转换成 电信号。电信号输入到放大器放大，放 大器分两类：线性放大和对数放大。

细胞 DNA 含量、 RNA 含量、总蛋白质含量 等的测量一般选用线性放大测量。 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面 抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。 如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将 细胞阳性群、阴性群同时显示出来通常使用对 数放大器，如果原来输出是 1 ，当输入增大到 原来的 10 倍时，输出为 2 ；当输入增大到原 来的 100 倍时，输出为 3 等。

荧光信号的面积和宽度 • 所谓荧光信号的 面积是采用 对荧光光通 量 进行积分测量， 一般对 DNA 含量测量时 ， 均采用面积 (FL2 － A) 来计算。这是因 为 荧光脉冲的面积 比荧光脉冲 的高度更能 准 确反映 DNA 的含量。 • 荧光信号的宽度 ( 如 FL2 － W) 常用来 区分 双联体细胞

光路图

Optics Laser

Fluorochrom es

488 nm

FITC

635 nm

Detector Parameter

Filter

GFP

FL1

530/30

PE

PI

FL2

585/42

PerCP

PerCP-CY5.5 FL3

670LP

FL4

661/16

APC

FCM 测量数据的存贮、显示和分析 • 目前 FCM 所采用的都 是多参数 指标，荧光 参数标 记物最多 可达 4 个，数 据的存贮采 用列表 排队方式 ，可节省存 贮空间。 • 数据文 件为二进 制文件，缺 乏直观性， 数 据的显 示常用以 下几种方式 ： – – – – –

直方图 散点图 等高线 图 密度图 三维图

SSC FL2

FSC

FL1 FL4

Data Processing

FL3

直方图 • 直方图 (Distribution Histogram) – 横坐标 代表荧 光信 号或散 射光 信号相 对强 度 ，单位 是道数 ，可 以是线 性或 对数坐 标。 – 纵坐标 一般是 细胞 数。

散点图 • 散点图 (Dot Plot) – X 坐标为 该细胞 一参 数相对 含量 ， Y 坐标 为 该细胞 另一参 数的 含量， 可以 将细胞 亚群 分 开。

等高线图和密度图

三维图

设门分析 可以通过设 “门” (Gate) ，分析、 分选感兴趣的 细胞。

FCM 的分辨率 • 分辨率是衡量 FCM 测量精度的 指标， 通常用变异系数 CV 表示。 • 一般要求 CV<8 ，最好 CV<3 。

基 本 操 作

样本处理 细胞悬液的制备 : • 细胞悬 液： – 分离 PBMC 、 PRP 等：操 作复杂， 分离、离心步 骤导致细胞 特定群体丢 失，并可能 引入某些误 差 – 直接使用外 周血、骨髓 ：最接近生 理状况，操 作简便， 样本用 血量小 – 灌洗液、体 腔积液 – 培养细胞、 细胞系

• 实体组 织： – 病理组织： 新鲜样本 / 石蜡包埋样本 – 针吸组织： 新鲜样本

• 鞘液、 洗液 等：清 洁无 颗粒 杂质

步骤一： 选择合适的荧光染料 • 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激 发 • 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合 适范围内 • 荧光素光谱的重叠应当尽量减少

步骤二：

• • • •

体积 温度 孵育时间 对照

染色

步骤三： • • • •

数据收集和分析

画图 寻找目标细胞 调整仪器设置到合适的状态 我们可以得到怎样的结果？它们意味着 什么？

仪器设置调 节 1. 用未染色细 胞调整仪器 PMT 电压 2. 用单染色的 细胞调节仪 器补 偿

关于同型对照 例：一个双色染色的实验 抗体 A FITC ，抗体 B PE 对应的同型对照是 IgG1 FITC,IgG1 PE 那么需要准备的是 阴性对照：细胞加上 IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照： FITC: 细胞加上 Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上 Ab B PE, IgG1 FITC

