Diagnostico De Infecciones De Plasmodium Por El Laboratorio

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LAS INFECCIONES POR PLASMODIUM

13-2-09 Óscar

Introducción Plasmodiosis = Malaria = Paludismo: Parasitosis caracterizada por episodios febriles típicos, precedidos por escalofrío intenso que terminan con diaforesis, hepatoesplenomegalia y anemia que varia de leve a grave. Enfermedad causada por parasitos del genero Plasmodium Phyllum: Apicomplexa (una sola célula) Clase: Sporozoea (carece de organelos de locomocion) Subclase: Coccidia Familia: Plasmodiidae Género y especies que pueden parasitar al hombre: Plasmodium vivax P.malariae P. falciparum P. ovale.

Epidemiología Entre 500-900 millones de individuos sufrirán ataques clínicos de paludismo el próximo año Las infecciones más frecuentes son las debidas a P.vivax y P.falciparum. El P.falciparum predomina en África Tropical, sudeste de Asia, Oceanía, la ribera amazonica y la Republica Dominicana. P.Vivax es más común en América Central y en la India.

• El paludismo es una enfermedad endémica en unos 100 países. • Enfermedad reemergente tanto en países endémicos como en países no endémicos.

Este aumento obedece a: -Aumento de la resistencia de los parásitos -Aumento de la resistencia del vector -Aumento de los viajes a zonas endémicas

• Transmisores del paludismo: hembras de los mosquitos del genero Anopheles. Especies de Anopheles mas importantes: A.quadrimaculatus A.pseudopunctipennis A.albimanus. • Predomina en las regiones tropicales y subtropicales.

DISTRIBUCIÓN DEL PALUDISMO

Epidemiología : Otras formas de transmisión • Personas que anteceden de transfusión sanguínea procedente de donadores con paludismo, puede desarrollar la enfermedad.

• Paludismo congenito: Ha sido descrito con las 4 especies. Al parecer, para que exista este tipo de transmisión se necesita que la barrera placentaria haya sido dañada

Manifestaciones clínicas: Periodo de incubación Varia según la especie infectante y de acuerdo con la cepa. P. vivax y P. ovale tienen un periodo de incubación de 10 a 7 días P. falciparum de 8 a 12 y P. malariae de 27 a 40 días.

Los últimos días del periodo de incubación pueden caracterizarse por signos y síntomas como dolores musculares, anorexia, naúseas e inclusive vómito. El paroxismo febril casi siempre es precedido por un escalofrío repentino, que estremece al enfermo, al principio dura 10 a 15 minutos y se alarga un poco a medida que el cuadro clínico se repite. La etapa febril sigue a la de escalofrío y se acompaña de cefalea y dolores de tronco y miembros.

Esta etapa dura de 2 a 6 horas y es seguida por una etapa de sudoración intensa, en la cual el paciente suele sentirse débil y agotado, quedando casi siempre dormido. En el paludismo causado por P. vivax y P. ovale el periodo de la crisis es de 48 horas. En P. falciparum es casi de 48 horas. Y en P. malariae de aproximadamente de 72 horas.

Los cuadros clínicos menos graves son causados por P. ovale y P. vivax Los moderadamente graves por P.malariae y los graves e incluso frecuentemente mortales por P. falciparum.

Manifestaciones clínicas: Síntomas Escalofríos intenso Fiebre 40-41 º C Sudoración. Cefalea Nauseas Taquicardia

Tratamiento Para destruir las formas eritrocitarias (tratamiento supresivo) se puede emplear principalmente: Amodiaquina Cloroquina

• Debido al aumento de las resistencia a estos fármacos se están diseñando nuevos fármacos • Estos tienen el inconveniente de ser unas 10 veces más caros

Ciclo biológico

2.

