Chuong Iii[1]

Ch−¬ng III C¸c h−íng ph¸t triÓn c¬ b¶n cña c«ng nghÖ tÕ bμo 3.1.

C«ng nghÖ tÕ bμo nh©n gièng thùc vËt

3.1.1. Nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng Limmasets vμ Cornuet (1949) ®· ph¸t hiÖn r»ng ë c¸c c©y nhiÔm bÖnh virus, virus ph©n bè kh«ng ®ång nhÊt trªn c©y vμ th−êng kh«ng thÊy chóng ë vïng ®Ønh sinh tr−ëng. Ph¸t hiÖn ®ã lμ c¬ së ®Ó Morel vμ Martin (1952) chøng minh gi¶ thuyÕt trªn b»ng c¸ch t¹o ®−îc c©y s¹ch bÖnh virus tõ 6 gièng khoai t©y qua nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng. N¨m 1960, Morel ®· thùc hiÖn b−íc ngoÆt khi ¸p dông thμnh c«ng kü thuËt nμy trong nh©n nhanh c¸c loμi ®Þa lan Cymbidium th«ng qua protocorm. Sau ®ã, viÖc ph¸t hiÖn ra cytokinin vμ m«i tr−êng nu«i cÊy m« c¶i tiÕn (Murashige vμ Skoog, 1962) ®· t¹o søc sèng míi ®Ó øng dông nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng trong nh©n gièng th−¬ng m¹i ë thùc vËt. Ngμy nay, kü thuËt nμy cïng víi mét sè c¶i tiÕn ®· trë thμnh ph−¬ng ph¸p lo¹i trõ bÖnh virus ®−îc sö dông réng r·i ®èi víi nhiÒu loμi c©y trång kh¸c nhau. MÉu m« thùc vËt dïng trong nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng KÕt qu¶ nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng phô thuéc vμo vËt liÖu khëi ®Çu, nguån gèc vμ kÝch th−íc cña mÉu. §Ó ®¹t ®−îc hiÖu qu¶ cao, cÇn lÊy mÉu nu«i cÊy tõ chåi ®ang sinh tr−ëng m¹nh (Gupta vμ CS, 1981) hoÆc chåi cña c©y míi ghÐp (Jones vμ cs, 1985). Nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng c©y non dÔ dμng h¬n c©y tr−ëng thμnh, tû lÖ ra rÔ trong tr−êng hîp nμy ®¹t 83%, trong khi víi c©y tr−ëng thμnh chØ ®¹t 63% (Vieitez vμ cs, 1985). §iÒu kiÖn nu«i cÊy, thêi ®iÓm lÊy mÉu còng ¶nh h−ëng rÊt lín ®Õn kÕt qu¶ t¸i sinh c©y tõ ®Ønh sinh tr−ëng. Mét sè loμi cã −u thÕ chåi ®Ønh m¹nh, nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng tõ chåi ®Ønh dÔ dμng h¬n tõ chåi n¸ch, ®èi víi mét sè loμi kh¸c l¹i thu ®−îc kÕt qu¶ ng−îc l¹i. KÝch th−íc mÉu nu«i cÊy cμng lín, tû lÖ t¸i sinh vμ sèng sãt cña mÉu cμng cao, tuy nhiªn mÉu cμng nhá th× kh¶ n¨ng s¹ch bÖnh virus l¹i cao h¬n. Do vËy, kÝch th−íc mÉu nu«i cÊy cÇn ph¶i x¸c ®Þnh b»ng thùc nghiÖm ®èi víi mçi loμi. MÉu nu«i cÊy nhá nhÊt chØ cã chãp sinh tr−ëng vμ 2 - 3 mÇm l¸ sÏ lμ lý t−ëng ®Ó t¹o gièng s¹ch bÖnh do m« ph©n sinh ®Ønh n»m ë chãp ®Ønh chåi, lμ trung t©m 57

ho¹t ®éng sinh tr−ëng, ph©n ho¸ vμ ph¸t triÓn cña thùc vËt. Ngay d−íi m« ph©n sinh nμy lμ c¸c mÇm l¸. §«i khi kÝch th−íc mÉu lín h¬n vÉn ®¶m b¶o s¹ch bÖnh virus (Vine vμ Jones, 1969) song mét sè tr−êng hîp kh¸c l¹i ®ßi hái mÉu nhá h¬n (Hunter vμ cs, 1984). Nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng lμ kü thuËt nu«i cÊy m« ®−îc øng dông réng r·i nhÊt trong n«ng nghiÖp vμ nghÒ lμm v−ên víi c¸c −u ®iÓm chÝnh sau: -

Nh©n nhanh hμng lo¹t, ®ång nhÊt víi sè l−îng lín c©y gièng tõ mét c©y mÑ ban ®Çu

-

Lo¹i trõ bÖnh virus vμ t−¬ng tù virus

-

B¶o qu¶n quü gen in vitro vμ trao ®æi nguån gen an toμn gi÷a c¸c quèc gia

-

Sö dông trong chuyÓn gen

C¸c kiÓu nu«i cÊy -

Nu«i cÊy m« ph©n sinh (meristem culture) thùc chÊt lμ nu«i cÊy phÇn ®Ønh sinh tr−ëng kh«ng kÌm theo l¸ mÇm.

-

Nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng (meristem tip culture) bao gåm chãp sinh tr−ëng vμ mét sè mÇm l¸. Trong thùc tÕ, nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng ®−îc dïng phæ biÕn ®Ó t¹o c©y s¹ch bÖnh (George vμ Sherington, 1984).

-

Nu«i cÊy ®Ønh chåi (shoot tip): Th−êng dïng ®Ó nh©n nhanh in vitro, kh¸c víi nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng chñ yÕu ë kÝch th−íc mÉu nu«i cÊy. §Ønh sinh tr−ëng th−êng nhá (0.1 - 0.5 mm) so víi ®Ønh chåi (0,5 - 5,0 mm).

M«i tr−êng nu«i cÊy M«i tr−êng MS (Murashige vμ Skoog, 1962) ®−îc sö dông phæ biÕn nhÊt trong nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng. Nh−ng c¸c loμi kh¸c nhau cã thÓ ®ßi hái m«i tr−êng nu«i cÊy kh¸c nhau. Samartin (1989) ®· sö dông 6 c«ng thøc muèi ®a l−îng kh¸c nhau ®èi víi c©y trμ Camelia japonica vμ thÊy r»ng m«i tr−êng MS cho tèc ®é sinh tr−ëng nhanh nhÊt khi thu mÉu tõ c©y non. M«i tr−êng MS ®· chøng tá kh«ng thÝch hîp cho mÉu lÊy tõ c©y giμ, trong khi m«i tr−êng muèi lo·ng h¬n (Heller, 1953) l¹i cho kÕt qu¶ kh¸. TÝnh ®éc cña m«i tr−êng MS còng ®−îc quan s¸t ë mét sè loμi (Sommer, 1982; Vieitez, 1983) do m«i tr−êng nμy chøa hμm l−îng muèi ®a l−îng cao, cã thÓ 58

g©y ®éc cho tÕ bμo in vitro, nhÊt lμ protoplast. Ph−¬ng ph¸p ®¬n gi¶n nhÊt lμ gi¶m nång ®é muèi kho¸ng xuèng 1/3 hoÆc 1/2 (Grosser, 1994). M«i tr−êng c¬ b¶n MS cã hμm l−îng NH4NO3, KNO3 gi¶m mét nöa, bæ sung thªm glutamine 1.550 mg/l, KCl 750 mg/l rÊt tèt cho nu«i cÊy m« sÑo ph«i ho¸ vμ gi¶m tÝch luü tinh bét ë mét sè gièng Citrus (Grosser vμ Gmitter, 1990). Trong sè c¸c muèi ®a l−îng, muèi nit¬ cã ý nghÜa quyÕt ®Þnh ®Õn sù t¸i sinh chåi. Welander (1985) cho biÕt khi nång ®é NH4NO3 vμ KNO3 trong MS gi¶m ®i 1/2, ®Ønh sinh tr−ëng cña d©u t©y ph¸t triÓn kh¸ h¬n, rÔ t¸i sinh m¹nh h¬n. Gi¶m muèi kho¸ng trong mét sè tr−êng hîp cã t¸c dông tèt ®èi víi sù ra rÔ ë mét sè loμi (Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987) nh− tr−êng hîp chåi hoa hång ra rÔ tèt h¬n khi nång ®é nit¬ tæng sè gi¶m (Hyndman cs., 1982). Nguån carbon còng rÊt quan träng ®èi víi nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng. Nång ®é ®−êng 1- 3 % ®−îc sö dông phæ biÕn. Nång ®é ®−êng sucrose cao h¬n 3 % tá ra ®éc ë mét sè tr−êng hîp (Rublue vμ Kartha, 1985). Chong vμ Pua (1985) ®· sö dông sucrose, glucose, fructose and sorbitol nång ®é tõ 1-7 % trong nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng gièng t¸o Ottawa 3 vμ thÊy r»ng nång ®é sucrose 3% lμ tèi −u cho sinh tr−ëng, 100% chåi t¹o rÔ vμ chÊt l−îng c©y con khoÎ m¹nh. Tr¹ng th¸i vËt lý cña m«i tr−êng còng cã ý nghÜa quan träng trong nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng. §a sè c¸c tr−êng hîp ng−êi ta sö dông m«i tr−êng agar nh−ng khi nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng mét sè loμi, m«i tr−êng láng tá ra tèt h¬n (Mellor vμ Stace Smith, 1969). Nång ®é c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng thÊp trong m«i tr−êng cã thÓ lμm gi¶m c¸c biÕn dÞ tÕ bμo soma (Grosser vμ Gmitter, 1990). TÕ bμo m« sÑo ph«i ho¸ ë c©y cã mói cã thÓ nu«i cÊy vμ b¶o qu¶n l©u dμi trong m«i tr−êng kh«ng cã chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng. øng dông kü thuËt nu«i cÊy ®Ønh chåi vμ ®Ønh sinh tr−ëng trong t¹o gièng s¹ch bÖnh T¹o gièng chèng chÞu c¸c bÖnh virus lμ mét h−íng nghiªn cøu kh¶ quan. Nh−ng trong thùc tÕ, chän t¹o gièng gÆp nhiÒu khã kh¨n do thiÕu nguån gen cã kh¶ n¨ng chèng chÞu víi c¸c lo¹i bÖnh virus kh¸c nhau. Bªn c¹nh ®ã, viÖc t¹o gièng c©y l−u niªn cßn gÆp trë ng¹i h¬n do mÊt nhiÒu thêi gian vμ c«ng søc. GÇn ®©y, kü thuËt gen ®· më ra triÓn väng t¹o gièng miÔn dÞch di truyÒn víi mét sè lo¹i virus b»ng c¸ch chuyÓn gen protein vá virus hoÆc gen iARN vμo c©y trång, 59

lμm c©y cã kh¶ n¨ng bÊt ho¹t gen vμ mARN virus. Tuy nhiªn, nhiÒu vÊn ®Ò kü thuËt vμ lý luËn vÉn cßn kh¸ nan gi¶i. Do vËy, ph−¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ nhÊt hiÖn nay vÉn lμ t¹o ra c¸c vËt liÖu nh©n gièng s¹ch bÖnh virus qua nu«i cÊy ®Ønh chåi, ®Ønh sinh tr−ëng hoÆc kÕt hîp víi xö lý ho¸ chÊt, nhiÖt ®é. Nh÷ng ph−¬ng ph¸p nμy ®· gióp lo¹i trõ c¸c bÖnh virus kh¸c nhau khái vËt liÖu nh©n gièng vμ t¹o gièng s¹ch bÖnh ë mét lo¹t c©y trång, chñ yÕu lμ khoai t©y, khoai lang, s¾n, tái, c©y ¨n qu¶ cã mói, chuèi, nho, m¬, mËn, c©y hoa nh− cóc, cÈm ch−íng... Ph−¬ng ph¸p nμy cho phÐp lo¹i bá hÇu hÕt c¸c bÖnh virus, viroid vμ c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh t−¬ng tù virus (Vasil vμ Thorpe, 1994). Chãp ®Ønh sinh tr−ëng ®−îc coi lμ s¹ch bÖnh virus. MÉu m« nu«i cÊy cμng nhá vμ cμng gÇn ®Ønh sinh tr−ëng th× kh¶ n¨ng s¹ch bÖnh cμng lín. D−êng nh− cã t−¬ng quan tû lÖ thuËn gi÷a kÝch th−íc mÉu víi kh¶ n¨ng c©y t¸i sinh s¹ch bÖnh (Stone, 1982; Green vμ Lo, 1989). Nh−ng trong mét vμi tr−êng hîp, viÖc lo¹i trõ virus rÊt khã kh¨n vμ kh«ng phô thuéc vμo kÝch th−íc mÉu do mét sè virus cã kh¶ n¨ng sinh s¶n vμ chuyÓn dÞch nhanh chãng ®Õn vïng sinh tr−ëng (Theiley vμ cs, 1984). Ng−êi ta ®· quan s¸t thÊy mËt ®é virus kh¸ cao ë vïng chãp ®Ønh sinh tr−ëng cña mét sè loμi d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö (Toussaint vμ cs, 1984). Do vËy, viÖc kÕt hîp kü thuËt nu«i cÊy nμy víi c¸c yÕu tè k×m h·m virus nh− ho¸ chÊt, nhiÖt ®é cã thÓ t¨ng c−êng kh¶ n¨ng lo¹i trõ bÖnh virus vμ t¹o gièng s¹ch bÖnh ë c©y trång. 3.1.2. T¹o m« s¹ch bÖnh lμm vËt liÖu nh©n gièng Xö lý nhiÖt lo¹i trõ virus tõ mÉu nu«i cÊy Trong mét sè tr−êng hîp, ng−êi ta ph¶i phèi hîp xö lý nhiÖt víi nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng hoÆc vi ghÐp ®Ó lo¹i trõ bÖnh virus (Walkey, 1980; Kartha, 1986; Brown vμ cs, 1988). ¦u thÕ cña kü thuËt nμy lμ sau khi c©y ®· qua xö lý nhiÖt, mÉu nu«i cÊy (hoÆc vi ghÐp) th−êng cã kÝch th−íc lín h¬n. Green vμ Lo (1989) ®· t¹o gièng khoai lang s¹ch bÖnh virus (bÖnh vμng lôi) b»ng nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng kÝch th−íc nhá (0,3 mm) hoÆc nu«i cÊy ®Ønh chåi kÝch th−íc lín h¬n (1,0 - 2,5 cm) sau khi xö lý c©y mÑ ë 37oC trong mét ®Õn hai th¸ng (h×nh 9). KÕt qu¶ t−¬ng tù còng nhËn ®−îc ë c©y s¾n (Kartha vμ Gambong, 1975). Xö lý nhiÖt ®èi víi c©y mÑ 60