光谱重叠 的校正

受激光照射后 FITC 和 PE 分子发射光谱互相干扰图

光谱重叠 的校正

光谱重叠 的校正

光谱重叠 的校正 阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器 合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实际为没 有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋 白。由于化学键、生物键及分子之间的吸引作用， 这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上 可检出一定的信号。当荧光特异性抗体与标本结合 时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对 照的信号），和特异性结合信号。所以我们只认为 大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号 并将其归入统计范围。

光谱重叠的校 正 如进行 FITC 、 PE 双 色分析，先准备该试剂的 阴性对照管

A ： IgGFITC/IgGPE ，通 过调节电压，使阴性群 体落在 FTIC 及 PE 双 阴性区。（注：在进行 调补偿时，必须将原补 偿全部归零） PE 和 FITC 分子的阴性对照

光谱重叠 的校正 B ： FITC 标记抗体 /IgG-PE

未调补偿的双参数直方图

光谱重叠 的校正

FITC 荧光信号补偿的调节

补偿模 型图

FL2

补偿 调节前 后对 比

FL1

数据分析 • • • •

设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光 值，绝对数或抗体结合数

应

用

流式应 用常见范 围 • • • • • •

细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子： CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子： P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡

FCM 的临床应用 • • • • • • • • •

HIV 免疫分 型， CD4 绝对 计数 白血病 和淋巴 瘤的 免疫分 型 肿瘤的 细胞周 期和 倍体分 析 网织红 细胞计 数 细胞移 植的交 叉配 型和免 疫状 态监测 干细胞 计数 残量白 血病细 胞检 查 HLA-B27 检查 血小板 功能及 相关 疾病

FCM 的科研应用 • • • • • •

树突细 胞研究 干细胞 研究 癌症病 人的多药 耐药性 细胞动 力学功能 研究 环境微 生物分析 流式细 胞术与分 子生物学研 究

FCM 的应用——免疫学 • 淋巴细 胞免疫分 型 – 淋巴细 胞亚群 分析 – CD4 绝对 计数

• HIV 的诊断与研 究 – 淋巴细 胞 CD4/CD8 分析 – CD4 绝对 计数 – T 细胞 活化

• 细胞移 植的交叉 配型和免疫 状态监测

FCM 的免疫学应用 • 免疫功 能和免疫 调控的研究 – 淋巴细 胞和单 核细 胞的活 化 – 细胞因 子的研 究 – 淋巴细 胞的增 殖 – 树突状 细胞的 研究

• HLA-B27 检测

淋巴细胞亚群分析 • 使用特 异的单克 同时分 析淋巴细 以将淋 巴细胞亚 • 各淋巴 细胞亚群 • 淋巴细 胞亚群的

隆抗体，进 行多色分析 ， 胞上多种抗 原的表达， 可 群区分开， 进行定量分 析 的百分含 量 绝对计数

FCM 应用之淋巴细 胞亚群分析 淋巴细胞亚群检测： T cells, T subsets, NK cells, B cells

淋巴细胞亚群分析 • 根据功 能，淋巴 细胞主要分 为 – B 淋巴细胞 （ CD19+ ）， 与体液 免疫 有关 – T 淋巴 细胞（ CD3+ ），与 细胞免 疫有 关 • 总 T 和总 B 可以用 来判断 某些 免疫缺 陷和 自身 免疫 性疾病

– NK 细胞 （ CD3- CD16+ 56+ ）， 行使免 疫监 控 功能， 能够介 导对 某些肿 瘤细 胞和病 毒感 染细 胞的细 胞毒性 作用 。

FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析 T 淋巴细胞 (CD3+) CD3+CD4+

名

称

功

能

辅助性 / 诱导 性 T 细胞 (Th/Ti) 辅助性 T 细胞 (Th) 诱导性 T 细胞 (Ti)

辅助 和诱导细胞 免疫和体液 免疫

抑制性 / 杀伤 性 T 细胞 (Ts/Tc) 抑制性 T 细胞 (Ts) 杀伤性 T 细胞 (Tc)

抑制 免疫反应 / 杀伤 异源细胞

CD3+CD4+CD8+

活化的 T 细胞

在 T 细胞恶性增生 时升高

CD3+CD4-CD8-

有调节功 能的 T 细胞 , 其表达

CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29CD3+CD8+ CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-

辅助 细胞免疫和 体液免疫 诱导 细胞免疫和 体液免疫 抑制 细胞和体液 免疫 细胞 毒性 T 细胞 /δ T 细胞受体 (TCR γ/δ )

CD4+/CD8+ 比值 CD45RA+CD45RO-

幼稚的 / 静止 的 T 淋巴 细胞

当免 疫系统没有 能力更新辅 助性 或抑 制性 / 细胞毒 性淋巴细胞 的 祖细 胞时此细胞 亚群较低

CD45RA-CD45RO+

记忆性 T 淋巴细胞

病菌 感染时升高 , 但在 慢性病毒 感染 , 如 HIV 患者 中降低

CD45RA+CD45RO+

活化的 T 细胞 , 感染时升 高

感染 时升高

FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析 活化 T 淋巴细胞

名

称

CD3+HLA-DR+

活化 T 细胞

CD4+HLA-DR+

活化的 辅助性 / 诱导性 T 细 胞 活化的 抑制性 / 杀伤性 T 细 胞 活化的 辅助性 / 诱导性 T 细 胞

CD8+HLA-DR+ CD4+CD25+ CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+

功

能

活化的 抑制性 / 杀伤性 T 细 胞

在病 毒感染的患 者中增加 ; 其增 加意 味着 HIV 患者的 预后较差

活化的 B 细胞

过敏 患者中升高

B 淋巴细胞 (19+) CD19+CD23+ CD19+CD5+

在自 身免疫性疾 病中升高

CD19+CD5+CD23+

慢性 B 细胞白血 病及单克隆 B 淋 巴细 胞

NK 细胞 CD3+CD(16+56)+

自身 免疫性疾病 时降低 , 感染 时升高

CD3+CD57+

CMV( 巨细胞病 毒 ) 感染的强 烈征 兆

而病毒

FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析 疾

病

自身 免疫性疾病 系统性红 斑狼疮 类风湿性 关节炎 自身免疫 性溶血性 贫血 重症肌无 力 免疫 缺陷病 爱滋病 病毒 感染 传染性单 核细胞增 多症 慢性 活动性肝炎 活动 性肝硬化 肿瘤 消化道癌 , 肝癌 , 肺癌 再生 障碍性贫血 粒细 胞减少症

CD3

CD4

CD8

CD4/CD8

NK

FCM 应用之 淋巴细 胞亚群分 析

FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析 淋巴 细胞 亚群检 测意 义： 疾病机理研究

疾病辅助诊 断 治疗方案的确定及疗效评价 移植后免疫检测 CD25 高于正常值 5-10%, 表明即将或已发生排斥 CD4/CD8 比值下降提示并发凶险感染 <0.2 时 , 必须停用免疫抑制剂 CD2+HLA-DR+ 增加 5-10%, 且不伴有 CD25 的增 加, 提 示巨细胞病毒感染 疾病预防 慢性疲劳 , 感染后综合征 , 纤维肌痛 , 类风湿性关节炎 , 过敏等

FCM 应用之 HLA- B27 检测 HLA-B27 抗原是人类主要组织相容性复合体（ MHC ）的表达 产物，属Ⅰ型 MHC 基因。在免疫系统中主要负责细胞之间的相 互识别和诱导免疫反应 人

群

参

数

疾病相关

正常人(白人)

HLA-B27+

4-8%

正常人(黑人)

HLA-B27+

4-8%

HLA-B27+(所有种族)

有强直性脊柱炎

20%

HLA-B27+(所有种族)

无强直性脊柱炎

80%

强直性脊柱炎(白人)

HLA-B27+

85-95%

强直性脊柱炎(黑人)

HLA-B27+

57%

Reiteer综合征

HLA-B27+

79%

急性前葡萄膜炎

HLA-B27+

52%

FCM 应用之 HLA- B27 检测 正常人

患 者

FCM 的应用——血液病学 • 白血病和淋巴瘤免疫分型 • 残留白血病 • 造血干细胞计数 • PNH 诊断 • 网织红细胞分析 • 血小板分析

– 血小板膜糖蛋白分子的表达 – 血小板活化 – 网织血小板分析

FCM 应用之白血病免疫 分型分 析

FCM 应用之血小板 血小板 活化

活化血小板

静止血小板

FCM 应用之血小板 血小板 活化

相关病症 贮存血小板 心肺分流术(CPB) 冠状血管形成术 肾透析

流式全血法

血小板聚集仪

样本处理

抗凝全血

人为活化

最低

PRP(富血小板血浆) 强烈(经离心,洗涤)

样本量

低至2uL

10mL

灵敏度

<5%

不高

检测指标 CD62

临床意义 与输注血小板恢复负相关

Cd62p, CD63

生物相容性

Cd62p, CD63

监测和预后

血小板- 白细胞聚集

较血小板活化敏感

不稳定心绞痛 急性心肌梗塞 中风 脑血管局部缺血 糖尿病 产前痉挛子痫症 心肺分流术(CPB) 急性冠状动脉综合征

FCM 应用之血小板 网织血 小 板

ITP( 特发性血小板减少症 ) 骨髓移植 化疗 鉴别诊断

FCM 应用之血小板 血小 板计数 新标 准 ( 间接双 平台 法) ( 国际血液学标准化委员会 (ICSH)/ 国际实验血液学协会 (ISLH) 2001) R = 红细胞数 / 血小板数 ( 流式细胞术 ) 血小板 数 = 红细胞数 ( 血球仪 )/R 灵敏度高 (1- 400x109/L) ， 重复性好，室内 / 室外变异系数均很小 尤其应用于血小板预输注病人的检测 ( 阈值 :20x109/L)

FCM 应用之凋亡检 测 • 细胞凋 亡与细胞 坏死是两个 不同的过程 • 细胞凋 亡的主要 检查手段 – 形态学 检测 – Ladders 实验 – 流式细 胞术检 测

• 与凋亡 相关的病 理过程 – HIV – 自身免 疫性疾 病 – 肿瘤

FCM 应用之凋亡检 测 • 细胞凋亡的主要 指标 – 细胞内 酶改变 ： Caspase-3 活化 – 细胞膜 不对称 性改 变，磷 脂酰 丝氨酸 外翻 ，但 仍然保 持膜的 完整 性： Annexin V/PI – 细胞核 DNA 的断 裂改变 ： TUNNEL 实验 （ APO-BRDU ， APO-DIRECT ）

• 凋亡相关蛋白： – Fas – Bcl-2

细胞凋亡— PI 分析 调亡细 胞

Events

正常 G0/G1 期细胞

PI - Fluorescence

细胞凋亡— Active Caspases-3 Caspases-3 又称半胱氨酸 蛋白酶 3 ，是细胞凋亡信号 传导通路中的 ICE 蛋白酶家 族的重要成员，在细胞凋亡 发生的早期被激活。 ICE 家 族主要通过 Caspase 8 和 caspase 10 启动的两种途径 来引起细胞凋亡的发生 , 两 种反应都要经过 caspase 3 而向下逐级级联。因此，临 床常用 caspase 3 来检测早 早期的细胞凋亡。

细胞凋亡— Annexin V 在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷 脂酰丝氨酸（ PS ）迁移到细胞外层表面。 Annexin V 是一种对 Ca2+ 依赖，对 PS 有高度亲和力的磷脂结合蛋 白，可作为探针识别细胞膜表面是否有 PS ，从而识别凋 亡细胞。由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝 氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞 坏死在其初期。

细胞凋亡— TUNEL 法 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记法（ TdT mediated X-dUP nick ending end labeling,TUNEL ） 细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链 DNA 会出现许多 不对称的断裂点，即产生一系列 3'-OH 的末端。外源性荧光 标记的脱氧核苷酸末端转移酶（ terminal deoxynucleotidyl tranferase,TdT ）能够催化外源性荧光素或酶标记的 dUTP 连接到 DNA 的 3'-OH 末端，用流式细胞术检测

FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析 细胞增殖周期：分为 G0 、 G1 、 S 、 G2 、 M 期。 S 期 是 DNA 合成期，在 S 期内， DNA 进行复制，使细胞的 DNA 含量由 2 倍体（ 2C 46 条染色体）变为 4 倍体（ 4C ）。 G1 和 G2 期为 DNA 合成前、后间期，此期无 DNA 的合成，但 RNA 和蛋白质进行合成。 M 期为有丝分裂期，在此期一个细 胞分裂为 2 个细胞。细胞内的 92 条染色体分裂成 2 组 46 条 染色体，使每个细胞内具有 46 条染色体。在 M 期分裂成两 个子细胞之前， G2 和 M 期细胞的 DNA 含量均为恒定的 4C 。 M 期以后部分细胞进入 G1 期，继续进行增殖，部分细 胞进入 G0 期，即静止期，不再继续增殖。因此， FCM 分析 一个群体细胞峰 DNA 倍体与细胞周期时，将 DNA 含量直方 图分为三部分，即 G0/G1,S,G2/M 期三个细胞峰。 G0/G1 和 G2/M 细胞峰 DNA 的含量成正态分布， S 期细胞峰则是一个 加宽的正态分布。

FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析

利用 DNA 的荧光染料，如 PI （ Propidium iodide 碘化丙啶），与细胞内的 DNA 结合， 可反映细胞内 DNA 含量。采用 DNA 直方图 显示。具有 2C DNA 含量细胞为 G0/G1 期细 胞， 4C DNA 含量细胞为 G2/M 期细胞， DNA 含量介于两者之间的细胞为 S 期细胞。

FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析 DNA 倍体：主要比较 G0/G1 期细胞 DNA 含量的变 化。用 DNA 指数（ DI ）表示。 DNA 指数 = 测量样本 G0/G1 期 DNA 含量 / 正常人 淋巴细胞 G0/G1 期 DNA 含量 以正常人淋巴细胞作为对照。 正常细胞 DNA 指数为 1.00 ， DNA 指数＞ 1 ，为 超 2 倍体，＜ 1 为亚 2 倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中 出现频率较高。

FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析

G2

M

G0

G1 细胞周期

DNA 分析

G0G1

s 细 胞 数 量

s 0

200

400

2N

600

G2M 800

4N

1000

正常人骨髓细胞 DNA 分析 (ModiFIT)

多发性骨髓瘤

DNA 分析的临床意义 • DNA 分析诊断肿 瘤

– DNA 非整倍体细胞峰 – 突出的四倍体细胞峰 – SPF>15%

• DNA 倍体分析： 结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进 行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一 些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸 物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为 重要。

• 增殖状态分析：

FCM 的应用——分子生物学 • 分选细 胞后进 行 FISH • 分选细 胞后进 行 PCR • 流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光 原位杂交（ PCR-FISH ）结合测定血液 CD4 ＋细胞中 HIV 特异的 DNA 或 RNA • 流式荧光原位杂交（ Flow-FISH ）测定染 色体端粒长度

流式微球分析 Cytometric Bead Array （ CBA ）

流式微球分析 Cytometric Bead Array （ CBA ） CBA 与 ELISA 相比优 点 “ 多 元 ”和 “同 步 ” 检测 样本量少 灵敏度相