Exporozoitos pasan del torrente sanguíneo al hepatocito

1. 3. Esquizoogenesis

Inoculación de esporozoito

11. Fusión de los gametocitos y formación de los huevos 4. Esquizonte hepático

9. Gametocitos

8. Esquizonte hematico

5. Merozoito

10. Gametocitos chupados por el mosquito 6. Merozoito penetra a los hematíes

7. Trofozoito

Diagnostico de laboratorio: Examen de muestras de sangre periferica

Método de referencia Preparación de las muestras: Gota gruesa (sobre todo cuando hay menor presencia de parásitos) Frotis (extensión en capa fina) Tinciones – Giemsa (tinción de referencia) – Field (tinción rapida y sencilla) – Otras: Leishman Naranja de Acridina

Plasmodium vivax Los hematíes parasitados suelen tener tamaño aumentado y contienen gránulos de Schuffner (microtúbulos degradados de color rosado) Las formas en anillo son de contorno fino y de tamaño considerable Los Gametocitos tienen forma redonda u ovalada Los Esquizontes contienen numerosos merozoitos

Plasmodium falciparum Multiples formas en anillo en el interior de un hematie Gametocitos en forma de banana No suelen verse esquizontes Inclusiones de color parduzco en el interior de los neutrofilos y monocitos (pigmento de Maurer = hemozoina)

Plasmodium ovale Hematies aumentados Anillos de forma ovalada mas compactos que en el P.vivax y el P.falciparum Gametocitos redondeados

Plasmodium malariae

Hematies ligeramente menores que los normales Anillos compactos Gametocitos redondeados

TROFOZOITOS Plasmodium falciparum:  Los trofozoitos dentro del eritrocito siempre están en forma de “anillo”, además de que sólo en P. falciparum se presentan múltiples trofozoitos en una célula. Plasmodium vivax:  Los eritrocitos infectados por P. vivax son a veces más grandes que los eritrocitos normales. Aproximadamente cabría 1.5  eritrocitos normales en uno infectado.. Plasmodium malariae: La característica de los trofozoitos de P. malariae muestran la forma de “anillo” y una ligera tendencia de que los eritrocitos normales sean de tamaño normal o más pequeños.

GAMETOCITOS

GAMETOCITOS Plasmodium falciparum:  El gametocito tiene forma de Platano. Plasmodium ovale:  El gametocito es más grande que los eritrocitos normales.Tienen una apariencia granular parecidos a los puntos de Schuffner. Plasmodium malariae:  Los gametocitos de P. malariae tienen una apariencia redonda cercana a la de los eritrocitos. Tienen a demás una apariencia granular.

ESQUIZONTES

Plasmodium malariae:  Un esquizonte tiene de 6 a 12 merozoitos, dándole una apariencia granular.

Plasmodium vivax: Un esquizonte muestra numerosos merozoitos (de 16 a 24), y un mayor tamaño en comparación con los eritrocitos normales

Características morfológicas de los parásitos palúdicos en extensiones sanguíneas finas (según OMS). P.Vivax

P.Ovale

P.Malariae

P.falciparum

Hematie infectado

Aumentado Puntos de Schuffner

Aumentado, oval Puntos de Schuffner

Normal o menor

Normal Hendiduras de Maurer

Anillo

Grande Uno o dos puntos de cromatina Puede haber 2 anillos

Compacto Raro 2 anillos

Compacto Raro 2 anillos

Pequeño Delicado A menudo dos puntos de cromatina y 2 o más anillos

Trofozoito

Grande Ameboide Pigmento en bastones fino

Pequeño No ameboide Pigmento granuloso

Pequeño Compacto, a menudo en forma de banda Pigmento granuloso

Tamaño moderado Compacto Pigmento en gránulos

Esquizonte

Grande Merozoitos grande (12-24) Pigmento coalescente

Mas pequeño que P.vivax 6-12 merozoitos Pigmento más oscuro que P.vivax

Pequeño 6-12 merozoitos grandes Aspecto tipico de “Margarita” Pigmento granulosos

Raro Merozoitos pequeños (826) Masa única de pigmento

Gametozito

Esfericos Compactos Nucleo único Pigmento difuso y granuloso

Parecido a P.vivax pero más pequeños

Parecidos a P.vivax pero más pequeños Menos mumerosos Sin puntos de Schufner

Forma semilunar Nucleo único

Otras pruebas diagnosticas: Microscopia de fluorescencia Colorantes fluorescentes con afinidad por los ácidos nucleicos de los parasitos: Naranja de acridina (NA) Benzotiocarboxipurina (BCP) Aumentan la sensibilidad. Pueden ser útiles en caso de parasitemias muy baja No permiten la diferenciación de las diferentes especies de Plasmodium

Otras pruebas diagnosticas: Sistema QBC Quantitative Buffy Coat System Se basa en la concentración por gradiente de densidad de los eritrocitos parasitados mediante la centrifugación de un capilar impregnado de heparina y NA, al que se añade un flotador. Sistema caro: necesita de centrifuga, capilares especiales, un acoplador de microscopio con un sistema de epifluorescencia, lentes especiales,… No aporta mucho al frotis y a la gota gruesa, ni permite diferenciar diferentes especies

PRUEBAS RAPIDAS PARA EL DIAGNOSTICO DEL PALUDISMO (PRDM)

• Utilizan principios de inmunocromatografía incorporados a formatos de cintas reactivas o de tarjetas de prueba • Pretenden tipificar a la especie de Plasmodium conforme a la detección de antígenos específicos producidos por el parásito. •Las PRDM pretenden ser : sencillas (manejo a temperatura ambiente sin instrumentos) rápidas (diagnóstico en sólo 10 a 15 minutos)

PRDM Detección de HRP-2

• Proteína 2 rica en histidina especifica de P. falciparum (PfHRP-2) • Detección mediante la captura antigénica con anticuerpos especificos y técnicas de inmunocromatografía • Tienen falsos negativos y no son cuantitativas • Tienen falsos positivos: especialmente con el FR • Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en diagnostico microscopico

PRDM Kit comerciales de detección conjunta de HPR-2 y pLDH o Aldolasa de plasmodium • Los kit comerciales utilizan anticuerpos contra HPR-2 especifica de P.falciparum, y anticuerpos contra antigenos panmalaricos, o sea, presentes en las cuatro especies de Plasmodium (Lactato Deshidrogenasa parasitaria y Aldolasa de Plasmodium). • Detección mediante la captura antigénica con anticuerpos especificos y técnicas de inmunocromatografía • Metodo barato • No ofrece mejor sensibilidad que la microscopia, tienen falsos negativos ,no son cuantitativas y no permite distinguir entre especies diferentes a P.falciparum. • Tienen falsos positivos • Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en diagnostico microscopico

OPTIMAL: Diagnóstico de malaria con anticuerpos monoclonales contra la enzima pLDH

Técnicas moleculares PCR a tiempo real

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Se amplifica el gen de la subunidad 18S del RNA ribosomal Este gen presenta secuencias de bases comunes y especificas de cada especie. Se utilizan varios pares de primers en un unico tubo (PCR multiplex) que permite la amplificación simultanea de varios fragmentos de DNA. El producto amplificado se detecta por fluorescencia La detección de las intensidades de fluorescencia mientras se produce la PCR, hace posible la detección y cuantificación del producto amplificado. Permite la detección incluso de 0.7-4 parásitos/uL Al ser cuantitativa: sirve para controlar tratamientos Altisima sensibilidad y especificidad

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MUY CARA. Solo posible en países desarrollados

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- Diagnostico molecular de malaria en sangre de pacientes

ssDNA Plasmodium

P. vivax (499 pb)

ssrDNA Humano

P. falciparum (395 pb) P. malariae (269 pb)

Serología • Derección de anticuerpos anti P.falciparum en el suero • Baja sensibilidad. • Solo se utiliza en determinados casos en donde la microscopia es negativo debido a la medicación • Existe una técnica de inmunofluorescencia (Falciparum-spot IF. Bio-Merieux). • Mas recientementew se ha introducido un enzimoinmunoensayo (Malaria IgG Celisa. BMD).

CONCLUSIONES LA OBSERVACIÓN MICROSCOPICA ES EL METODO DE REFERENCIA cuantitativo ,diferencia especies y barato LAS TECNICAS INMUNOCROMATOGRAFICAS SON FACILES Y BARATAS PERO PEORES menos sensibilidad y con falsos positivos y falsos negativos LA PCR ES LA MAS SENSIBLE PERO LA MAS CARA detecta parasitemias bajas. Util para control de ttos.