C©y mÑ hoÆc mét phÇn c©y mÑ ®−îc xö lý ë nhiÖt ®é cao b»ng c¸ch t¨ng nhiÖt mét c¸ch tõ tõ cho ®Õn khi ®¹t nhiÖt ®é tíi h¹n. NhiÖt ®é nμy cã thÓ øc chÕ hoÆc lo¹i trõ virus khái vïng sinh tr−ëng m¹nh nh−ng kh«ng ¶nh h−ëng ®Õn sinh tr−ëng cña c©y. C©y ®−îc l−u gi÷ ë nhiÖt ®é tíi h¹n trong kho¶ng thêi gian x¸c ®Þnh, sau ®ã t¸ch vμ nu«i cÊy chåi ®Ønh hoÆc sö dông trong vi ghÐp. Tû lÖ s¹ch bÖnh cña mÉu phô thuéc vμo thêi gian xö lý nhiÖt ®é tíi h¹n vμ phô thuéc vμo kh¶ n¨ng chÞu nhiÖt cña gièng (Converse vμ Tanne, 1984; LozoyaSaldana vμ Merlin -Lara, 1984). Xö lý nhiÖt cã t¸c dông tèt víi ®a sè tr−êng hîp, song ®«i khi m« tÕ bμo cña c©y nhiÔm virus nh−ng kh«ng bÞ lo¹i trõ ë nhiÖt ®é cao do chñng virus vÉn cã kh¶ n¨ng sinh s¶n ë nhiÖt ®é nμy (Dawson, 1976). KÕt hîp xö lý nhiÖt ®é thÊp víi nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng ®· ®−îc sö dông thμnh c«ng ®Ó lo¹i trõ viroid khái khoai t©y vμ hoa cóc (Paduch-Cichal vμ Kryczynski, 1987). Bªn c¹nh ®ã, ng−êi ta sö dông kÕt hîp mét sè ho¸ chÊt øc chÕ virus nh− ribavirin, vidarabine cã gèc adenine ®Ó t¹o gièng s¹ch bÖnh (Cassells vμ Long, 1980; Stone, 1982). C¸c ho¸ chÊt chèng virus th−êng ®éc cho m« c©y nªn øng dông cña kü thuËt nμy vÉn cßn h¹n chÕ. 3.1.3. Nu«i cÊy tÕ bμo ph«i t©m (nucellar) Rangaswamy (1959) lμ ng−êi ®Çu tiªn c«ng bè nu«i cÊy m« ph«i t©mnucellar ë Citrus. Khi nu«i cÊy trªn m«i tr−êng bæ sung casein, tÕ bμo nucellar C. microcarpa ®· t¹o m« sÑo, ph©n ho¸ m¹nh thμnh “pseudobulbils” (d¹ng gi¶ cñ) vμ tõ ®ã ph¸t triÓn thμnh c©y (Rangaswamy, 1959). Randhawa vμ céng sù (1960) còng t¹o ph«i thμnh c«ng ë c©y cã mói ®¬n ph«i C. grandis, C. limon vμ C. reticulata x C. sinensis. Kh«ng gièng nh− C. microcarpa vμ C. reticulata, nh÷ng c©y con cã nguån gèc nucellar ®· h×nh thμnh ph«i mét c¸ch trùc tiÕp. Bitter vμ céng sù (1963) ®· më réng nh÷ng nghiªn cøu nμy sang c¸c c©y cã mói kh«ng h¹t, c¸c c©y ®¬n ph«i vμ ®a ph«i nh− C. temple, C. reticulata, C. limon (chanh Meyer), C. maxima, C. sinensis (Robertson navel), C. latipes vμ C. latifolia (chanh kh«ng h¹t). Sù ph¸t triÓn cña ph«i nucellar ë mét sè gièng Citrus, ngoμi ph«i h÷u tÝnh cßn cã c¸c ph«i kh«ng sinh ra tõ tÕ bμo tói ph«i mμ tõ nh÷ng tÕ bμo soma cña ph«i t©m (nucellus) lμ líp tÕ bμo bao quanh tói ph«i cña h¹t non. Sau khi tÕ bμo trøng n»m trong tói ph«i ®−îc thô 61

tinh vμ ph©n chia lÇn thø nhÊt, ë ph«i t©m cã mét sè tÕ bμo lín víi nh©n to vμ nguyªn sinh chÊt ®Ëm ®Æc. Mét sè tÕ bμo nμy b¾t ®Çu ph©n chia, t¹o khèi nhá råi dÇn dÇn h×nh thμnh ph«i v« tÝnh. Ph«i v« tÝnh ph¸t triÓn song song víi ph«i h÷u tÝnh vμ cßn ®−îc gäi lμ ph«i nucellar (Toxopeus, 1930). Ph«i nucellar ph¸t triÓn b»ng ph©n bμo nguyªn ph©n b×nh th−êng cña tÕ bμo nucellus, kh«ng cã sù tham gia cña tÕ bμo sinh dôc vμ kh«ng x¶y ra ph©n bμo gi¶m nhiÔm nh− tÕ bμo mÑ. V× vËy, nh÷ng c©y con ph¸t triÓn tõ ph«i nucellar th−êng gièng hÖt víi c©y mÑ vÒ cÊu tróc di truyÒn. Sù sinh s¶n v« tÝnh nμy cã ý nghÜa quan träng ®èi víi tiÕn ho¸, chän vμ t¹o gièng c©y cã mói. Nu«i cÊy tÕ bμo nucellar vμ sù h×nh thμnh ph«i tõ nucellar trong ®iÒu kiÖn in vitro C¸c b−íc chuÈn bÞ nu«i cÊy m« tÕ bμo ph«i t©m - nucellar in vitro nh− sau: 1.

Bao kÝn nô hoa vμo ngμy hoa në ®Ó tr¸nh sù pha t¹p di truyÒn cña mÉu cÊy.

2.

Khö ®ùc vμ thô phÊn víi phÊn cña cam ba l¸ (P. trifoliata). Lý do cña viÖc thô phÊn cã kiÓm so¸t nμy lμ t¹o ra sù ®¸nh dÊu kh¸c biÖt dÔ nhËn biÕt sau nμy. V× tÊt c¶ c©y con tõ hîp tö (ph«i h÷u tÝnh) sÏ mang l¸ ba thuú gièng c©y mÑ, kh¸c víi nh÷ng c©y cã nguån gèc nucellar.

3.

Thu h¹t tõ qu¶ non ë nh÷ng thêi ®iÓm kh¸c nhau (tuÇn) ®Ó x¸c ®Þnh giai ®o¹n thÝch hîp nhÊt cho nu«i cÊy. ViÖc lùa chän thêi gian thu mÉu thay ®æi tuú theo tõng gièng.

4.

Sau khi x¸c ®Þnh thêi ®iÓm tèi −u nhÊt, h¸i nh÷ng qu¶ ®ang ph¸t triÓn, röa s¹ch, khö trïng bÒ mÆt b»ng hypoclorit canxi trong 10-15 phót, röa l¹i b»ng n−íc cÊt v« trïng ba lÇn.

5.

C¾t ®«i qu¶ trong ®iÒu kiÖn v« trïng. T¸ch h¹t non, bá vá lôa, lÊy phÇn cßn l¹i cña h¹t ®em nu«i cÊy hoÆc c¾t h¹t non theo chiÒu däc vμ quan s¸t d−íi kÝnh hiÓn vi soi næi. Lo¹i bá ph«i hîp tö vμ néi nhò. G¾p nucellus vμ ®Æt vμo m«i tr−êng nu«i cÊy.

6.

M«i tr−êng nu«i cÊy tÕ bμo nucellar lμ m«i tr−êng c¬ b¶n MS bæ sung thªm auxin, cytokinin vμ c¸c phô gia kh¸c nh− casein hydrolysate hay dÞch chiÕt malt nÕu cÇn, tuú thuéc vμo loμi ®−îc nu«i cÊy (B¶ng 16).

7.

MÉu cÊy ®−îc gi÷ trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 25 ± 2oC, ®é Èm 50-60% vμ chÕ ®é ¸nh s¸ng 16h s¸ng/ 8h tèi trong ¸nh s¸ng khuÕch t¸n (1000 - 1500 lux). 62

8.

Khi m« sÑo h×nh thμnh, cÊy chuyÓn sang m«i tr−êng MT (Murashige vμ Tucker, 1969). Thêi gian gi÷a c¸c lÇn cÊy chuyÓn lμ 3- 4 tuÇn/ lÇn.

9.

C¸c chåi h×nh thμnh sÏ ®−îc cÊy chuyÓn sang m«i tr−êng chøa axit gibberellic (1- 5 mg/l).

10. §Ó kÝch thÝch sù h×nh thμnh rÔ, cã thÓ nu«i chåi trong m«i tr−êng láng th«ng qua cÇu giÊy läc. 11. CÊy chuyÓn c©y con cã rÔ ph¸t triÓn tèt ra bÇu (chËu) víi hçn hîp ®Êt v« trïng vμ che tói nhùa ®Ó gi÷ Èm. 12. Tuú thuéc vμo sù ph¸t triÓn cña c©y, cÊy chuyÓn c©y con ra nhμ kÝnh vμ ®¶m b¶o ®é Èm cao trong 4 - 7 ngμy vμ dÇn dÇn bá tói nhùa gi÷ Èm ra. B¶ng 16. C¸c chÊt bæ sung trong m«i tr−êng sö dông ®Ó kÝch thÝch sù t¹o ph«i tõ tÕ bμo nucellar trong ®iÒu kiÖn in vitro Gièng

ChÊt bæ sung (mg/l)

C. microcarpa

Casein hydrolysate (400)

C. reticulata x C. sinensis (Temple

Adenin sulfat (25), NAA (0.5)

orange) C. grandis (Pong yau pummello)

Casein hydrolysate (500)

C. limon (Ponderosa lemon)

ChiÕt xuÊt malt (500)

C. sinensis (Washington navel)

Axit ascorbic (40), n−íc dõa (15%), Adenin sulfat (40), chiÕt xuÊt malt (400), casein hydrolysate (400)

C. sinensis (Valencia, Shamouti)

ChiÕt xuÊt malt (500), kinetin (0,1-1,0), IAA (0,1-1,0), n−íc dõa (15%), GA3 (1)

C. aurantifolia

NAA (0,1)

C. sinensis

Adenin sulfat (25-50), kinetin (0,5-2,0), casein hydrolysate (200 -600), chiÕt xuÊt malt (100-300), n−¬c dõa (15%).

C. sinensis (Hamlin, Pell navel,

ChiÕt xuÊt malt (500), 2,4-D (0,01)

Pineapple) C. paradissi (Marsh seedless)

BAP (0,1)

C. reticulata (Owari)

Daminozide (0,1) 63

3.1.4. GhÐp m¾t in vitro GhÐp chåi ®Ønh Ph−¬ng ph¸p phæ biÕn ®Ó t¹o c©y Citrus s¹ch bÖnh lμ chän läc c©y con cã nguån gèc tõ tÕ bμo nucellar. Tuy nhiªn, nh÷ng c©y nμy cã giai ®o¹n ch−a thμnh thôc kÐo dμi tr−íc khi b−íc vμo giai ®o¹n sinh s¶n. ViÖc xö lý nhiÖt ®Ó lo¹i trõ bÖnh nh− exocortis vμ xyloporosis th−êng kh«ng hiÖu qu¶. HiÖn nay, vi ghÐp chåi lμ kü thuËt t¹o c©y s¹ch bÖnh ®−îc sö dông thμnh c«ng ë nhiÒu phßng thÝ nghiÖm. Murashige vμ cs (1972) lμ nh÷ng nguêi ®Çu tiªn t¹o ®−îc c©y Citrus s¹ch bÖnh b»ng kü thuËt vi ghÐp chåi ®Ønh in vitro. Sau ®ã, Navarro (1975) còng sö dông kü thuËt nμy trªn nhiÒu c©y Citrus kh¸c vμ thu ®−îc kÕt qu¶ kh¶ quan. Kü thuËt vi ghÐp chåi bao gåm c¸c b−íc sau: 1.

ChuÈn bÞ gèc ghÐp vμ m¾t ghÐp trong èng nghiÖm: c©y gèc ghÐp th−êng ®−îc dïng trong vi ghÐp lμ Troyer citrange hoÆc mét vμi gèc ghÐp kh¸c cã kh¶ n¨ng t−¬ng hîp cao víi m¾t ghÐp. T¸ch chåi ®Ønh gåm ®Ønh sinh tr−ëng vμ 3 l¸ mÇm tõ c¸c c©y mÑ (h×nh), chåi ®Ønh ë d¹ng ngñ hoÆc d¹ng ®ang sinh tr−ëng ®Òu cã thÓ sö dông ®−îc.

2.

GhÐp vμ cÊy c©y ghÐp vμo èng nghiÖm: H¹t dïng lμm gèc ghÐp ®−îc gieo trong m«i tr−êng láng, ghÐp chåi ®Ønh lªn ®o¹n th©n non cña gèc ghÐp.

3.

Sau 4 - 6 tuÇn, chuyÓn c©y ghÐp ra ®Êt.

HiÖn nay ph−¬ng ph¸p vi ghÐp chåi ®Ønh ®ang ®−îc sö dông réng r·i ®Ó t¹o c¸c dßng Citrus s¹ch bÖnh phôc vô cho nh©n gièng th−¬ng m¹i. Vi ghÐp kÕt hîp víi xö lý nhiÖt hoÆc ho¸ chÊt Murashige vμ céng sù (1972) dïng vi ghÐp ®Ønh sinh tr−ëng ®Ó t¹o vËt liÖu s¹ch bÖnh ë Citrus, c©y con t¸i sinh ®· s¹ch c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh micoplasma vμ exocortis. N¨m 1975, Navarro vμ céng sù ®· hoμn thiÖn quy tr×nh vi ghÐp chåi ®Ønh c©y cã mói in vitro. B»ng kü thuËt nμy, kho¶ng 90 lo¹i c©y cã mói kh¸c nhau ®−îc lμm s¹ch bÖnh (Navarro vμ cs, 1988). Kü thuËt vi ghÐp ®· lo¹i trõ ®−îc hμng lo¹t bÖnh khái nguån gen c©y cã mói, vÝ dô: - Virus g©y bÖnh tristeza, psorosis - Stubborn spiroplasma - Exocortis viroid 64

- T¸c nh©n g©y bÖnh ch¶y g«m, cristacortis, impietratura Quy tr×nh vi ghÐp: -

Gèc ghÐp ®−îc chuÈn bÞ tõ h¹t nu«i cÊy in vitro trªn m«i tr−êng c¬ b¶n MS cã 1% agar. Troyer citrance th−êng ®−îc dïng lμm gèc ghÐp, cßn gèc ghÐp Etrog citron ®−îc dïng ®Ó ghÐp tÊt c¶ c¸c lo¹i chanh.

-

C©y gièng ®· nhiÔm bÖnh dïng lμm m¾t ghÐp ®−îc chuÈn bÞ nh− sau: bá l¸, gi÷ c©y ë nhiÖt ®é 32oC tõ 12-15 ngμy. Sau ®ã, t¸ch ®Ønh sinh tr−ëng kÝch th−íc 0,1- 0,2 mm tõ chåi míi h×nh thμnh vμ vi ghÐp theo kiÓu ch÷ T lén ng−îc trªn gèc ghÐp.

-

Nu«i c©y sau vi ghÐp trªn m«i tr−êng MS cã 100 mg/l myo-inositol, ®−êng 4%, thiamin HCl 0,2 mg/l, pyridoxine HCl 1mg/l, nicotinic 1mg/l, ®Æc biÖt sö dông nång ®é ®−êng sucrose, c¸c vitamin B cao víi hμm l−îng BA, IAA vμ GA3 kh¸c nhau ®Ó kÝch thÝch bËt chåi tõ ®Ønh sinh tr−ëng vi ghÐp. Tû lÖ vi ghÐp thμnh c«ng lμ 60-70% vμ c©y chuyÓn ra ®Êt ®· sèng 90%. Ch−¬ng tr×nh vi ghÐp t¹o gièng s¹ch bÖnh ë c©y cã mói ®· ®−îc triÓn khai ë

hÇu hÕt c¸c n−íc. 3.1.5. Chän t¹o gièng s¹ch bÖnh tõ ph«i v« tÝnh (tr−êng hîp c©y ¨n qu¶ cã mói Citrus) HiÖn t−îng ®a ph«i vμ øng dông trong chän t¹o gièng s¹ch bÖnh §a ph«i lμ hiÖn t−îng cã tõ hai ph«i trë lªn trong mét h¹t, ë Citrus cã hai kiÓu ®a ph«i: -

NhiÒu ph«i v« tÝnh h×nh thμnh tõ líp tÕ bμo nucellar cña no·n c©y mÑ;

-

Hai hoÆc nhiÒu ph«i h÷u tÝnh h×nh thμnh do sù ph©n chia mét trøng ®· thô tinh (hiÖn t−îng ®a ph«i cïng trøng) hoÆc do cã nhiÒu trøng cïng ®−îc thô tinh trong mét no·n (®a ph«i kh¸c trøng).

Ph«i v« tÝnh Ph«i v« tÝnh lμ ph«i ®−îc h×nh thμnh tõ tÕ bμo soma cña nucellar (kh«ng cã sù tham gia cña gi¶m ph©n vμ thô tinh gi÷a c¸c giao tö ®ùc, c¸i). Do vËy, c©y tõ ph«i v« tÝnh gièng hÖt víi c©y mÑ vÒ cÊu tróc di truyÒn vμ c¸c tÝnh tr¹ng sinh häc kh¸c (trõ tr−êng hîp cã biÕn dÞ tÕ bμo soma). Ph«i v« tÝnh cßn gäi lμ ph«i soma 65

(somatic embryo), hay ph«i sinh d−ìng (vegetative embryo), ë c©y cã mói cßn gäi lμ ph«i nucellar hay ph«i t©m. Ph«i h÷u tÝnh Ph«i ®−îc t¹o ra do thô tinh gi÷a tÕ bμo trøng vμ giao tö ®ùc (do lai hoÆc tù thô). Ph«i h÷u tÝnh cã c¸c tªn gäi ph«i sinh s¶n (generative), ph«i hîp tö (zygotic) hay ph«i giao tö (gametic). Tªn th«ng dông hiÖn nay lμ ph«i hîp tö. HiÖn t−îng ®a ph«i ë c©y cã mói ®· ®−îc nhiÒu t¸c gi¶ nghiªn cøu. Sè ph«i trung b×nh trªn mét h¹t phô thuéc chÆt chÏ vμo gièng (genotype) vμ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy. Do vËy, c¸c gièng c©y cã mói ®−îc chia thμnh gièng ®¬n ph«i vμ gièng ®a ph«i. C¸c gièng ®a ph«i còng rÊt kh¸c nhau, ë mét vμi gièng hÇu hÕt h¹t cã tõ hai ph«i trë lªn, nh−ng ë ®a sè gièng chØ cã mét tû lÖ nhá h¹t lμ ®a ph«i. C¸c ph«i trong cïng mét h¹t ®a ph«i th−êng cã kÝch th−íc vμ h×nh d¹ng l¸ mÇm rÊt kh¸c nhau. Sè l−îng ph«i trung b×nh trªn mét h¹t th−êng lín h¬n nhiÒu so víi sè c©y n¶y mÇm tõ mét h¹t. C©y th−êng h×nh thμnh tõ c¸c ph«i lín h¬n. NhiÒu thÝ nghiÖm cho thÊy ph«i v« tÝnh trong h¹t tuy kh«ng h×nh thμnh do thô tinh nh−ng sù thô phÊn vÉn cã ý nghÜa kÝch thÝch h×nh thμnh ph«i v« tÝnh. Trong mét sè tr−êng hîp, ë c¸c gièng bÊt tù hoμ hîp, cã thô phÊn nh−ng do èng phÊn kh«ng mäc ®−îc nªn thô tinh kh«ng x¶y ra. KÕt qu¶ lμ vμi h¹t lÐp ®−îc t¹o thμnh. C¸c h¹t lÐp nμy cã thÓ ®−îc t¹o ra tõ líp tÕ bμo nucellar do sù kÝch thÝch cña èng phÊn vμ do kh«ng cã thô tinh nªn néi nhò h¹t kh«ng ph¸t triÓn dÉn ®Õn lÐp (Nagai vμ Tanikawa, 1928). Trong nu«i cÊy in vitro, c¸c ph«i v« tÝnh cña h¹t lÐp cã thÓ dÔ dμng t¸i sinh thμnh c©y. Frost vμ Soost (1968) ®· tæng hîp nghiªn cøu vÒ hiÖn t−îng ®a ph«i trªn 53 gièng c©y cã mói kh¸c nhau vμ cho biÕt ®a ph«i lμ hiÖn t−¬ng phæ biÕn ë ®a sè gièng vμ loμi c©y cã mói, riªng ë 11 gièng thuéc nhãm b−ëi pumelo kh«ng thÊy hiÖn t−îng ®a ph«i. TÝnh ®a ph«i ®−îc xem nh− mét ®Æc ®iÓm ph©n biÖt b−ëi pummelo víi nhãm b−ëi grapefruit. Trong nhãm quýt C. reticulata, rÊt nhiÒu gièng bao gåm Ponkan, Satsuma... cã nhiÒu ph«i vμ tû lÖ ph«i v« tÝnh cao. Gièng quýt King (nguån gèc ch©u ¸ - mét d¹ng cam Sμnh) cã tû lÖ h¹t ®a ph«i vμ tû lÖ c©y tõ ph«i v« tÝnh thÊp, gièng Kunenbo t−¬ng tù gièng King (cã nguån gèc tõ NhËt B¶n) l¹i cã tû lÖ ®a ph«i cao (Tanaka, 1954) hay gièng Kinnow vμ Kara (gièng King lμ bè hoÆc mÑ cña hai gièng nμy) l¹i cã rÊt nhiÒu ph«i trong h¹t vμ tû lÖ c©y mäc tõ ph«i h÷u tÝnh rÊt thÊp, thËm chÝ kh«ng cã ph«i h÷u tÝnh. Gièng 66

Wilking vμ Kincy (gièng King lμ bè hoÆc mÑ cña 2 gièng nμy) l¹i lμ gièng ®¬n ph«i vμ kh«ng cã ph«i v« tÝnh. Gièng Temple vμ Clementine (lμ 2 gièng lai kh«ng râ bè mÑ) còng lμ gièng ®¬n ph«i vμ chØ cã ph«i h÷u tÝnh. RÊt nhiÒu gièng quýt lμ ®¬n ph«i (monoembryonic). Trong nhãm cam C. sinensis, sè ph«i trong h¹t th−êng trung b×nh hoÆc cao. Sè ph«i v« tÝnh th−êng kh¸ cao ë ®a sè c¸c gièng, kh«ng cã gièng ®¬n ph«i ë nhãm nμy. C¸c gièng b−ëi quý ë n−íc ta chñ yÕu thuéc nhãm pummelo ®¬n ph«i. Sù t−¬ng t¸c gi÷a ph«i v« tÝnh vμ ph«i h÷u tÝnh Trong cïng mét h¹t cã thÓ cã ®Õn tõ 1 ®Õn 3, ®«i khi 4 ph«i thËm chÝ 7 ph«i, nh−ng sè ph«i n¶y mÇm thμnh c©y con th−êng thÊp. Trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn, ph«i v« tÝnh vμ ph«i h÷u tÝnh cã thÓ c¹nh tranh víi nhau. §èi víi nhiÒu gièng, mét h¹t th−êng n¶y mÇm thμnh mét ®Õn vμi c©y tõ ph«i v« tÝnh, trong khi ®ã kh«ng thÊy ph«i h÷u tÝnh t¸i sinh thμnh c©y. Ph«i h÷u tÝnh tá ra yÕu h¬n so víi ph«i v« tÝnh. KÕt qu¶ lμ tÊt c¶ c¸c c©y mäc tõ h¹t ®Òu lμ ph«i v« tÝnh. Ng−îc l¹i, nhiÒu khi h¹t ®a ph«i nh−ng l¹i kh«ng cã ph«i v« tÝnh. Khi tiÕn hμnh thÝ nghiÖm lai ba gièng ®¬n ph«i Clementine, Wilking vμ Siamese víi phÊn hoa cña gièng cam ba l¸, trong ®ã tÝnh tr¹ng l¸ ba chÏ lμ tÝnh tr¹ng tréi, Ozsan vμ Cameron (1963) ®· nhËn ®−îc nhiÒu h¹t ®a ph«i, nh−ng tÊt c¶ c¸c ph«i ®Òu h÷u tÝnh (mang tÝnh tr¹ng tréi cña cam ba l¸). Trong rÊt nhiÒu tr−êng hîp, hai hoÆc ba ph«i trong cïng mét h¹t ®Òu lμ ph«i h÷u tÝnh. Nh÷ng ®Æc tÝnh c¬ b¶n cña c©y tõ ph«i v« tÝnh -

Gièng c©y mÑ ban ®Çu vÒ mÆt di truyÒn vμ c¸c ®Æc tÝnh n«ng häc kh¸c. Ph«i v« tÝnh b¶o tån mäi ®Æc tÝnh −u thÕ lai cña c©y mÑ nÕu mÑ cã −u thÕ lai cao.

-

Kh«ng mang theo c¸c bÖnh virus chñ yÕu mμ c©y mÑ nhiÔm ph¶i. Do vËy, c©y tõ ph«i v« tÝnh gÇn nh− s¹ch bÖnh hoμn toμn. Cho ®Õn nay, rÊt Ýt lo¹i bÖnh virus l©y truyÒn qua h¹t, ë c©y cã mói chØ thÊy cã hai lo¹i bÖnh virus, ®ã lμ blind pocket vμ ch¶y g«m (concave gum) cã kh¶ n¨ng truyÒn qua h¹t (Tucker, 1993). Trong thùc tiÔn s¶n xuÊt, t¹o c©y tõ ph«i v« tÝnh vÉn lμ mét ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng cã gi¸ trÞ trong t¹o gièng s¹ch bÖnh ë c©y cã mói.

C¸c ph−¬ng ph¸p nhËn biÕt c©y tõ ph«i v« tÝnh 1.

Cã sù gièng hÖt nhau gi÷a c©y con vμ c©y mÑ ngay c¶ trong c¸c tr−êng hîp sau: 67

2.

+

C©y mÑ lμ c©y lai dÞ hîp tö

+

C©y mÑ ®−îc thô phÊn chÐo víi mét gièng cho phÊn kh¸c

+

C©y mÑ lμ gièng tam béi, lÖch béi...

Khi so s¸nh c¸c c©y con tõ mét dßng lai F1 (lai víi bè mÑ kh¸c nhau), kh«ng thÊy cã sù ph©n ly tÝnh tr¹ng hoÆc biÕn ®æi di truyÒn rÊt Ýt trong quÇn thÓ c©y F2: +

Kh«ng thÊy cã ®Æc tÝnh tréi ë c©y con khi lai c©y mÑ mang gen lÆn víi c©y bè mang gen tréi (gen chØ thÞ). VÝ dô, trong tr−êng hîp bè lμ cam ba l¸ mang gen tréi lμ l¸ cã ba chÏ lai víi c¸c c©y mÑ kh¸c nhau, con sinh ra kh«ng cã tÝnh tr¹ng l¸ ba chÏ sÏ lμ c©y tõ ph«i v« tÝnh.

+

Cã hiÖn t−îng h÷u thô cao kh«ng b×nh th−êng ë c¸c c©y lÖch béi (aneuploid), c©y tam béi hoÆc c©y lai xa kh¸c loμi. C¸c c©y nμy th«ng th−êng lμ bÊt dôc, kh«ng t¹o ®−îc h¹t b»ng con ®−êng h÷u tÝnh do c¸c giao tö ®ùc vμ c¸i ®Òu v« sinh.

3.

§Ó ph©n biÖt ph«i v« tÝnh hoÆc c©y tõ ph«i v« tÝnh, ngμy nay ng−êi ta sö dông c¸c ph−¬ng ph¸p sinh ho¸ vμ sinh häc ph©n tö kh¸c nhau nh− ph©n tÝch isozyme, chØ thÞ ph©n tö (DNA-hybridization, DNA-fingerprinting...), ®Ó thu ®−îc kÕt qu¶ nhanh, nh¹y vμ chÝnh x¸c.

3.1.6. C«ng nghiÖp nu«i cÊy m« thùc vËt TÕ bμo thùc vËt cã tÝnh "toμn n¨ng" nghÜa lμ cã kh¶ n¨ng t¸i sinh thμnh c©y hoμn chØnh. §Æc tÝnh nμy ®−îc sö dông réng r·i trong nu«i cÊy tÕ bμo, m«, c¬ quan thùc vËt vμ nu«i cÊy tÕ bμo trÇn in vitro trªn c¸c m«i tr−êng nh©n t¹o. Trong ®iÒu kiÖn thÝch hîp, nh÷ng tÕ bμo nμy sÏ ®−îc kÝch thÝch ®Ó ph©n hãa, ph¸t sinh h×nh th¸i, t¸i sinh ph«i hoÆc ph¸t sinh c¬ quan. Nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« ®· trë thμnh mét trong nh÷ng ph−¬ng thøc quan träng nhÊt ®Ó nh©n nhanh, ®Æc biÖt lμ víi c©y trång khã nh©n b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng. Tèc ®é ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ nu«i cÊy m« ®· ®−îc thóc ®Èy kh«ng ngõng nhê th−¬ng m¹i hãa. HiÖn nay, vi nh©n gièng ®−îc øng dông réng r·i nhÊt trªn c¸c ®èi t−îng hoa c©y c¶nh nh− lan, ®ång tiÒn, cÈm ch−íng, cóc, lily cïng nhiÒu loμi c©y c¶nh, c©y l©m nghiÖp vμ d−îc liÖu kh¸c. HÖ thèng vi nh©n gièng còng ®−îc x©y dùng thμnh c«ng ë c¸c lo¹i c©y thùc phÈm, c©y

68

c«ng nghiÖp, c©y ¨n qu¶ nh− gõng, khoai t©y, m¨ng t©y, tre, chuèi, lª, d©u t©y, mÝa vμ hiÖn nay ®ang dÇn dÇn thay thÕ c¸c ph−¬ng ph¸p sinh d−ìng. Tõ khi b¾t ®Çu xuÊt hiÖn c«ng nghiÖp vi nh©n gièng vμo ®Çu nh÷ng n¨m 70, sè l−îng c¸c phßng thÝ nghiÖm vi nh©n gièng th−¬ng phÈm ®· t¨ng lªn nhanh chãng. Sù toμn cÇu hãa cña c«ng nghiÖp vi nh©n gièng ®· diÔn ra rÊt tÝch cùc trong nh÷ng n¨m 80. C¸c phßng thÝ nghiÖm vi nh©n gièng th−¬ng m¹i ®· ®−îc thiÕt lËp tr−íc tiªn ë BØ, Canada, Ph¸p, Indonesia, Israel, ý, NhËt, Malaysia, Niu Dilan, Srilanca, Th¸i Lan vμ Mü. Sù më réng cña c«ng nghiÖp vi nh©n gièng kh«ng chØ gãp phÇn t¨ng n¨ng suÊt c©y trång mμ cßn thóc ®Èy viÖc c«ng nghÖ hãa c¸c mÆt hμng n«ng nghiÖp. Tæng sè c¸c ®¬n vÞ nu«i cÊy m« trªn toμn thÕ giíi lμ kho¶ng 250 triÖu ®¬n vÞ, riªng ch©u ¸ s¶n xuÊt kho¶ng 50 triÖu ®¬n vÞ (Chu, 1992). C¸c loμi c©y trång ®ang ®−îc vi nh©n gièng trªn thÞ tr−êng thÕ giíi lμ: -

C¸c loμi c©y c¶nh

-

C¸c loμi hoa, ®Æc biÖt lμ hoa lan ®−îc vi nh©n gièng th−¬ng m¹i ®Çu tiªn ë Th¸i Lan. C¸c chi hoa lan ®−îc cÊy m« vμ sö dông cho hoa c¾t th−¬ng phÈm lμ:

Arachis,

Aranda,

Ascocenda,

Cattleya,

Cymbidium,

Cypripedium,

Oncidium, Mokara, Phalaenopsis vμ Vanda. -

C¸c c©y d¹ng hμnh, gåm c¸c lo¹i c©y hoa, c©y trång trong chËu hoÆc v−ên −¬m.

-

C¸c dßng bè mÑ ®Ó s¶n xuÊt h¹t lai, gåm cã c¸c c©y hoa vμ c©y rau, ®Æc biÖt lμ c¸c c©y bÊt thô ®ùc, c©y bè mÑ ®a béi vμ c¸c dßng dÞ hîp tö.

-

C¸c loμi c©y rau, chØ mét vμi loμi ®−îc s¶n xuÊt ë quy m« th−¬ng m¹i, trong ®ã cã m¨ng t©y, tái, gõng, khoai t©y vμ d©u t©y.

-

C¸c loμi c©y ¨n qu¶ gåm chuèi, lª, d©u t©y vμ c©y ¨n qu¶ th©n gç lín nh− mÝt.

-

C¸c c©y lÊy cñ.

-

C¸c lo¹i c©y trång kh¸c nh− døa, hä dÇu, mÝa, c¸c lo¹i c©y c«ng nghiÖp, l©m nghiÖp kh¸c.

3.1.6.1.

Nh÷ng −u ®iÓm vμ h¹n chÕ cña c«ng nghÖ vi nh©n gièng

¦u ®iÓm cña vi nh©n gièng 69

-

§−a ra s¶n phÈm nhanh h¬n: Tõ mét c©y −u viÖt bÊt kú ®Òu cã thÓ t¹o ra mét quÇn thÓ cã ®é ®ång ®Òu cao víi sè l−îng kh«ng h¹n chÕ, phôc vô s¶n xuÊt th−¬ng m¹i, dï c©y ®ã lμ dÞ hîp vÒ mÆt di truyÒn.

-

Nh©n nhanh víi hÖ sè nh©n gièng cao: Trong hÇu hÕt c¸c tr−êng hîp, c«ng nghÖ vi nh©n gièng ®¸p øng tèc ®é nh©n nhanh cao, tõ 1 c©y trong vßng 1-2 n¨m cã thÓ t¹o thμnh hμng triÖu c©y.

-

S¶n phÈm c©y gièng ®ång nhÊt: Vi nh©n gièng vÒ c¬ b¶n lμ c«ng nghÖ nh©n dßng. Nã t¹o ra quÇn thÓ cã ®é ®Òu cao dï xuÊt ph¸t tõ c©y mÑ cã kiÓu gen dÞ hîp hay ®ång hîp.

-

TiÕt kiÖm kh«ng gian: V× hÖ thèng s¶n xuÊt hoμn toμn trong phßng thÝ nghiÖm, kh«ng phô thuéc vμo thêi tiÕt vμ c¸c vËt liÖu khëi ®Çu cã kÝch th−íc nhá. MËt ®é c©y t¹o ra trªn mét ®¬n vÞ diÖn tÝch lín h¬n rÊt nhiÒu so víi s¶n xuÊt trªn ®ång ruéng vμ trong nhμ kÝnh theo ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng.

-

N©ng cao chÊt l−îng c©y gièng: Nu«i cÊy m« lμ mét ph−¬ng ph¸p h÷u hiÖu ®Ó lo¹i trõ virus, nÊm khuÈn khái c¸c c©y gièng ®· nhiÔm bÖnh. C©y gièng s¹ch bÖnh t¹o ra b»ng cÊy m« th−êng t¨ng n¨ng suÊt 15 - 30% so víi gièng gèc.

-

Kh¶ n¨ng tiÕp thÞ s¶n phÈm tèt h¬n vμ nhanh h¬n: C¸c d¹ng s¶n phÈm kh¸c nhau cã thÓ t¹o ra tõ hÖ thèng vi nh©n gièng nh− c©y con in vitro (trong èng nghiÖm) hoÆc trong bÇu ®Êt. C¸c c©y gièng cã thÓ ®−îc b¸n ë d¹ng c©y, cñ bi hay lμ th©n cñ.

-

Lîi thÕ vÒ vËn chuyÓn: C¸c c©y con kÝch th−íc nhá cã thÓ vËn chuyÓn ®i xa dÔ dμng vμ thuËn lîi, ®ång thêi c©y con t¹o ra trong ®iÒu kiÖn v« trïng ®−îc x¸c nhËn lμ s¹ch bÖnh. Do vËy, b¶o ®¶m an toμn, ®¸p øng c¸c qui ®Þnh vÒ vÖ sinh thùc vËt quèc tÕ.

-

S¶n xuÊt quanh n¨m: Qu¸ tr×nh s¶n xuÊt cã thÓ tiÕn hμnh vμo bÊt kú thêi gian nμo, kh«ng phô thuéc mïa vô.

H¹n chÕ cña vi nh©n gièng -

H¹n chÕ vÒ chñng lo¹i s¶n phÈm: Trong ®iÒu kiÖn kü thuËt hiÖn nay, kh«ng ph¶i tÊt c¶ c©y trång ®Òu ®−îc nh©n gièng th−¬ng phÈm b»ng vi nh©n gièng. NhiÒu c©y trång cã gi¸ trÞ kinh tÕ hoÆc quý hiÕm vÉn ch−a thÓ nh©n nhanh ®Ó ®¸p øng nhu cÇu th−¬ng m¹i hoÆc b¶o qu¶n nguån gen. NhiÒu vÊn ®Ò lý

70

thuyÕt liªn quan ®Õn nu«i cÊy vμ t¸i sinh tÕ bμo thùc vËt in vitro vÉn ch−a ®−îc gi¶i ®¸p. -

Chi phÝ s¶n xuÊt cao: Vi nh©n gièng ®ßi hái nhiÒu lao ®éng kü thuËt thμnh th¹o. Do ®ã, gi¸ thμnh s¶n phÈm cßn kh¸ cao so víi c¸c ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng nh− chiÕt, ghÐp vμ nh©n gièng b»ng h¹t.

-

HiÖn t−îng s¶n phÈm bÞ biÕn ®æi kiÓu h×nh: C©y con nu«i cÊy m« cã thÓ sai kh¸c víi c©y mÑ ban ®Çu do hiÖn t−îng biÕn dÞ tÕ bμo soma. KÕt qu¶ lμ c©y con kh«ng gi÷ ®−îc c¸c ®Æc tÝnh quý cña c©y mÑ. Tû lÖ biÕn dÞ th−êng thÊp ë giai ®o¹n ®Çu nh©n gièng, nh−ng sau ®ã cã chiÒu h−íng t¨ng lªn khi nu«i cÊy kÐo dμi vμ t¨ng hμm l−îng c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng. HiÖn t−îng biÕn dÞ nμy cÇn ®−îc l−u ý kh¾c phôc nh»m ®¶m b¶o s¶n xuÊt hμng triÖu c©y gièng ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn.

3.1.6.2.

Qu¸ tr×nh s¶n xuÊt c©y cÊy m«

Qu¸ tr×nh vi nh©n gièng th«ng th−êng gåm n¨m giai ®o¹n chÝnh, mçi mét giai ®o¹n cã nh÷ng yªu cÇu riªng. Giai ®o¹n 1: ChuÈn bÞ c©y lμm vËt liÖu gèc -

Chän c©y mÑ ®Ó lÊy mÉu, th−êng lμ c©y −u viÖt, kháe, cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao.

-

Chän c¬ quan ®Ó lÊy mÉu th−êng lμ chåi non, ®o¹n th©n cã chåi ngñ, hoa non, l¸ non v.v…

-

M« chän ®Ó nu«i cÊy th−êng lμ c¸c m« cã kh¶ n¨ng t¸i sinh cao, s¹ch bÖnh, gi÷ ®−îc c¸c ®Æc tÝnh sinh häc quý cña c©y mÑ vμ æn ®Þnh. Tïy ®iÒu kiÖn, giai ®o¹n nμy cã thÓ kÐo dμi 3 - 6 th¸ng.

Giai ®o¹n 2: ThiÕt lËp hÖ thèng nu«i cÊy v« trïng -

Khö trïng bÒ mÆt mÉu vËt vμ chuÈn bÞ m«i tr−êng nu«i cÊy.

-

CÊy mÉu v« trïng vμo m«i tr−êng nh©n t¹o trong èng nghiÖm hoÆc b×nh nu«i. Giai ®o¹n nu«i cÊy nμy gäi lμ cÊy mÉu in vitro.

-

C¸c mÉu nu«i cÊy nÕu kh«ng bÞ nhiÔm khuÈn, nÊm hoÆc virus sÏ ®−îc l−u gi÷ trong phßng víi ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng phï hîp. Sau mét thêi gian nhÊt ®Þnh, tõ mÉu nu«i cÊy b¾t ®Çu xuÊt hiÖn c¸c côm tÕ bμo hoÆc c¬ quan (chåi, côm chåi, rÔ) hoÆc ph«i v« tÝnh cã ®Æc tÝnh gÇn nh− ph«i h÷u tÝnh. Giai ®o¹n 2 th−êng yªu cÇu 2 - 12 th¸ng hoÆc Ýt nhÊt 4 lÇn cÊy chuyÓn. 71

Giai ®o¹n 3: Nh©n nhanh chåi -

Thμnh phÇn vμ ®iÒu kiÖn m«i tr−êng ph¶i ®−îc tèi −u hãa nh»m ®¹t môc ®Ých nh©n nhanh.

-

Quy tr×nh cÊy chuyÓn ®Ó nh©n nhanh chåi kho¶ng 1- 2 th¸ng tïy lo¹i c©y. HÖ sè nh©n nhanh lμ 2 - 8 lÇn/ 1 lÇn cÊy chuyÓn. Nh×n chung giai ®o¹n 3 th−êng yªu cÇu 10- 36 th¸ng vμ còng kh«ng nªn kÐo dμi qu¸ l©u. VÝ dô tõ ®Ønh sinh tr−ëng cña 1 c©y chuèi chän läc ban ®Çu, ng−êi ta chØ nªn nh©n kho¶ng 2000 3000 chåi sau 7 - 8 lÇn cÊy chuyÓn ®Ó tr¸nh biÕn dÞ s«ma. §èi víi c¸c c©y kh¸c nh− mÝa, hoa cóc, phong lan sau 1 n¨m cã thÓ nh©n ®−îc trªn 1 triÖu chåi tõ 1 c©y mÑ ban ®Çu.

Giai ®o¹n 4: T¹o rÔ -

C¸c chåi h×nh thμnh trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy cã thÓ ph¸t sinh rÔ tù nhiªn, nh−ng th«ng th−êng c¸c chåi nμy cÇn ph¶i cÊy chuyÓn sang mét m«i tr−êng kh¸c ®Ó kÝch thÝch t¹o rÔ. ë mét sè loμi kh¸c, c¸c chåi sÏ t¹o rÔ khi ®−îc chuyÓn trùc tiÕp ra ®Êt. Giai ®o¹n 4 th«ng th−êng cÇn 2 - 8 tuÇn.

Giai ®o¹n 5: ChuyÓn c©y ra ®Êt trång -

§©y lμ giai ®o¹n ®Çu tiªn, trong ®ã c©y ®−îc chuyÓn tõ ®iÒu kiÖn v« trïng cña phßng thÝ nghiÖm ra ngoμi tù nhiªn. §èi víi mét sè loμi cã thÓ chuyÓn chåi ch−a cã rÔ ra ®Êt, nh−ng ®a sè chØ sau khi chåi ®· ra rÔ vμ t¹o c©y hoμn chØnh míi ®−îc chuyÓn ra v−ên −¬m. Qu¸ tr×nh thÝch nghi víi ®iÒu kiÖn bªn ngoμi cña c©y cÇn sù ch¨m sãc ®Æc biÖt. V× c©y chuyÓn tõ m«i tr−êng b·o hßa h¬i n−íc sang v−ên −¬m víi nh÷ng ®iÒu kiÖn khã kh¨n h¬n, nªn v−ên −¬m cÇn ph¶i ®¸p øng c¸c yªu cÇu: +

C©y ®−îc che phñ b»ng nilon, t−íi phun s−¬ng ®¶m b¶o cung cÊp ®é Èm vμ lμm m¸t

+

Gi¸ thÓ trång c©y cã thÓ lμ ®Êt mïn hoÆc c¸c hçn hîp nh©n t¹o kh«ng chøa ®Êt, mïn c−a vμ bät biÓn. Giai ®o¹n 5 th−êng ®ßi hái 4 - 16 tuÇn

3.1.6.3.

Nh©n gièng s¹ch bÖnh

HÇu hÕt c¸c loμi cã søc sèng m¹nh mÏ, chÊt l−îng tèt nh− c©y ¨n qu¶ th−êng lμ con lai tù nhiªn hoÆc lai nh©n t¹o. VÒ b¶n chÊt di truyÒn, chóng lμ con lai dÞ hîp. Do vËy, sau khi chän ®−îc c¸c c¸ thÓ cã −u thÕ lai cao (søc sèng khoÎ, 72

n¨ng suÊt cao, thÝch nghi tèt víi m«i tr−êng sinh th¸i, chèng chÞu bÖnh) vμ −u viÖt vÒ chÊt l−îng, ng−êi ta sö dông ph−¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh ®Ó t¹o ra hμng triÖu c©y gièng nhau vÒ mÆt di truyÒn. VÝ dô, cam Navel vμ Valencia lμ nh÷ng gièng c©y cã mói næi tiÕng toμn cÇu ®· ®−îc t¹o ra b»ng con ®−êng v« tÝnh tõ mét hay mét vμi c¸ thÓ ban ®Çu. Nh©n gièng v« tÝnh lμ ph−¬ng ph¸p duy tr× kiÓu gen vμ nh÷ng ®Æc ®iÓm quý cña con lai mμ kh«ng cÇn ®Õn qu¸ tr×nh thô tinh gi÷a c¸c giao tö ®ùc vμ c¸i gièng bè mÑ. C¸c ph−¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh th«ng dông nh− ghÐp m¾t, chiÕt cμnh, gi©m cμnh th−êng kÐo theo c¸c bÖnh truyÒn nhiÔm tõ c©y mÑ sang c©y con. VÊn ®Ò nh©n v« tÝnh s¹ch bÖnh ®−îc ®Æt ra nh− mét yªu cÇu sèng cßn ®èi víi c«ng nghiÖp s¶n xuÊt mét sè gièng c©y trång nh− c©y ¨n qu¶ cã mói, d©u t©y, khoai t©y, chuèi… 3.1.7. Kü thuËt ph«i v« tÝnh vμ h¹t nh©n t¹o 3.1.7.1. Nghiªn cøu ph©n ho¸ ph«i v« tÝnh tõ tÕ bμo in vitro H¬n 200 loμi c©y trång ®· ®−îc nh©n gièng b»ng ph«i v« tÝnh (Nishimura cs, 1993). Ph«i v« tÝnh ®−îc t¸i sinh tõ c¸c tÕ bμo m« sÑo ph«i ho¸ in vitro. Ph«i v« tÝnh sau khi lμm kh« cã thÓ b¶o qu¶n l©u dμi vμ cho n¶y mÇm vμo thêi vô thÝch hîp. H¹t nh©n t¹o cã thÓ h×nh thμnh tõ ph«i v« tÝnh vμ gieo b»ng m¸y gieo h¹t. Nh©n gièng mét sè c©y l¸ nhän nh− th«ng tõ h¹t nh©n t¹o ®· ®¹t quy m« c«ng nghiÖp (Attree and Fowke, 1993). Nh©n gièng b»ng ph«i v« tÝnh cã c¸c −u ®iÓm chÝnh sau: -

HÖ sè nh©n gièng cao. C¸c m« vμ tÕ bμo sinh d−ìng nu«i cÊy in vitro cã thÓ t¹o ra ph«i v« tÝnh mét c¸ch trùc tiÕp hoÆc th«ng qua giai ®o¹n trung gian lμ m« sÑo. TÕ bμo m« sÑo cã thÓ ph©n chia theo cÊp sè nh©n vμ khi ph©n ho¸ thμnh ph«i v« tÝnh sÏ t¹o ra sè l−îng ph«i v« tÝnh khæng lå trong thêi gian ng¾n. VÝ dô, ë cμ phª ng−êi ta cã thÓ t¹o ®−îc 600.000 ph«i v« tÝnh tõ 1 gram sinh khèi ban ®Çu trong vμi th¸ng víi tû lÖ t¸i sinh c©y tõ ph«i v« tÝnh ®¹t 47% (Ducos cs, 1993).

-

Ph«i v« tÝnh chøa mét l−îng chÊt dinh d−ìng t−¬ng tù víi néi nhò cña ph«i h÷u tÝnh, cã mÇm chãp rÔ vμ chåi ®Ønh, do vËy cã thÓ n¶y mÇm trùc tiÕp thμnh c©y (Ammirrato, 1983).

-

Ph«i v« tÝnh sau khi t¹o h¹t nh©n t¹o cã thÓ b¶o qu¶n vμ l−u gi÷ dμi h¹n. 73

-

Kh¶ n¨ng c«ng nghiÖp ho¸ vμ tù ®éng ho¸ qu¸ tr×nh nh©n gièng quy m« lín, ®Æc biÖt lμ nh©n gièng b»ng bioreactor (Takayama and Akita , 1994). C¸c yÕu tè di truyÒn, ®Æc tÝnh cña m« nu«i cÊy, thμnh phÇn m«i tr−êng vμ

c¸c yÕu tè ho¸ lý kh¸c nhau cã t¸c ®éng m¹nh mÏ lªn qu¸ tr×nh ph©n ho¸ tÕ bμo thμnh ph«i v« tÝnh. Thidiazuron lμ mét chÊt cã ho¹t tÝnh cùc m¹nh ®èi víi t¹o ph«i v« tÝnh ë mét sè c©y trång, ®Æc biÖt lμ c©y l©m nghiÖp vμ c©y ¨n qu¶ (Huetteman vμ Preece, 1993), c©y chÌ (Sandal cs., 2001). Kü thuËt t¹o ph«i v« tÝnh ®· ®−îc ¸p dông thμnh c«ng trong nh©n nhanh hμng lo¹t c©y trång, vÝ dô: nh©n gièng xoan Ên §é (Azadirachta indica A. Jus.) (Murthy and Saxena, 1998), th«ng (Garin cs.,1998), ®u ®ñ (Jordan and Velozo, 1996; Castllo cs, 1998), loa kÌn (Tribulato cs.1997)... 3.1.7.2. Nghiªn cøu h¹t nh©n t¹o Murashige lμ ng−êi ®Çu tiªn ®Ò xuÊt kh¸i niÖm h¹t nh©n t¹o t¹i Héi th¶o quèc tÕ lÇn thø IV vÒ Nu«i cÊy m« vμ tÕ bμo n¨m 1978. H¹t nh©n t¹o (artificial seed) lμ mét kh¸i niÖm kh¸ réng. H¹t nh©n t¹o chñ yÕu ®−îc t¹o ra tõ ph«i v« tÝnh víi cÊu tróc t−¬ng tù nh− ph«i h÷u tÝnh. Tuy nhiªn, h¹t nh©n t¹o cã thÓ lμ chåi mÇm, chåi ®Ønh, ®èt l¸, cñ siªu nhá, protocorm (ë phong lan) ®−îc bäc b»ng mμng nh©n t¹o víi kh¶ n¨ng l−u gi÷, b¶o qu¶n vμ n¶y mÇm thμnh c©y hoμn chØnh trong ®iÒu kiÖn thÝch hîp (Ara cs., 2000; Brischia cs., 2002; Kosky cs., 2002). Mμng nh©n t¹o ®−îc lμm b»ng c¸c chÊt chiÕt tù nhiªn tõ rong biÓn (agar, caragreenan, alginate), c©y trång, chÊt g«m (chÊt dÝnh) cña h¹t hoÆc sinh khèi vi sinh nh− dextran, gellan gum. DÞch láng cña c¸c chÊt trªn ®−îc lμm cøng ho¸ khi trén hoÆc nhá giät vμo dung m«i ®iÖn ly thÝch hîp cña sulph¸t ®ång, chlorit canxi hoÆc ammonium chlorit. Bæ sung mét sè chÊt kho¸ng, chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng, c¸c chÊt diÖt nÊm khuÈn… vμo m« sèng bªn trong mμng cã thÓ mang l¹i kÕt qu¶ tèt (Wendy Shu,2001). Thªm polyethylene glycol (PEG), mét sè chÊt ®iÒu hoμ sinh tr−ëng GA3, zeatin vμo m«i tr−êng nu«i cÊy ®· lμm t¨ng ®¸ng kÓ ph©n ho¸ ph«i, sè l−îng vμ chÊt l−îng ph«i h¹t nh©n t¹o ë mét sè c©y trång (Jones and Van Staden, 2001; Fiegert cs., 2000). C¸c b−íc c¬ b¶n trong t¹o h¹t nh©n t¹o tõ ph«i v« tÝnh: -

T¹o m« sÑo ph«i ho¸ (somatic embryogenic callus)

74

-

Nu«i vμ nh©n côm tÕ bμo dÞch láng (Suspension - huyÒn phï tÕ bμo) trong b×nh tam gi¸c hoÆc bioreactor

-

Läc lÊy c¸c côm tÕ bμo ph«i ho¸ nhá hay côm tÕ bμo tiÒn ph«i, cã kÝch th−íc ®ång nhÊt b»ng l−íi läc (Läc bá c¸c côm qu¸ lín hoÆc qu¸ nhá b»ng c¸c m¾t l−íi kh¸c nhau)

-

§−a c¸c côm tÕ bμo vμo m«i tr−êng chÝn cña ph«i (Ph«i ph¸t triÓn, tÝch luü c¸c chÊt dù tr÷ vμ thuÇn thôc)

-

Lμm kh«, bäc b»ng mμng nh©n t¹o

-

B¶o qu¶n h¹t nh©n t¹o

-

Lμm cho h¹t nh©n t¹o nÈy mÇm. Ng−êi ta thÊy r»ng ph«i v« tÝnh còng tr¶i qua c¸c giai ®o¹n ph¸t triÓn nh− ph«i h÷u tÝnh: b¾t ®Çu tõ khèi tÕ bμo h×nh cÇu, chuyÓn sang d¹ng h×nh tim, h×nh thuû l«i (h×nh thu«n dμi cã r·nh), sau ®ã xuÊt hiÖn d¹ng l¸ mÇm, tÝch luü c¸c chÊt t−¬ng tù néi nhò, ®¹t träng l−îng kh« kho¶ng 1-2 mg/ ph«i (Lai and McKersie, 1994). Tû lÖ ph«i n¶y mÇm phô thuéc vμo mét sè yÕu tè nh− chÊt l−îng ph«i, nång ®é sodium alginate; nång ®é chÊt kho¸ng trong vá bäc nh©n t¹o, th−êng lμ c¸c chÊt kho¸ng víi thμnh phÇn vμ hμm l−îng ho¹t chÊt nh− ë m«i tr−êng nu«i cÊy; thêi gian xö lý h¹t trong dung dÞch CaCl2… (Castillo cs., 1998).

3.1.7.3. C«ng nghÖ bioreactor vμ t¹o ph«i h¹t nh©n t¹o trong nh©n gièng c«ng nghiÖp C«ng nghÖ bioreactor ®· ®−îc øng dông trong s¶n xuÊt tÕ bμo quy m« lín ®Ó chiÕt rót d−îc chÊt chèng ung th−. C¸c bioreactor quy m« trªn 20.000 lÝt ®· ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt c«ng nghiÖp ë mét sè n−íc (Robert and Shuler, 1997). Hai nhμ khoa häc NhËt B¶n Takayama vμ Misawa lμ nh÷ng ng−êi ®Çu tiªn c«ng bè viÖc sö dông bioreactor vμo nh©n gièng thùc vËt. Kü thuËt nh©n gièng nμy sau ®ã ®· ®−îc ¸p dông cho hμng lo¹t c©y trång nh− khoai t©y, Lilium (loa kÌn), Gladiolus (lay ¬n), Anthurium (hång m«n), Dioscorea (cñ mμi), Asparagus (m¨ng t©y), cμ phª vμ nhiÒu c©y kh¸c trong bioreactor dung tÝch tõ 1 ®Õn 2.000 lÝt. Bioreactor cã thÓ øng dông ®Ó nh©n nhanh ph«i v« tÝnh, chåi, cñ, th©n ngÇm v.v… (Takayama and Akita ,1994), vÝ dô nh©n cñ siªu nhá khoai t©y, nh©n cñ gièng loa kÌn ë NhËt B¶n (Akita and Takayama 1988), nh©n gièng cá ngät víi c«ng suÊt kho¶ng 200.000 chåi c©y trong bioreactor 500 lÝt (Takayama and Akita ,1994). Bªn c¹nh ®ã, bioreactor ®· ®−îc sö dông ®Ó nh©n nhanh hoa 75

lan hå ®iÖp Phalaenopsis th«ng qua c¸c thÓ cÊu tróc (protocorm- like body) t¹o ra tõ m¶nh l¸ (Young cs., 2000; Datta cs.,1999). Cã thÓ nãi nh©n gièng b»ng ph«i v« tÝnh, h¹t nh©n t¹o kÕt hîp víi c«ng nghÖ bioreactor cã kh¶ n¨ng t¹o ra sè l−îng c©y gièng v« h¹n tõ mét c©y ban ®Çu, ®¸p øng s¶n xuÊt th−¬ng m¹i. 3.2.

S¶n xuÊt c¸c chÊt ho¹t tÝnh sinh häc tõ thùc vËt ë quy m« lín b»ng bioreactor

3.2.1. C¸c chÊt ho¹t tÝnh sinh häc tõ thùc vËt HiÖn nay, ng−êi ta ®· x¸c ®Þnh vμi chôc ngh×n chÊt thø cÊp. C¸c chÊt nμy ®· ®−îc t¸ch chiÕt vμ nghiªn cøu cÊu tróc b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p quang phæ khèi, céng h−ëng tõ h¹t nh©n hoÆc nhiÔu x¹ tia X. C¸c chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc ë thùc vËt th−êng chia lμm ba nhãm: - C¸c chÊt thø cÊp - C¸c peptid vμ protein ho¹t tÝnh sinh häc - C¸c s¶n phÈm míi kh¸c Vai trß cña c¸c chÊt thø cÊp ®èi víi ®êi sèng c©y trång ch−a ®−îc nghiªn cøu kü nh−ng nãi chung chóng th−êng cã vai trß trong b¶o vÖ thùc vËt. C¸c chÊt nμy ®−îc tÝch luü ë kh«ng bμo cña tÕ bμo thùc vËt. RÊt nhiÒu chÊt thø cÊp lμ nguån d−îc liÖu cã gi¸ trÞ th−¬ng m¹i cao. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ng−êi ta ®· ph¸t minh ra hμng lo¹t c¸c protein vμ peptid cã ho¹t tÝnh sinh häc ë thùc vËt. C¸c chÊt nμy cã thÓ t¹o ra mét c¸ch tù nhiªn hoÆc tõ protein thùc vËt nhê thuû ph©n enzym. Ng−êi ta chia c¸c chÊt thø cÊp thμnh c¸c nhãm ®−îc thÓ hiÖn ë b¶ng 17. ChÊt thø cÊp ®−îc t¹o ra b»ng c¸c con ®−êng ph¶n øng sinh hãa kh¸c nhau, trong ®ã mçi ph¶n øng ho¸ häc ®−îc xóc t¸c bëi mét enzym ®Æc thï. C¸c gen tham gia qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt thø cÊp còng ®−îc ®iÒu khiÓn ho¹t ho¸ ë c¸c m« tÕ bμo ®Æc tr−ng vμ ë giai ®o¹n ph¸t triÓn thÝch øng cña m«. Mét vμi chÊt thø cÊp ®−îc sinh ra ë tÊt c¶ c¸c m«, nh−ng th«ng th−êng ®−îc t¹o ra ë nh÷ng tÕ bμo, m«, c¬ quan nhÊt ®Þnh. ThËm chÝ mét sè chÊt chØ cã mÆt trong c¸c bμo quan ®Æc thï cña tÕ bμo nh− mét vμi alcaloid, terpen ®−îc tæng hîp ë lôc l¹p, c¸c coniine vμ amin tæng hîp trong ty thÓ. 76

B¶ng 17 . C¸c chÊt thø cÊp ë thùc vËt bËc cao D¹ng s¶n phÈm thø cÊp

Sè l−îng c¸c chÊt trong mçi nhãm

Nhãm chÊt cã chøa nit¬: Amin Alkaloid

100 12.000

C¸c axit amin kh«ng ph¶i protein (NPAAs)

400

Cyanogenic glycoside

100

Glucosinolate

100

Nhãm chÊt kh«ng cã chøa nit¬: Monoterpene

1.000

Sesquiterpene

3.000

Diterpene

1.000

Triterpene, steroid, saponin

4.000

Tetraterpene

350

Polyketide

750

Polyacetylene

1.000

Flavonoid

2.000

Phenylpropanoid

500

3.2.2. S¶n xuÊt c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ thùc vËt b»ng cÊy m« Thùc tÕ, mét sè c©y d−îc liÖu quý rÊt khã trång hoÆc cho hμm l−îng chÊt cã gi¸ trÞ cao trong sinh khèi qu¸ thÊp nªn c¸c nhμ khoa häc ®· nghiªn cøu øng dông c«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bμo thùc vËt nh− mét c«ng cô ®Ó s¶n xuÊt c¸c chÊt ho¹t tÝnh sinh häc. C«ng nghÖ nμy bao gåm c¸c b−íc sau: -

Chän läc loμi thùc vËt hoÆc gièng c©y trång s¶n xuÊt c¸c chÊt cã gi¸ trÞ th−¬ng m¹i

-

Nu«i cÊy tÕ bμo, m« hoÆc c¬ quan t¸ch rêi in vitro t¹o sinh khèi tÕ bμo

-

G©y ®ét biÕn hoÆc chän dßng tÕ bμo soma cã kh¶ n¨ng t¹o sinh khèi lín, cã hμm l−îng ho¹t chÊt cao 77

-

ChiÕt rót, thu håi c¸c chÊt ho¹t tÝnh tõ sinh khèi Cho ®Õn nay, chØ cã mét sè Ýt c¸c qu¸ tr×nh c«ng nghÖ ®−îc øng dông s¶n

xuÊt ë quy m« pilot c«ng nghiÖp. HÇu hÕt c¸c bioreactor trong nu«i cÊy tÕ bμo thùc vËt ®−îc nghiªn cøu c¶i tiÕn tõ c¸c lo¹i bioreactor sö dông trong nu«i cÊy tÕ bμo vi sinh. TÕ bμo thùc vËt th−êng kh¸c tÕ bμo vi sinh ë c¸c ®iÓm: kÝch th−íc lín, thμnh tÕ bμo cøng, kh¶ n¨ng t¹o kh«ng bμo (vacuole) m¹nh, qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt x¶y ra chËm h¬n, h×nh th¸i vμ hÖ gen cña tÕ bμo thùc vËt nu«i cÊy (tÕ bμo dÞch láng, nu«i cÊy rÔ tãc, nu«i cÊy ph«i vμ c¬ quan) cã thÓ thay ®æi do c¸c biÕn dÞ s«ma. ViÖc lùa chän hÖ thèng bioreactor phï hîp phô thuéc vμo nhiÒu yÕu tè: lo¹i tÕ bμo, quy m« nu«i cÊy, ph−¬ng ph¸p khuÊy trén, ph−¬ng ph¸p thæi khÝ, kh¶ n¨ng sinh tr−ëng vμ trao ®æi chÊt cña tÕ bμo trong m«i tr−êng in vitro. Mçi chñng lo¹i bioreactor th−êng chØ thÝch øng víi mét dßng tÕ bμo nu«i nhÊt ®Þnh.

Kh«ng khÝ

Bät kh«ng khÝ

B×nh thæi khÝ tõ d−íi B×nh cã trôc khuÊy B¬m

B×nh l¨n trßn B¬m

B×nh nhá giät, phun s−¬ng

H×nh 1. Mét sè chñng lo¹i bioreactor kh¸c nhau dïng trong s¶n xuÊt c¸c ho¹t chÊt sinh häc 78

B¶ng 18. Mét sè lo¹i bioreactor ®· ®−îc sö dông trong nu«i cÊy tÕ bμo thùc vËt Ph−¬ng thøc nu«i cÊy Nu«i cÊy tÕ bμo dÞch láng

Nu«i cÊy rÔ tãc

Lo¹i b×nh

Quy m« (lÝt)

B×nh cã trôc khuÊy- Stirred tank

1 - 75.000

B×nh l¨n trßn - Rotating drum

2 - 1.000

Thæi khÝ tõ d−íi: Air-lift

1 - 1.500

B×nh cã trôc khuÊy - Stirred tank

1 - 20

B×nh cã trôc khuÊy c¶i tiÕn- Modified

1 - 14

stirred tank Thæi khÝ tõ d−íi : Air - lift

1 - 13

B×nh nhá giät -Droplet reactor

2 - 500

B×nh s−¬ng mï - Mist reactor

1 - 35

Nu«i cÊy c¬ quan vμ tÕ

B×nh cã trôc khuÊy - Stirred tank

1 - 10

bμo ph«i ho¸

Thæi khÝ tõ d−íi : Air - lift

0,6 - 6

Bªn c¹nh viÖc t¨ng quy m« s¶n xuÊt (t¨ng kÝch th−íc cña bioreactor), vÊn ®Ò ®Æt ra lμ ph¶i chän dßng tÕ bμo cã kh¶ n¨ng t¹o sinh khèi lín vμ hμm l−îng ho¹t chÊt cao trong sinh khèi (b¶ng 19, 20). B¶ng 19. C¸c ho¹t chÊt ®−îc s¶n xuÊt víi hμm l−îng cao trong nh÷ng dßng tÕ bμo nu«i cÊy chän läc (Curtis, 1999) Tªn ho¹t chÊt Anthocyanin

Tû lÖ ho¹t chÊt trong sinh khèi kh« (%) 20

Anthraquinone

18,7

Berberine

10,5

Jalrorrhizine

10,1

Rosmarinic axit

36

Shikonin

21,2

Stevioside

36,4

Theanine(Caffeine antagonist)

22,3

Vanillin

8,0 79

B¶ng 20. C¸c ho¹t chÊt ®−îc s¶n xuÊt quy m« lín ë mét sè loμi c©y trång (Wildi and Wink, 2001) Tªn ho¹t chÊt

Loμi c©y d−îc liÖu

T¸c gi¶ s¶n xuÊt

Anthocyanin

Euphorbia millii

Nippon Paint (NhËt)

Berberine

Coptis japonica,

Mitsui Petrochemical

Thalictrum minus

Industries (NhËt)

Betacyanin

Beta vulgaris

Nippon Shinyaku (NhËt)

Echinacea

E. purpurea, E.

Diversa (§øc)

polysaccharide

angustifolia

Gingseng saponin

Panax gingseng

Nitto Denko (NhËt)

Rosmarinic axit

Coleus blumei

Nattermann (§øc)

Sanguinarine

Papaver somniferum

Vipon Research Labs (USA)

Shikonin

Lithospermum

Mitsui Petrochemical

erythrorhizon

Industries (NhËt)

Taxus brevifolia T.

Nippon Oil (NhËt), ESCA

chinensis, Taxus sp.

genetics (USA), Phyton

Taxol

Catalytic (USA) Vanilin

Vanilla planifolia

ESCAgenetics (USA)

MÆc dï c¸c nhμ khoa häc ®· ®¹t ®−îc mét sè thμnh c«ng trong s¶n xuÊt d−îc chÊt nh−ng c«ng nghÖ bioreactor vÉn cßn ph¶i tiÕp tôc c¶i tiÕn ®Ó n©ng cao n¨ng suÊt, ®¬n gi¶n ho¸ thiÕt bÞ ®Ó gi¶m gi¸ thμnh s¶n xuÊt. HiÖn t¹i bioreactor chØ ®−îc sö dông ®Ó s¶n xuÊt c¸c chÊt cã gi¸ trÞ cao, ®¾t tiÒn hoÆc c¸c hîp chÊt kh«ng thÓ s¶n xuÊt b»ng con ®−êng kh¸c. GÇn ®©y mét h−íng ph¸t triÓn míi gäi lμ canh t¸c ph©n tö ®· ®−îc h×nh thμnh, trong ®ã c©y trång ®−îc xem nh− mét lo¹i bioreactor ®Ó s¶n xuÊt c¸c chÊt quý hiÕm. B−íc ®Çu, c¸c gen liªn quan ®Õn d−îc liÖu hoÆc chÕ phÈm c«ng nghiÖp nh− vacxin, kh¸ng thÓ, enzym... tõ ng−êi, ®éng vËt, vi sinh vËt ®· ®−îc chuyÓn vμo thùc vËt, nh÷ng chÊt nμy s¶n xuÊt ra trong c©y trång chuyÓn gen trªn ®ång ruéng hoÆc trong nhμ kÝnh.

80

3.3.

C¸c h−íng ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ tÕ bμo phôc vô chän t¹o gièng

3.3.1. Kü thuËt ®¬n béi in vitro trong c«ng t¸c gièng c©y trång Gi¸ trÞ cña c©y ®¬n béi trong c¸c nghiªn cøu di truyÒn vμ chän gièng ®· ®−îc ph¸t hiÖn tõ l©u. KÓ tõ khi Blakeslee (1921) m« t¶ c©y ®¬n béi tù nhiªn ®Çu tiªn ë Datura stramonium, c©y ®¬n béi tù nhiªn ®· ®−îc t×m thÊy ë rÊt nhiÒu loμi c©y kh¸c nhau. Tuy vËy, c¸c c©y ®¬n béi tù nhiªn xuÊt hiÖn mét c¸ch ngÉu nhiªn víi tÇn suÊt rÊt thÊp kh«ng thÓ ®¸p øng yªu cÇu cña nghiªn cøu vμ chän gièng. N¨m 1964, lÇn ®Çu tiªn trªn thÕ giíi, hai nhμ khoa häc Ên §é Guha vμ Maheshwari thμnh c«ng trong viÖc t¹o c©y ®¬n béi tõ nu«i cÊy bao phÊn in vitro c©y cμ Datura innoxia. Ngay sau ®ã, c©y ®¬n béi ®· ®−îc t¹o ra b»ng nu«i cÊy bao phÊn ë hμng lo¹t c©y trång kh¸c nhau. C¸c nhμ khoa häc ®· t×m ra nh÷ng yÕu tè quan träng ¶nh h−ëng ®Õn thμnh c«ng cña qu¸ tr×nh nu«i cÊy nh− ¶nh h−ëng cña kiÓu gen, giai ®o¹n ph¸t triÓn cña h¹t phÊn vμ c¸c ®iÒu kiÖn m«i tr−êng nu«i cÊy. Ngoμi nu«i cÊy bao phÊn, c¸c nhμ khoa häc cßn cã nh÷ng thμnh c«ng rÊt lín trong nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh, nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi. Kü thuËt t¹o c©y ®¬n béi in vitro th«ng qua kÝch thÝch tiÓu bμo tö hoÆc ®¹i bμo tö trong nu«i cÊy h¹t phÊn vμ no·n cho phÐp t¹o ra nhanh chãng hμng lo¹t c©y ®¬n béi, phôc vô ®¾c lùc cho môc ®Ých nghiªn cøu di truyÒn vμ t¹o gièng c©y trång. Hai ph−¬ng ph¸p c¬ b¶n cña kü thuËt ®¬n béi hiÖn nay lμ: -

Nu«i cÊy bao phÊn hay tiÓu bμo tö t¸ch rêi hay cßn gäi lμ nh− ph−¬ng ph¸p trinh sinh ®ùc trong èng nghiÖm (in vitro androgenesis).

-

Nu«i cÊy tÕ bμo trøng ch−a thô tinh hay cßn gäi lμ ph−¬ng ph¸p trinh sinh c¸i trong èng nghiÖm (in vitro gynogenesis). VËt liÖu ban ®Çu cho qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro t¹o c©y ®¬n béi th−êng lμ:

-

Bao phÊn, h¹t phÊn t¸ch rêi, côm hoa (ph−¬ng ph¸p nμy hay ®−îc ¸p dông cho nh÷ng loμi cã hoa nhá).

-

Cøu ph«i sau lai xa. Khi lai xa gi÷a hai loμi lóa m¹ch Hordeum vulgare vμ H. bulbosum, qu¸ tr×nh thô phÊn ph«i ®¬n béi x¶y ra do nhiÔm s¾c thÓ cña H. bulbosum bÞ lo¹i trõ, nh−ng néi nhò cña ph«i ®¬n béi l¹i kh«ng ph¸t triÓn. Sö dông ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy ph«i ®· cøu ®−îc nh÷ng ph«i nμy vμ t¹o ra hμng lo¹t c©y ®¬n béi (Jensen, 1977). 81

-

Thô tinh gi¶. §©y lμ qu¸ tr×nh thô phÊn nh−ng kh«ng x¶y ra sù thô tinh. MÆc dï vËy, tÕ bμo trøng vÉn ®−îc kÝch thÝch ph¸t triÓn thμnh c©y ®¬n béi. Hess vμ Wagner (1974) ®· tiÕn hμnh thô phÊn in vitro gi÷a Mimulus luteus víi Torenia fournieri vμ kÕt qu¶ lμ ®· t¹o ®−îc c©y ®¬n béi.

-

No·n ch−a thô tinh. Trong sè c¸c vËt liÖu trªn, bao phÊn, h¹t phÊn t¸ch rêi vμ no·n ch−a thô

tinh lμ nh÷ng nguån nguyªn liÖu quan träng, ®−îc sö dông phæ biÕn h¬n ®Ó t¹o c©y ®¬n béi. KÓ tõ thμnh c«ng ®Çu tiªn cña Guha vμ Meheshinari (1996, 1967), c¸c c©y ®¬n béi cña h¬n 247 loμi thuéc 88 chi vμ 34 hä thùc h¹t kÝn ®· ®−îc t¹o ra tõ nu«i cÊy bao phÊn vμ h¹t phÊn (Bajaj, 1990). C©y ®¬n béi tõ nu«i cÊy no·n h×nh thμnh theo kiÓu trinh sinh c¸i. T¹i Trung Quèc, c«ng nghÖ ®¬n béi ®· ®−îc triÓn khai cã hÖ thèng trªn quy m« lín vμ cã ®Þnh h−íng chiÕn l−îc râ rμng trong t¹o gièng míi. H¬n mét ngh×n c¬ së nu«i cÊy bao phÊn ®· ho¹t ®éng trªn toμn quèc tõ nh÷ng n¨m 1970, kÕt qu¶ ®· t¹o ®−îc trªn 100 gièng lóa míi trong mét thêi gian ng¾n. Trong ®ã, gièng lóa n−íc vμ lóa m× míi t¹o ra tõ kü thuËt ®¬n béi ®· më réng s¶n xuÊt trªn diÖn tÝch vμi triÖu ha. T¹i TriÒu Tiªn, kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn ®· t¹o ra 42 gièng lóa míi (Sasson,1993; Jain cs., 1997). ¦u thÕ cña c¸c ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy nμy lμ tÊt c¶ c¸c c©y t¹o thμnh ®Òu cã nguån gèc tõ tiÓu bμo tö hoÆc ®¹i bμo tö, v× vËy c©y con nhËn ®−îc sÏ lμ c©y ®¬n béi hoÆc c©y nhÞ béi ®ång hîp tö tuyÖt ®èi víi c¸c cÆp nhiÔm s¾c thÓ t−¬ng ®ång hoμn toμn gièng nhau (trõ tr−êng hîp ®ét biÕn). C©y nhÞ béi thu ®−îc lμ do qu¸ tr×nh nhÞ béi ho¸ tù nhiªn cña h¹t phÊn ®¬n béi trong nu«i cÊy hoÆc xö lý ®a béi ho¸ b»ng thùc nghiÖm. 3.3.1.1. T¹o c©y tõ h¹t phÊn cña c¸c dßng lai F1 ý nghÜa: Kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn vμ h¹t phÊn trªn m«i tr−êng tæng hîp ®· ®−îc sö dông réng r·i vμo nhiÒu môc ®Ých kh¸c nhau. KÕt qu¶ c«ng bè gÇn ®©y trªn thÕ giíi còng nh− trong n−íc cho thÊy: ph−¬ng ph¸p t¹o c©y tõ h¹t phÊn cña c¸c dßng lai F1 kh«ng chØ rót ng¾n thêi gian t¹o gièng mμ cßn ®¬n gi¶n hãa qu¸ tr×nh chän gièng.

82

VÝ dô: Mét gièng mang gen A chèng chÞu mét bÖnh nÊm lai víi mét gièng mang gen B còng chèng chÞu bÖnh do mét lo¹i nÊm kh¸c g©y ra (h×nh ). Theo s¬ ®å, b»ng ph−¬ng ph¸p t¹o c©y tõ h¹t phÊn sÏ nhËn ®−îc bèn kiÓu gen (genotype) ®ång hîp kh¸c nhau, trong ®ã x¸c suÊt xuÊt hiÖn kiÓu gen chèng ®−îc c¶ hai lo¹i bÖnh nÊm (AABB) lμ 1/4. NÕu so víi ph−¬ng ph¸p chän läc th«ng th−êng th× x¸c suÊt xuÊt hiÖn kiÓu gen AABB lμ 1/16 (b¶ng 21). MÆt kh¸c, nhμ chän gièng sÏ kh«ng thÓ ph©n biÖt ®−îc c©y ®ång hîp AABB víi c¸c c©y dÞ hîp nh− AABb, AaBb v× chóng ®Òu gièng nhau vÒ kiÓu h×nh (phenotype). Do ®o b¾t buéc nhμ chän gièng ph¶i tiÕp tôc chän läc ë c¸c thÕ hÖ tiÕp theo. Kinh nghiÖm cho thÊy b»ng ph−¬ng ph¸p chän läc th«ng th−êng cho ®Õn ®êi thø n¨m, ng−êi ta vÉn ch−a chän ®−îc c¸c dßng ®ång hîp tö mong muèn ë c¸c gièng tù thô phÊn. C©y bè

AAbb x aaBB

C©y F1

AaBb

AB

Ab

C©y mÑ

aB

ab

KiÓu gen cña h¹t phÊn

AB

Ab

aB

ab

KiÓu gen cña c©y ®¬n béi

AABB

AAbb

aaBB

aabb

KiÓu gen cña c©y nhÞ béi ho¸ cã nguån gèc h¹t phÊn H×nh 2. T¹o c©y tõ h¹t phÊn

83

B¶ng 21. C¸c kiÓu gen cña c©y F2 KiÓu gen giao tö c¸i

AB

Ab

aB

ab

AB

AABB

AABb

AaBB

AaBb

Ab

AABb

AAbb

AaBb

Aabb

aB

AaBB

AaBb

aaBB

aaBb

ab

AaBb

Aabb

aaBb

aabb

KiÓu gen giao tö ®ùc

Tr−êng hîp tæng qu¸t, nÕu kiÓu gen cña c©y F1 lμ dÞ hîp tõ mét gen ®Õn n gen (c¸c gen nμy kh«ng n»m trªn cïng mét nhãm liªn kÕt) th× ë c©y F2 sÏ ph©n ly tÝnh tr¹ng theo b¶ng 22. B¶ng 22. Sù ph©n ly tÝnh tr¹ng cña c¸c c©y F2 dÞ hîp N

2n

3n

4n

1

2

3

4

2

4

9

16

3

8

27

64

4

16

81

256

...

…

…

…

12

4.096

531.441

16.777.216

...

…

…

…

n:

sè gen cã chøa c¸c alen kh¸c nhau ë hai nhiÔm s¾c thÓ ®ång d¹ng

2n:

sè giao tö kh¸c nhau vÒ hÖ gen (genome); hoÆc sè kiÓu gen ®ång hîp

nhËn ®−îc ë F2; hoÆc sè kiÓu gen ®ång hîp cã thÓ nhËn ®−îc b»ng ph−¬ng ph¸p t¹o c©y tõ h¹t phÊn ë F2. 3n:

Sè kiÓu gen kh¸c nhau nhËn ®−îc ë F2

4n:

Tæng sè kiÓu gen nhËn ®−îc ë F2 theo lý thuyÕt

VÝ dô ë lóa cã 12 cÆp nhiÔm s¾c thÓ 2n = 24. NÕu tÊt c¶ c¸c nhiÔm s¾c thÓ ®ång d¹ng ®Òu kh«ng gièng nhau tõng ®«i mét th× ë F2 ng−êi ta sÏ thu ®−îc 531.441 kiÓu gen kh¸c nhau, trong ®ã cã 4.096 kiÓu gen ®ång hîp. V× vËy, trong 84

ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng, nhμ chän gièng ph¶i rÊt tinh tÕ vμ ph¶i qua nhiÒu thÕ hÖ míi cã thÓ chän läc ®−îc mét vμi d¹ng ®ång hîp mang nh÷ng ®Æc ®iÓm mong muèn. X¸c suÊt chän läc trong tr−êng hîp nμy ë F2 sÏ lμ: X= 1/16.777.216 (X lμ sè dßng ®ång hîp tö cÇn chän) so víi tr−êng hîp c©y tõ h¹t phÊn cã thÓ thu ®−îc 4.096 dßng thuÇn kh¸c nhau: th× x¸c suÊt lμ X = 1/4.096. Ngoμi ra, ng−êi chän gièng cã thÓ dÔ dμng ph©n biÖt c¸c kiÓu gen kh¸c nhau v× ë tr¹ng th¸i ®ång hîp, c¸c ®Æc tÝnh kiÓu h×nh ®−îc biÓu hiÖn râ rÖt. Nh− vËy, b»ng ph−¬ng ph¸p t¹o c©y tõ h¹t phÊn cã thÓ rót ng¾n thêi gian vμ ®¬n gi¶n hãa qu¸ tr×nh chän gièng. Cho tíi nay ng−êi ta ®· biÕt hai tr−êng hîp ph¸t triÓn kh¸c nhau cña c©y tõ h¹t phÊn nu«i cÊy in vitro: 1. C©y xuÊt hiÖn th¼ng tõ h¹t phÊn kh«ng qua giai ®o¹n m« sÑo VÝ dô: ë c¸c lo¹i c©y cμ Datura innoxia, thuèc l¸ Nicotinna tabacum, c¶i dÇu Brassica napus ... 2. C©y xuÊt hiÖn tõ h¹t phÊn qua giai ®o¹n m« sÑo VÝ dô: ë c¸c loμi b¾p c¶i Brassica oleracea, lóa Oryza sativa, lóa m¹ch Hordeum vulgare, ng« Zea mays, lóa m× Triticum satium... C©y thuèc l¸ lμ vÝ dô ®iÓn h×nh cho tr−êng hîp thø nhÊt: c¸c c©y ®ång hîp tö ph¸t triÓn tõ dßng lai F1 theo s¬ ®å sau: Xö lý colchicine Bao phÊn hoÆc h¹t phÊn

C©y ®¬n béi

C©y nhÞ béi M« sÑo

ë thuèc l¸, ng−êi ta cã thÓ t¹o c©y nhÞ béi b»ng hai ph−¬ng ph¸p xö lý c©y ®¬n béi b»ng colchicine (Tanaka M., Nakata, 1969) hoÆc: 1. T¹o m« sÑo tõ c¸c bé phËn kh¸c nhau cña c©y ®¬n béi 2. T¹o c©y tõ m« sÑo trªn m«i tr−êng thÝch hîp Ph−¬ng ph¸p nμy dùa trªn hiÖn t−îng tù ®a béi hãa cña tÕ bμo trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro. LÇn ®Çu tiªn Nitsch vμ céng sù (1969) øng dông ®Ó nhËn ®−îc c©y thuèc l¸ nhÞ béi tõ m« sÑo ®¬n béi. Sau ®ã nhiÒu nhμ khoa häc kh¸c còng øng dông ph−¬ng ph¸p cña Nitsch ®Ó nhËn c¸c dßng nhÞ béi ®ång hîp tö (Kasperbauer vμ Collins, 1972; Iman vμ Ternovski, 1975).

85

B»ng ph−¬ng ph¸p trªn, ng−êi ta ®· chän ®−îc mét sè gièng thuèc l¸ cã n¨ng suÊt cao vμ chèng chÞu bÖnh. ë lóa vμ mét sè c©y thuéc hä Gramineae, c©y ®ång hîp xuÊt hiÖn theo s¬ ®å sau: C©y 1n: Xö lý colchicine Bao phÊn nu«i

M« sÑo 1n, 2n,

cÊy in vitro

3n, 4n, 5n, ...

C©y 2n

C©y ®a béi kh¸c H×nh 3. T¸i sinh m« sÑo vμ c©y lóa tõ nu«i cÊy bao phÊn in vitro Nisch vμ Mitsuoka (1969), Niizeki vμ Oono (1971), Woo vμ Chen (1982) ®· quan s¸t thÊy m« sÑo vμ c©y lóa t¸i sinh tõ h¹t phÊn in vitro tån t¹i ë c¸c møc béi thÓ rÊt kh¸c nhau. KÕt qu¶ nghiªn cøu trªn c©y lóa qua nhiÒu lÇn quan s¸t cho thÊy møc béi thÓ ë m« sÑo míi xuÊt hiÖn d−íi 5 ngμy nh− sau: ®¬n béi 78,38%; nhÞ béi 11,74%, sè cßn l¹i lμ m« sÑo ë c¸c møc ®a béi kh¸c tõ 3n ®Õn 5n. C©y lóa xuÊt hiÖn tõ m« sÑo còng cã møc ®a béi thÓ kh¸c nhau, trong sè 168 c©y nhËn ®−îc tõ h¹t phÊn cã 62% lμ c©y nhÞ béi, 35% c©y ®¬n béi, sè cßn l¹i lμ tam béi. Mét sè t¸c gi¶ kh¸c còng ®· nhËn ®−îc h¬n 50% c©y nhÞ béi tù nhiªn tõ h¹t phÊn khi nu«i cÊy bao phÊn in vitro. C¸c c©y nhÞ béi nμy lμ ®ång hîp, c¸c thÕ hÖ sau ®ã rÊt ®ång ®Òu, gièng nhau vμ gièng c©y mÑ ë mäi ®Æc ®iÓm quan s¸t. KÕt hîp víi ViÖn C©y l−¬ng thùc vμ C©y thùc phÈm (Bé N«ng nghiÖp vμ Ph¸t triÓn N«ng th«n), ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®· tiÕn hμnh nghiªn cøu t¹o c©y lóa tõ h¹t phÊn cña c¸c dßng lai F1 vô mïa n¨m 1977, h¹t cña c¸c c©y nμy ®· ®−îc thu ho¹ch vμ gieo vμo vô mïa n¨m sau còng cho ra c¸c c©y rÊt ®ång ®Òu. Nh− vËy, chØ sau mét n¨m chóng t«i ®· nhËn ®−îc nhiÒu dßng ®ång hîp tö tõ c¸c dßng lai (§ç N¨ng VÞnh vμ CS, 1979). 3.3.1.2. Nghiªn cøu t¹o c©y tõ h¹t phÊn cña c¸c gièng thuÇn KÕt qu¶ nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy mét sè gièng lóa mÆc dï ®· ®−îc thuÇn hãa l©u n¨m vμ sinh s¶n b»ng tù phèi vÉn cã thÓ tån t¹i ë møc dÞ hîp tö nhÊt ®Þnh. §· nhËn ®−îc c¸c dßng lóa kh¸c nhau tõ h¹t phÊn cña cïng mét gièng: gièng c−êm vμ gièng 63 - 83. Nu«i cÊy bao phÊn gièng c−êm chóng t«i ®· 86

nhËn ®−îc mét sè dßng c−êm kh¸c nhau vÒ chiÒu cao c©y vμ thêi gian sinh tr−ëng, cã dßng c−êm h¹t cã r©u rÊt dμi. Nu«i cÊy bao phÊn gièng 63 - 83 chóng t«i ®· nhËn ®−îc dßng 63 - 83 lïn, ra hoa kÕt h¹t b×nh th−êng, chiÒu cao c©y chØ b»ng mét nöa so víi chÝnh gièng 63 - 83. Nh− vËy, b»ng ph−¬ng ph¸p t¹o c©y tõ h¹t phÊn c¸c dßng lai hoÆc tõ c¸c gièng thuÇn, ng−êi ta cã thÓ nhËn ®−îc c¸c dßng ®ång hîp tö kh¸c nhau (do ph©n ly hoÆc do ®ét biÕn). C¸c dßng nμy cã thÓ lμm nguyªn liÖu cho nghiªn cøu di truyÒn chän gièng. NhiÒu t¸c gi¶ n−íc ngoμi còng th«ng b¸o nhËn ®−îc kÕt qu¶ t−¬ng tù. 3.3.1.3. Nghiªn cøu ®ét biÕn, g©y ®ét biÕn ë c¸c d¹ng ®¬n béi vμ chän läc Nu«i cÊy vμ t¸i sinh c©y tõ c¸c d¹ng ®¬n béi kh¸c nhau (h¹t phÊn, tÕ bμo ®¬n, tÕ bμo trÇn, m« sÑo ®¬n béi) kÕt hîp víi kü thuËt ®ét biÕn vμ chän dßng cã thÓ cung cÊp nguyªn liÖu quý cho nghiªn cøu trao ®æi chÊt vμ di truyÒn chän gièng. V× tÕ bμo ®¬n béi chØ chøa mét ®¬n vÞ gen nªn kü thuËt ®ét biÕn cã thÓ lμm thay ®æi hoÆc mÊt chøc n¨ng gen kh«ng cã sù bæ trî cña c¸c alen kh¸c. C¸c ®ét biÕn lÆn do vËy còng ®−îc biÓu hiÖn ngay tõ ®Çu. Bªn c¹nh ®ã c©y nhÞ béi t¸i sinh tõ c¸c tÕ bμo ®¬n béi sÏ hoμn toμn ®ång hîp vμ kh«ng bÞ kh¶m nh− trong tr−êng hîp xö lý ®ét biÕn c¸c d¹ng nhÞ béi vμ ®a béi. B»ng kü thuËt g©y ®ét biÕn c¸c d¹ng ®¬n béi, cã thÓ chän ra c¸c dßng tÕ bμo vμ c©y chèng chÞu ®éc tè do nÊm vμ vi khuÈn g©y bÖnh tiÕt ra, c¸c dßng tÕ bμo vμ c©y cã ®ét biÕn sinh hãa hoÆc c¸c dßng tÕ bμo cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt mét l−îng lín s¶n phÈm thø cÊp quan träng nh− alcaloid, chÊt th¬m, c¸c lo¹i nhùa vμ enzim sö dông trong c«ng nghiÖp, y häc. C©y ®¬n béi (l¸, ®Ønh sinh tr−ëng)

TÕ bμo trÇn (1n) TÕ bμo ®¬n (1n) §−a vμo m«i tr−êng chän läc

T¸c nh©n g©y ®ét biÕn

C¸c dßng tÕ bμo ®ét biÕn 1n, 2n...

C©y 1n Bao phÊn hoÆc h¹t phÊn C©y 2n H×nh 4. S¬ ®å g©y ®ét biÕn c¸c d¹ng ®¬n béi 87

Kü thuËt g©y ®ét biÕn, kü thuËt chän dßng tÕ bμo, kÕt hîp víi ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bμo dÞch láng vμ t¹o c©y in vitro ®· ph¸t triÓn m¹nh ngay tõ nh÷ng n¨m ®Çu cña thËp niªn 70 víi kÕt qu¶ rÊt kh¶ quan. Ng−êi ta ®· chän ra c¸c dßng tÕ bμo chèng chÞu ®−îc c¸c chