Ebc 1dec 1510 Estruturasa Modulacao

Engenharia Biomolecular e Celular Estruturas Artificiais para Modulação de Orgãos in vitro Lisboa, 3 Dezembro 2009 Ana Sabino Filipe Condessa

Outline 

Motivação

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Modulação de Orgãos in vitro

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Engenharia de Tecidos (I) – Scaffolding

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Engenharia de Tecidos (II) – Entrega de Factores de Crescimento

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Case Study 

Tecido Hepático

Motivação “Tissue engineering is the exciting discipline of design and construction of spare parts for the human body to restore function based on biology and biomedical engineering. The basis of tissue engineering is the triad of signals for tissue induction, responding stem cells, and the scaffolding of extracellular matrix.” A. Hari Reddi - Growth Factors and Morphogens: Signals for Tissue Engineering

Modulação de Tecidos • Sinais de regulação bioquímica – Factores de Crescimento • Densidade de cell seeding • Fonte das células • Template de regeneração Tissular • Miscibilidade • Transporte de Massa • Forças hidrodinâmicas • Tempo de cultura celular

Modulação de Tecidos e Engenharia de Tecidos • Factores Físicos (Mecânicos) – Propriedades Mecânicas das Estruturas • Flexibilidade dos Scaffolds • Porosidade dos Scaffolds • Taxa de Degradação dos Scaffolds

• Factores Bioquímicos – Factores de Crescimento (i.e.) • Entrega de Factores de Crescimento através de moléculas libertadas pelos Scaffolds

Engenharia de Tecidos A engenharia de tecidos emergiu por volta de 1990 numa tentativa de colmatar as limitações da transplantação de órgãos e da substituição por tecidos sintéticos.

Tem como foco o acoplamento de células a uma matriz biodegradável conhecida como scaffold.

Engenharia de Tecidos (I) -Scaffolding

Engenharia de Tecidos (I) -Scaffolding Taxa de absorção de alguns poliésteres:

Há que garantir que o tempo de biodegradação é compatível com o tempo de formação do tecido para que não aconteça a perda de suporte.

Libertação de fármacos (factores de crescimento , entre outros) O scaffold deve exibir biocompatibilidade e biodegradibilidade, porosidade adequada para a ancoragem e crescimento celular bem como facilidade na difusão de nutrientes e produtos metabólicos.

Engenharia de Tecidos (I) -Scaffolding O scaffold e as componentes bio-activas do mesmo têm que ser escolhidas mediantes o órgão alvo

Dependem do tipo de células

É necessário optimizar a interface entre as células e o scaffold para manter a funcionalidade e o comportamento celular e permitir a construção do tecido nas três dimensões.

Engenharia de Tecidos (I) -Scaffolding É necessário criar uma porosidade hierárquica ● ●

Nutrição Vascularização

●

Acomodação das células

●

Funções químicas e mecânica desejadas

Engenharia de Tecidos (I) -Scaffolding

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento • Regeneração Tissular - Tecnologia de Entrega de Factores de Crescimento (Review Biomaterials-based tissue engineering - Y.TABATA) Disease or operation

Growth Factor

Effect

Vascular Graft Surgery for heart

bFGF

Angiogenesis

Arteriosclerosis obliterans and buerger disease

bFGF

Angiogenesis

Diabetic skin ulcer

bFGF

Angiogenesis and dermatogenesis

Periodontal disease

bFGF

Regeneration of alveolar bone

Hardness of hearing

IGF-1

Inhibition of acoustic nerve ageing

Meniscus injury

PRP

Chondrogenesis

Facial plastic surgery

bFGF

Chondrogenesis, soft tissue regeneration

Chest plastic surgery

bFGF

Regeneration of the sternum bone, angiogenesis

Plastic surgery of soft tissues

bFGF

Angiogenesis

Facial nerve paralysis

bFGF

Nerve function recovery

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento 

Desenvolvimento de polímeros capazes de libertar substâncias de forma controlada 

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Facilitou a criação de scaffolds capazes de libertar factores de crescimento de forma controlada Permitiu o controlo de processos celulares por periodos prolongados através de uma libertação sustentada dos factores de crescimento directamente no ambiente celular

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento 

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Encapsulamento de factores de crescimento em matrizes de 

Colagénio

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Alginado

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Ácido Hialurónico

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Hidrogéis sintéticos

Tempo de meia vida muito superior ao de um factor de crescimento em solução

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento 

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Imobilização de factores de crescimento através de interacções com materiais contendo heparina Heparina 

Estabilização e imobilização do factor de crescimento por interacções electroestáticas −

Específicas (sequência)

−

Biomimetismo dos mecanismos naturais de protecção dos factores de crescimento na matriz extra-celular

−

Elevada eficácia de hidrogéis em que é efectuada uma co-encapsulação da heparina com os factores de crescimento

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento 

Heparina − −

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Possibilidade de modular a entrega recorrendo a hbp (heparine binding peptides) Possibilidade de modular as propriedades mecanicas de hidrogéis mediando a afinidade e cinética das ligações heparina - hbp

Imobilização de bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) em matriz de colagénio com heparina − −

Manutenção da bioactividade pela bFGF Promoção do crescimento de células endoteliais

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento 

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Incorporação covalente de hbp numa matriz de fibrina (recorrendo ao factor XIIIa) Incorporação da heparina e do factor de crescimento na matriz de fibrina Libertação passiva do factor de crescimento associado à heparina minimizada pela ligação heparina – hpb (covalentemente ligada à fibirina)

Possibilidade de modular a degradação celular da matriz de fibrina ao factor de ligação através do rácio Factor de Crescimento:Heparina:hbp 

Superior a apenas libertação por difusão passiva

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento 

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Libertação de factores de crescimento controlada por: 

Dimensão dos poros (hidrogel)

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Carga de Heparina

É no entanto um Mecanismo Passivo

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento 

Estratégias para entrega localizada de factores de crescimento 

Imobilização de EGF (Epidermal Growth Factor) a uma superfície vítrea utilizando PEG linkers (Poly(Ethylene Glycol)) −

Manutenção da actividade face a EGF fisiologicamente absorvido (sem bioactividade) −

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Kuhl, P.R. and Griffith-Cima, L.G., Tethered epidermal growth factor as a paradigm for growth factor-induced stimulation from the solid phase, Nat. Med. 2, 1022–7, 1996.

Incorporação de TGF-β1 (Transforming Growth Factor) em hidrogéis contendo PEG −

Aumento da produção da Matriz Extra Celular por parte de células musculares lisas no gel. −

Mann, B.K., Schmedlen, R.H., and West, J.L., Tethered-TGF-beta increases extracellular matrix production of vascular smooth muscle cells, Biomaterials 22, 439– 44, 2001a.

PEG

Engenharia de Tecidos (II) - Entrega de Factores de Crescimento A. Hari Reddi - Growth Factors and Morphogens: Signals for Tissue Engineering 

Tissue Engineering – John P. Fisher

Case Study - Tecido Hepático

• Funções

– Regulação Metabólica – Função Hematológica – Produção de Bílis

Condições que potenciam o transplante de hepatócitos

Case Study - Tecido Hepático Development of hepatic tissue engineering (Fiegel et al, 2009) Usar culturas celulares ao invés de transplantes de fígado permite:

(1) que exista expansão celular durante a fase in vitro

(2) a manipulação genética ou imunológica das células a transplantar (3) tissue typing e criopreservar as células a transplantar num banco de células [10, 11].

Case Study - Tecido Hepático Processo Isolam-se os hepatócitos e semeiam-se numa matriz extra-celular que tenha presente factores de crescimento (como o bFGF) que garante uma diferenciação suficiente dos hepatócitos Esta cultura celular numa matriz 3D permite que seja colocada num bioreactor de fluxo que vai aumentar a funcionalidade e sobrevivência celular Estes hepatócitos são fácilmente transplantado para o ratinho Neste procedimento podem ser transplantadas células equivalentes a um órgão inteiro

Case Study - Tecido Hepático Desenvolvimento da vascularização É vital para o sucesso do transplante de hepatócitos que ocorra vascularização inicial.

Modelo AV-loop (AVL)

Estratégia de vascularização microcirurgica do scaffold (já contendo os hepatócitos) em que este permanece numa câmara subcutânea na zona fémural durante apróximadamente 14 dias e depois é retirado. É usada uma matriz de fibrina que permite o crescimento rápido de vasos sanguíneos desde o AVL e suporta o enxerto dos hepatócitos

Case Study - Tecido Hepático Vinci et al, 2009 Adaptação geométrica a várias escalas

Materiais passíveis de serem utilizados Colagénio,

•

Esponjas de Loofah em condições celulares •

Hidrogéis

•

Case Study - Tecido Hepático Conclusões

O transplante de hepatócitos é cada vez mais uma alternativa a estudar e considerar. O estudos aprofundado do meio necessário à óptima funcionalidade dos hepatócitos e o avanço ao nível dos biomaterias permite uma melhor interface scaffold/hepatócitos o que contribui para o aumento do sucesso desta prática.

Case Study - Tecido Hepático Fiegel et al, 2009

Case Study - Tecido Hepático Vinci et al, 2009

Case Study - Tecido Hepático (Oh et al., 2000)