Dna Electrophoresis Protocol (in Thai)

Medical Biotechnology Laboratory Manual

1

2552 / 2

บทปฏิบัติการที่ 5

DNA Electrophoresis for the Detection of PCR Products and Plasmids. ผศ. ดร. สมชาย แสงอำานาจเดช วัตถุประสงค์ เพ่ ือให้นส ิ ิตสามารถวิเคราะห์ดีเอ็นเอจาก PCR และพลาสมิดโดยวิธีอีเล็กโตรโฟรีซิส หลักการ

อีเล็กโตรโฟรีซิส อีเล็กโตรโฟรีซิสหมายถึงการเคล่ ือนท่ีของอนุภาคท่ีมีประจุในสนามไฟฟ้ า ชีวโมเลกุลส่วน

มากไม่ว่าจะเป็ น กรดอะมิโน เปปไทด์ โปรตีน นิวคลีโอไทด์ และกรดนิวคลิอิก ต่างมีประจุเม่ ืออยู่ ในสารละลายท่ีมีสภาพความเป็ นกรดด่างต่างๆ ดังน้น ั เม่ ืออยู่ในสนามไฟฟ้ าจะเคล่ ือนท่ีไปยังข้ัว

บวกหรือลบแล้วแต่ประจุสุทธิ การทำาอีเล็กโตรโฟรีซิสสามารถทำาในแนวดิ่ง (vertical) หรือแนว ระนาบ (horizontal) ในแนวดิ่งนิยมใช้กับเจลโพลีอะคริลาไมด์ในการแยกโปรตีน การทำาอีเล็ก โตรโฟรีซิสของโปรตีนอาจใช้วิธต ี ่างๆเช่น SDS-PAGE, 2-D PAGE, Native gels, Gradient

gels, Isoelectric focusing gels, Cellulose acetate electrophoresis, หรือ Continuous

flow electrophoresis ก็ได้แล้วแต่วัตถุประสงค์ของการแยก ส่วนวิธีอีเล็กโตรโฟรีซิสในการแยก กรดนิวคลิอิกจะขึ้นกับชนิดว่าเป็ นอาร์เอ็นเอหรือดีเอ็นเอ การทำาอีเล็กโตรโฟรีซิสสำาหรับอาร์เอ็นเอ เพ่ ือดูปริมาณและความบริสุทธิข ์ องอาร์เอ็นเอหลังการเตรียมอาจใช้อะกาโรส 2 % เวลา 1 ช่ัวโมง

กรณีท่ีเป็ นดีเอ็นเอมีวิธีการต่างกันขึ้นกับขนาดของดีเอ็นเอ สำาหรับงานส่วนมากจะใช้อะกาโรส ถ้า

เป็ นขนาดเล็กเช่นการหาลำาดับเบสจะใช้เจลเตรียมจากอะคริลาไมด์ ถ้าเป็ นดีเอ็นเอขนาดใหญ่มาก หรือท้ง ั ยีโนมอาจใช้ PFGE (pulsed-field gel electrophoresis), OFAGE (orthogonal field alternating gel electrophoresis), FIGE (field inversion gel electrophoresis), TAFE (transverse alternating field gel electrophoresis), CHEF (contour-clamped homogeneous electric field electrophoresis หรือ RFE (rotating field

electrophoresis) สำาหรับในบทปฏิบัตก ิ ารน้ีจะได้ศึกษาการแยกของดีเอ็นเอท่ีใช้มากในการตรวจ ดูขนาดดีเอ็นเอของ PCR และพลาสมิด

ถ้าโมเลกุลของสารท่ีจะแยกมีประจุ q คูลอมบ์ (coulombs) ในสนามไฟฟ้ า E (potential

gradient) ซึ่ง E เท่ากับ ความต่างศักย์ไฟฟ้ าหารด้วยระยะห่างระหว่างข้ัวไฟฟ้ า โมเลกุลจะเคล่ ือน ไปท่ีข้ัวอิเล็กโทรดด้วยแรง Eq นิวตันส์ (newtons) ในการเคล่ ือนท่ีจะมีแรงเสียดทานซึ่งขึ้นกับ

ขนาดของโมเลกุล รูปร่าง ขนาดรูในตัวกลาง และความหนืดของบัฟเฟอร์ ถ้าแรงเสียดทานมีค่า

Medical Biotechnology Laboratory Manual

2

2552 / 2

สัมประสิทธิ ์ (frictional coefficient) เท่ากับ f ความเร็วของการเคล่ ือนท่ีของโมเลกุลน้ีจะเท่ากับ v= Eq/f แต่โดยปรกติมักนิยมใช้ค่า electrophoretic mobility (µ) ซึ่งเท่ากับอัตราส่วนของ

ความเร็วต่อความเข้มสนามไฟฟ้ า (v/E) ในการเปรียบเทียบโมเลกุลท่ีมค ี ่า µ ต่างกันจะเคล่ ือน

แยกออกจากกัน ส่วนโมเลกุลท่ีมีประจุคล้ายกันจะเคล่ ือนแยกจากกันเม่ ือมีขนาดโมเลกุลแตกต่าง กันท้ง ั น้ีเน่ ืองจากเกิดแรงเสียดทานต่างกัน ในการแยกชีวโมเลกุลด้วยอีเล็กโตรโฟรีซิสอาจใช้

ความแตกต่างของประจุ หรือบางวิธีใช้ความแตกต่างของขนาดโมเลกุล จะเห็นว่าโดยหลักการแล้ว ถ้าปล่อยให้โมเลกุลท่ีมีประจุเคล่ ือนท่ีไปยังข้ัวอีเล็กโทรดสมบูรณ์ก็จะเป็ นวิธีท่ีเรียกว่า อีเล็กโตรไล ซิส (Electrolysis) แต่ในวิธีอีเล็กโตรโฟรีซิสน้ีจะปิ ดสนามไฟฟ้ าก่อนท่ีโมเลกุลจะเคล่ ือนท่ีถง ึ ข้ัวอี เล็กโทรด จากน้ันจะหาตำาแหน่งโมเลกุลท่ีแยกโดยนำาตัวกลางไปย้อมสีหรือวางบนแผ่นฟิ ล์มใน กรณีท่ีติดฉลากสารกัมมันตภาพรังสี

กระแสไฟฟ้ า(I)ท่ีไหลระหว่างข้ัวอีเล็กโทรดส่วนใหญ่นำาโดยไอออนในสารละลาย ส่วนน้อย

เท่าน้ันท่ีนำาโดยโมเลกุลท่ีจะแยก และมีความสัมพันธ์กับความต้านทาน(R)และศักย์ไฟฟ้ า(V)ตา

มกฏของโอห์ม (I= V/R) ดังน้ันการเพิ่มศักย์ไฟฟ้ าจะเพิ่มกระแสไฟฟ้ าท่ีไหลและเร่งการแยกของ โมเลกุล ระยะทางท่ีโมเลกุลเคล่ ือนท่ีจะเป็ นสัดส่วนกับปริมาณกระแสไฟฟ้ าและเวลา อย่างไร

ก็ตามข้อจำากัดของการเพิ่มกระแสไฟฟ้ าคือระหว่างการทำาอีเล็กโตรโฟรีซิสจะเกิดกำาลัง (power) 2

ในตัวกลาง กำาลังมีหน่วยเป็ นวัตต์ (W) และมีค่าเท่ากับ W = I R ท่ีจะปล่อยออกมาในรูปของความ ร้อน ความร้อนท่ีเกิดขึ้นในตัวกลางมีผลต่อการแยกโดยอีเล็กโตรโฟรีซิสหลายประการคือ ทำาให้

อัตราการแพร่ของตัวอย่างและไอออนของบัฟเฟอร์เพิ่มขึ้นทำาให้ตว ั อย่างกระจายตัวมาก ทำาให้เกิด กระแสไฟฟ้ าจากการพา (convection currents) ทำาให้ตัวอย่างท่แ ี ยกผสมกัน ความร้อนท่ีเกิด

ขึ้นทำาให้โปรตีนเสียสภาพหรือสูญเสียฤทธิ ์ และลดความหนืดของบัฟเฟอร์ทำาให้ความต้านทานใน ตัวกลางลดลง อย่างไรก็ตามขณะท่ีใช้ศักย์ไฟฟ้ าคงท่ีกระแสไฟฟ้ าอาจเพิ่มขึ้นได้เน่ ืองจากความ

ต้านทานลดลงและทำาให้ความร้อนเพิ่มขึ้น วิธีท่ีจะแก้ไขการเปล่ียนแปลงความร้อนคือการใช้เคร่ ือง ควบคุมกำาลังไฟฟ้ า (stabilised power supply) การใช้ค่ากำาลังไฟฟ้ าต่ำมากๆ(กระแสไฟฟ้ า

ต่ำ)มีข้อดีคือไม่ทำาให้เกิดความร้อนมากแต่มักให้ผลการแยกได้ไม่ดีเน่ ืองจากเวลาท่ีใช้นานทำาให้ ตัวอย่างแพร่กระจายออก ดังน้น ั จึงต้องปรับกำาลังไฟฟ้ าให้พอเหมาะและเพิ่มระบบทำาให้เย็นเพ่ ือ

ช่วยปล่อยความร้อน ในบางกรณีอาจเกิดความแตกต่างของความร้อน (temperature gradient) ในเจลตัวกลางท่ีเกิดเน่ ืองจากความร้อนท่ีขอบเคล่ ือนออกดีกว่า ทำาให้ความร้อนบริเวณตรงกลาง เจลสูงกว่า เน่ ืองจากของเหลวท่ีอุ่นจะมีความหนืดน้อยกว่า ทำาให้ค่า µ ท่ีบริเวณตรงกลางเจลมา กกว่า (ค่า µ เพิ่มขึ้นประมาณ 2 เปอร์เซ็นต์เม่ ือความร้อนเพิ่มขึ้น 1 องศาเซลเซียส)

ปั จจัยท่ีมีผลต่อการแยกโดยวิธีอีเล็กโตรโฟรีซิสอีกอย่างคือ การเกิดอีเล็กโตรเอ็นดอสโมซิส

(electroendos-mosis) หรือเรียกว่าการไหลอีเล็กโตรออสโมติค (electroosmotic flow) ท่ีเกิด จากประจุท่ีผิวของสารท่ีเป็ นตัวกลาง เช่น กระดาษมีหมู่คาร์บอกซิล วุ้นอะกาโรส(ขึ้นกับเกรด

Medical Biotechnology Laboratory Manual

3

2552 / 2

ความบริสุทธิ ์)มีหมูซัลเฟต และในกรณีของแคปิ ลาร่ีอีเล็กโตรโฟรีซิสท่ีผิวของแก้วมีหมู่ซิลานอล

(Si-OH, silanol) ซึ่งท่ีค่า pH มากกว่า 3 หมู่ซิลานอลจะแตกเป็ นประจุลบ ดึงดูดไอออนประจุบวก มาจับเกิดเป็ นผิวสองช้ันของไฟฟ้ า (electrical double layer) เม่ ือให้ศก ั ย์ไฟฟ้ าเข้าไปไอออนท่ีมี ประจุบวกท่ีอยู่ใกล้ผนังแคปิ ลลาร่ีจะเคล่ ือนไปยังข้ัวลบ (คาโธด) พร้อมๆกับดึงสารละลายอีเล็ก

โตรไลต์ไปด้วย การไหลอีเล็กโตรออสโมซิสสุทธิจึงไปยังข้ัวคาโธด ผลของอีเล็กโตรเอ็นดอสโมซิส ทำาให้แถบตัวอย่างไม่ชัดเจน

ภาพที่ 1 ภาพซ้ายเป็ นทิศทางการเคล่ อ ื นท่ีของโมเลกุลท่ีแยกโดยอีเล็กโตรโฟรีซิส ลูกศรแสดงทิศทางการ เคล่ อ ื นท่ีของโมเลกุลไปทางขวา ภาพขวาแสดงให้เห็นผลของทิศทางการไหลของอีเล็กโตรออสโมซิส (หรืออีเล็กโตร เอ็นดอสโมซิส) ท่ีเกิดเน่ ืองจากประจุลบท่ีบนผิวแก้วหรือท่ีเป็ นตัวกลาง (gel matrix) จะดึงดูดไอออนของน้ำ (H3O ) +

และทำาให้น้ำถูกขนส่งในทิศทางตรงข้าม (ไปทางซ้าย) เป็ นผลให้เกิดแถบตัวอย่างท่ีกระจายออกไม่ชัดเจน

วุ้นอะกาโรส ตัวกลางทีใช้แยกในระยะแรกใช้กระดาษและแผ่นเซลลูโลสอะซีเตทเหมาะกับกรดอะมิโน

เปปไทด์ คาร์โบไฮเดรต และโมเลกุลเล็กๆแต่ให้ผลการแยกไม่ดีสำาหรับสารโมเลกุลใหญ่เช่น

โปรตีนและกรดนิวคลิอิก การเริ่มนำาเจลเข้ามาใช้ช่วยทำาให้วิธีวิเคราะห์สารโมเลกุลใหญ่ดีขึ้น เจล

ท่ีใช้ระยะแรกเป็ นเจลจากแป้ งต่อมานิยมใช้เจลจากอะกาโรสหรืออะคริลาไมด์ อะกาโรสใช้ในอีเล็ก โตรโฟรีซิสของโปรตีนและกรดนิวคลิอิก สำาหรับโปรตีนอาจใช้ความเข้มข้น 1 % ในเทคนิคเช่น

อิมมิวโนอีเล็กโตรโฟรีซิส (immunoelectrophoresis) หรือ ไอโซอีเล็กตริคโฟกัสซิ่ง (flat-bed isoelectric focusing) การทำาอีเล็กโตรโฟรีซิสสำาหรับตัวอย่างดีเอ็นเอส่วนมากใช้เจลอะกาโรส

เน่ ืองจากโมเลกุลดีเอ็นเอและชิ้นของดีเอ็นเอท่ีนำามาวิเคราะห์สว ่ นมากมีขนาดใหญ่กว่าโปรตีนมาก 6

ตัวอย่างเช่นพลาสมิด pBR322 ขนาด 4.36 kb มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 2.4x10 และชิน ้

ดีเอ็นเอท่ีได้จากการตัดด้วยเอ็นไซม์ขนาด 1 kb มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 620000 ขนาดท่ีใหญ่น้ี ทำาให้ไม่สามารถผ่านเข้าเจลอะคริลาไมด์ต้องใช้เจลอะกาโรสแทน ยกเว้นกรณีท่ต ี ้องการหาลำาดับ

เบสของดีเอ็นเอจะใช้เจลอะคริลาไมด์ความเข้มข้น 3.5 % สำาหรับแยกดีเอ็นเอขนาด 80-1000 nts

Medical Biotechnology Laboratory Manual

4

2552 / 2

(นิวคลีโอไทด์) , 12% สำาหรับขนาด 20-100 nts และใช้เจลความเข้มข้นไล่ระดับ (gradient gels) เช่น 3.5-7.5%

ภาพที่ 2 แสดงโครงสร้างเคมีของอะกาโรสและลักษณะท่ีจับกันเกิดเป็ นรูหลังจากเตรียมเป็ นเจล

อะกาโรสแยกได้จากวุ้นของสาหร่ายทะเลเป็ นโพลีแซคคาไรด์เชิงเส้นตรง น้ำหนักโมเลกุล สัมพัทธ์เฉล่ียประมาณ 12000 ประกอบด้วยอะกาโรไบโอสต่อๆกัน (อะกาโรไบโอสประกอบด้วย

กาแลคโตสจับกับแอนไฮโดรกาแลคโตส (3,6-anhydrogalactose) ความเข้มข้นท่ีใช้ขึ้นกับขนาด ของกรดนิวคลิอิกท่ีจะแยก หลังจากต้มจนใสแล้วเทขึ้นรูปเจลจะเกิดพันธะไฮโดรเจนท้ังภายในและ ระหว่างสายของอะกาโรส การเกิดพันธะข้ามไปมาในโครงสร้างทำาให้เจลมีคุณสมบัตต ิ ้านการพา

ความร้อนได้ดี เจลท่ีความเข้มข้นต่ำจะมีขนาดรูใหญ่ในขณะท่ค ี วามเข้มข้นสูงๆขนาดรูในเจลจะเล็ก

ในกรณีท่ีมีการแทนท่ีในน้ำตาลด้วยหมู่เคมีต่างๆ เช่น คาร์บอกซิล เมธอกซิล ไพรูเวต และท่ีสำาคัญ คือหมู่ซัลเฟตทำาให้เกิดผลเสียจากการเกิด electroendosmosis อะกาโรสท่ีจำาหน่ายมีเกรด

ความบริสุมธิแ ์ ตกต่างกันขึ้นกับปริมาณซัลเฟตถ้ามีปริมาณซัลเฟตน้อยกว่าจะมีความบริสุทธิส ์ ูง กว่า ในการใช้ในการวิเคราะห์น้ีจะต้องใช้เกรดสำาหรับงานอณูชีววิทยา

ข้อดีอีกประการของการใช้อะกาโรสคือมีอะกาโรสท่ีมีอุณหภูมิหลอมเหลวต่ำ (62-65 องศา

เซลเซียส) ทำาให้สามารถแยกดีเอ็นเอกลับคืนจากเจลได้อีกโดยการหลอมให้เป็ นของเหลวอีกคร้ัง การทำาอีเล็กโตรโฟรีซิสสำาหรับดีเอ็นจาก PCR และพลาสมิด

ดีเอ็นเอมีประจุจากหมู่ฟอสเฟตซึ่งทำาให้ดีเอ็นเอมีประจุต่อหน่วยความยาวเท่ากันและจะ เคล่ ือนไปยังข้ัวแอโนด ส่วนการแยกของโมเลกุลจะเกิดจากความต้านทานการเคล่ ือนท่ค ี ือโมเลกุล

ท่ีมีขนาดใหญ่จะเคล่ ือนผ่านไปได้ยากกว่าโมเลกุลขนาดเล็ก โมเลกุลท่ีมีขนาดใหญ่มากๆอาจติดอยู่ กับท่ีเคล่ ือนผ่านไปไม่ได้และโมเลกุลท่ีเล็กท่ีสุดจะเคล่ ือนได้เร็วท่ีสุด ดังน้ันเพ่ ือให้สามารถแยก

ดีเอ็นเอได้ดีจะต้องเลือกปริมาณความเข้มข้นของอะกาโรสท่ถ ี ูกต้องเพ่ ือท่ีจะเกิดรูในเจลท่ีเหมาะสม การใช้เจลท่ีมีอะกาโรส 0.3 % จะแยกดีเอ็นสายคู่ขนาด 5-60 kb ส่วน 2 % จะแยกดีเอ็นเอขนาด

0.1-3 kb สำาหรับเปอร์เซ็นต์ของอะกาโรสสำาหรับแยกดีเอ็นเอขนาดอ่ ืนๆแสดงในตาราง เน่ ืองจาก

Medical Biotechnology Laboratory Manual

5

2552 / 2

ในเจลอะกาโรสดีเอ็นเอจะแยกกันตามขนาดโมเลกุลขนาดของดีเอ็นเอจึงสามารถหาได้โดยการ เปรียบเทียบกับการแยกชิ้นของดีเอ็นเอมาตรฐานท่ีทราบขนาดแน่นอน (standard DNA marker) ไปด้วย ภาพที่ 3 เจลอะกาโรสวางในกล่องอีเล็กโตรโฟรีซิสโดยมีบัฟเฟอร์ท่วมประมาณ 1-2 มิลลิเมตร และ

ตำาแหน่งหลุมท่ีใส่ตัวอย่างอยู่ด้านข้ัวลบ

หลังจากเตรียมเจลท่ีมีความเข้มข้นของอะกาโรสท่ต ี ้องการแล้วจะนำาไปวางในกล่องอีเล็ก โตรโฟรีซิส (electrophoresis tank) เน่ ืองจากเจลจะวางจุ่มในบัฟเฟอร์ในแนวระนาบจึงอาจเรียก เจลน้ีว่า submarine หรือ submerged gels ตัวอย่างดีเอ็นเอจะผสมในบัฟเฟอร์สำาหรับหยอด

ตัวอย่าง (loading buffer) ซึ่งมีส่วนผสมของกลีเซอรอลท่ีทำาให้สารละลายตัวอย่างมีน้ำหนักและ ตกลงในหลุ่มในเจล และมีสีบรอมฟี นอลบูล (bromophenol blue) เพ่ ือให้เห็นแนวหน้าของการ เคล่ ือนท่ี ในเจลสำาหรับดีเอ็นเอน้ีไม่มีเจลช่วงแรกท่ีเรียก stacking gel ในการแยกโปรตีนใน

เจลอะคริลาไมด์ เน่ ืองจากตัวอย่างโมเลกุลดีเอ็นเอจะรวมกันเข้มข้นทันทีภายในไม่ก่ีนาทีเม่ ือให้ กระแสไฟฟ้ า สำาหรับเจลขนาดกว้าง 12 ซ.ม. ยาว 25 ซ.ม. จะใช้ศก ั ย์ไฟฟ้ า 1.5 โวลต์ต่อเซ็นติ

เมตร นานข้ามคืน ถ้าใช้เจลขนาดเล็ก (minigels) ความยาว 10 ซ.ม. จะได้การแยกของดีเอ็นเอ พอควรในเวลา 2-3 ช่ว ั โมง ภาพที่ 4 เจลอะกาโรสหลังจากหยอดตัวอย่างและทำาอีเล็กโตรโฟรีซิส จะเห็นแถบสีเคล่ อ ื นท่ี สีท่ี 1 เป็ นสีของ บรอมฟี นอลบูลเคล่ อ ื นในความเร็วเทียบกับดีเอ็นเอสายคู่ขนาดประมาณ 300 เบส ส่วนสีท่ีสองเป็ นสีของไซลีนไซยา นอลเทียบได้กับการเคล่ ือนท่ีของดีเอ็นเอประมาณ 4 กิโลเบส

Medical Biotechnology Laboratory Manual

6

2552 / 2

การย้อมส่วนมากใช้สารละลายเอธิเดียม โบรไมด์ (ethidium bromide) 0.5 μg /ml และ

ดูการเรืองแสงด้วยแสงอัลตราไวโอเลท ( λ เท่ากับ 300 nm) จะเห็นดีเอ็นเอเรืองแสงสีส้มแดง ดีเอ็นเอปริมาณเล็กน้อยเท่ากับ 10 นาโนกรัมจะเห็นเป็ นแถบขนาดกว้าง 1 เซ็นติเมตร ข้อควร

ระวังดีเอ็นเอท่ีถก ู แสงยูวน ี านจะทำาลายดีเอ็นเอโดยทำาให้ขาดและเกิดการจับคู่ (dimerisation) ถ้า ดีเอ็นเอจะต้องนำาไปใช้ต่อไม่ควรจะส่องด้วยแสงอัลตราไวโอเลทเป็ นเวลานาน ผู้ปฏิบัติในข้ันตอนน้ี

ต้องสวมหน้ากากป้ องกันตาจากแสงยูวี และสวมถุงมือในการจับเจลเน่ ืองจากเอธิเดียมโบรไมด์เป็ น สารก่อมะเร็ง

ตารางที่ 1 เปอร์เซ็นต์ของอะกาโรสท่ีเหมาะสำาหรับแยกชิ้นดีเอ็นเอขนาดต่างๆ

อะกาโรส (%)

ปริมาณอะกาโรส (gm.) สำาหรับปริมาตร 50 มล.

ขนาดของดีเอ็นเอท่ีแยกได้ดี (kb)

0.7

0.35

1 - 12

0.8

0.4

0.5 - 5

1.0

0.5

0.2 - 2

1.2

0.6

0.1 - 1

วัสดุ อุปกรณ์ 1. ถาดพลาสติกสำาหรับหล่อเจลอะกาโรส

2. แผ่นพลาสติกคล้ายหวีสำาหรับทำาหลุมหยอดตัวอย่าง (comb) 3. เทปกระดาษสำาหรับปิ ดด้านข้างของถาดพลาสติก 4. อะกาโรสในฟลาสขนาด 125 มล.

5. ดีเอ็นเอมาตรฐาน (standard DNA marker, ladder) 6. บัฟเฟอร์ TBE (0.5%)

7. บัฟเฟอร์สำาหรับหยอดตัวอย่าง (loading buffer) เข้มข้น 6 เท่า

8. หลอดไมโครฟิ วจ์ 1.5 มล.สำาหรับผสมตัวอย่างกับ loading buffer 9. ออโตไปเปตขนาด 10-100 ไมโครลิตร 10.ไมโครเวฟ

11.กล่องอีเล็กโตรโฟรีซิส (electrophoresis tank)

12.เคร่ ืองควบคุมกำาลังไฟฟ้ า (stabilised power supply) 13.สารละลายเอธิเดียมโบรไมด์

14.ตูแ ้ สงอัลตราไวโอเลทพร้อมกล้องบันทึกภาพต่อเช่ ือมกับคอมพิวเตอร์ 15.หน้ากากกันแสงยูวี 16.ถุงมือยาง

Medical Biotechnology Laboratory Manual

7

2552 / 2

17.ภาชนะใส่เจลท่ีใช้แล้ว

18.ภาชนะใส่ถุงมือใช้แล้ว 19.ภาชนะใส่ทพ ิ ใช้แล้ว วิธีทำา

เตรียมเจลอะกาโรส 1. พิจารณาจากตารางเปอร์เซ็นต์อะกาโรส เลือกเปอร์เซ็นต์ท่ีเหมาะสมสำาหรับการแยก ดีเอ็นเอในการทดลองน้ี

2. เตรียมถาดสำาหรับหล่อเจล โดยนำาถาดท่ีล้างสะอาดไม่มีดีเอ็นเอติดจากการใช้คร้ังก่อน และ แห้งสนิท ปิ ดด้านข้างถาดด้วยเทปเพ่ ือไม่ให้อะกาโรสท่ียง ั เหลวอยู่ไหลออก นำาไปแล้ววาง บนแผ่นกระดาษทิชชูบนโต๊ะพ้ น ื ราบ

3. นำา comb ท่ีสะอาดขนาดท่ีเหมาะกับงานและสามารถทำาให้เกิดหลุมหยอดตัวอย่างมากเท่า ท่ีต้องการ อย่าลืมเผ่ ือ 1 หลุมสำาหรับหยอดดีเอ็นเอมาตรฐาน วาง comb ตรงตำาแหน่งวาง comb บนถาดท่ีแถวบน ในบางคร้ังถ้าต้องการจำานวนหลุมมากขึ้นอาจวาง comb อีกหนึ่ง อันท่ีตรงกลางถาด

4. ช่ังอะกาโรสสำาหรับเตรียมเจลปริมาตร 50 มล. ใส่ในฟลาสก์ท่ีแห้งสะอาดท่ีผ่านการนึ่งออ โตเคลฟแล้ว

5. เติมบัฟเฟอร์ TBE ลงไป 50 มล. เขย่าฟลาสก์เบาๆเพ่ ือกระจายอะกาโรสในบัฟเฟอร์ 6. นำาฟลาสก์ในข้อ 5 ไปหลอมในตู้ไมโครเวฟ ประมาณ 1 นาที ให้สารละลายเดือดเพียงนิด เดียว สวมถุงมือและใช้กระดาษซับจับฟลาสก์แกว่งจนผสมดีแล้วให้ความร้อนอีกคร้ังจน

เดือดเล็กน้อย ทำาเช่นน้ีจนกว่าอะกาโรสจะหลอมหมดจนเห็นเจลเหลวใส ระมัดระวังขณะท่ี

เดือดจะเดือดมากขึ้นอย่างรวดเร็วมากเกินจนดันเจลล้นออกจากฟลาสก์ ดังน้ันอย่าปล่อยให้ เดือดมากกว่า 10 วินาที

7. ปล่อยให้ฟลาสก์เย็นลงประมาณ 5-10 นาที แกว่งฟลาสก์เป็ นคร้ังคราว 8. เติมเอธิเดียมโบรไมด์ 2 ไมโครลิตรแล้วผสม จากน้น ั ค่อยๆเทลงในถาดท่ีเตรียมไว้ (เพ่ ือให้ ล้างฟลาสก์ได้ง่ายให้ชะเจลด้วยน้ำก่อนท่ีเจลท่ีเหลอในฟลาสก์จะแข็งตัว)

9. ถ้ามีฟองใช้ปลายทิพเข่ียให้อยู่ข้างๆ

10.ปล่อยให้เจลแข็งตัว ระหว่างอย่าเคล่ ือนย้ายถาด 11.เม่ ือเจลแข็งตัวให้ดึง comb ออก ให้ดึงขึ้นตรงๆระวังอย่าทำาให้หลุมหยอดตัวอย่างแตก

12.ถ้ายังไม่ใช้ทันทีสามารถเก็บได้นาน 1 เดือน โดยห่อด้วยพลาสติกห่ออาหารแล้วเก็บในตู้ เย็น

Medical Biotechnology Laboratory Manual

8

2552 / 2

อีเล็กโตรโฟรีซิส วางแผนว่าจะใส่ตัวอย่างใดในหลุมใด ปรกติตว ั อย่างท่ีจะเปรียบเทียบกันหยอดใส่ในหลุมติด

กัน ส่วนตัวอย่างท่ีจะหาขนาดแน่นอนให้หยอดในหลุมติดกับ ladder

1. ไปเปต 2 ไมโครลิตรของ loading buffer (6x) ใส่ในหลอดไมโครฟิ วจ์ตามจำานวนตัวอย่าง และ 1 ไมโครลิตรใส่ในหลอดไมโครฟิ วจ์สำาหรับ ladder

2. ไปเปตตัวอย่างดีเอ็นเอ 10 ไมโครลิตรและ ladder 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอดข้อ 1 ใช้ไปเปต ดูดขึ้นลงเพ่ ือผสมให้เข้ากัน

3. วางถาดเจลท่ีเตรียมในข้ันตอนแรกวางลงในกล่องอีเล็กโตรโฟรีซิส

4. เติมบัฟเฟอร์ 0.5xTBE ลงในกล่องจนท่วมเจลประมาณ 1-2 มิลลิเมตร 5. ดูดตัวอย่างและ ladder ท่ีผสม loading buffer แล้วลงในหลุม วางหลอดเป็ นลำาดับเพ่ ือ ช่วยเตือนความจำาว่าหลุมใดเป็ นตัวอย่างอะไร (และจดบันทึกในสมุดบันทึกต่อไป)

6. ปิ ดฝากล่องแล้วต่อสายเข้าเคร่ ืองให้กระแสไฟฟ้ า ให้ข้ัวลบอยู่ใกล้กับหลุมท่ีหยอดตัวอย่าง ดีเอ็นเอ

7. เปิ ดเคร่ ืองให้กำาลังไฟฟ้ า โดยต้ง ั ค่าศักย์ไฟฟ้ าท่ี 90 โวลต์ จะเห็นฟองเล็กๆออกจากข้ัวอีเล็ก โทรด สังเกตว่าสีเคล่ ือนทีออกไปจากหลุมอย่างถูกต้อง

8. ทำาอีเล็กโตรโฟรีซิสนาน 1 ช่ัวโมงหรือจนกว่าสีของ loading buffer เคล่ ือนมาถึงประมาณ กลางเจล หรือถ้าตัวอย่างมีขนาดเล็กมากควรปิ ดเคร่ ืองให้กำาลังไฟเม่ ือสีเคล่ ือนมา 1 ใน 4 ของเจล

9. นำาเจลไปส่องดูด้วยแสงยูวี ใช้ซูมปรับภาพให้โฟกัสชัดเจน และถ่ายภาพท้ังตอนท่ีสีเคล่ ือน มาท่ี 1 ใน 4 ของเจล และอีกคร้ังเม่ ือสีเคล่ ือนไปมากขึ้นซึ่งจะทำาให้ชิ้นดีเอ็นเอขนาดใหญ่ ปรากฏขึ้นชัดเจน

ภาพที่ 5 ให้ต่อข้ัวลบของคาโธดเข้ากับข้ัวอิเล็กโทรดด้านท่ีหยอดตัวอย่าง สังเกตว่าข้ัวลบใช้สายสีแดงและ ข้ัวบวกใช้สายสีดำา

Medical Biotechnology Laboratory Manual

9

2552 / 2

ภาพที่ 6 เอธิเดียม โบรไมด์จะจับระหว่างช้ันของเบสในโมเลกุลของดีเอ็นเอ เม่ อ ื ถูกแสงยูวีจะปรากฏการ เรืองแสงเป็ นสีส้มแดง

วิเคราะห์หาขนาดของดีเอ็นเอของ PCR และพลาสมิด 1. ขณะถ่ายภาพให้มีไม้บรรทัดฟลูออเรสเซ็นต์ในภาพด้วย

2. วัดแต่ละแถบดีเอ็นเอจากก้นหลุมไปจนถึงตรงกลางแถบดีเอ็นเอตัวอย่างและดีเอ็นเอ มาตรฐาน

3. นำากระดาษกราฟลอการิธึมสองไซเคิลมา ส่วนบนของไซเคิลแรกเท่ากับ 1 kb และส่วนบน ของไซเคิลอันบนเท่ากับ 10 kb ทำาเคร่ ืองหมายตรงตำาแหน่งขนาดของ ladder ท่ีรู้โดย ตำาแหน่งท่ีทำาเคร่ ืองหมายน้น ั ควรจะมีช่วงเหมือนกับท่ีปรากฏบนเจล

4. แบ่งแกน x (แนวระนาบ)เป็ นเซ็นติเมตร สำาหรับการเคล่ ือนท่ีของดีเอ็นเอ แถบดีเอ็นเอท่ี เคล่ ือนท่ีเร็วท่ส ี ุดจะอยู่ใกล้ขอบขวาของกระดาษ เขียนกราฟตำาแหน่งของชิ้นดีเอ็นเอใน ladder

5. ลากเส้นต่อจุดดีเอ็นเอของ ladder ให้สม่ำเสมอเป็ นเส้นโค้งเรียบๆ บริเวณใกล้ๆ 1.6 kb ควรจะเกือบเป็ นเส้นตรง แต่เป็ นเส้นโค้งเล็กน้อยท่ีส่วนปลาย

6. หาตำาแหน่งบนแกน x สำาหรับแถบดีเอ็นเอของตัวอย่าง แล้วลากเส้นมาจด ladder แล้ว ลากไปทางซ้ายมือเพ่ ือหาขนาด

7. ความคลาดเคล่ ือนเกิดตรงตำาแหน่งท่ีโค้งหรือใส่ตัวอย่างมากเกิน (ตัวอย่างมากเกินทำาให้ แถบดีเอ็นเอเคล่ ือนท่ีล้ำหน้ากว่าท่ีควร) ดังน้น ั ต้องพิจารณาเลือกตำาแหน่งบนแถบดีเอ็นเอท่ี เหมาะสมในการวัด หมายเหตุ

1. การทดลองน้ีต้องการทราบขนาดของพลาสมิดและดีเอ็นเอจาก PCR โดยประมาณ เท่าน้ัน จึงไม่ต้องทำาการสร้างกราฟ

2. ให้สังเกตในหลุมตัวอย่างพลาสมิดว่ามีก่ีแถบ และการเคล่ ือนท่ีของพลาสมิดรูปร่างต่าง กันแตกต่างกันอย่างไร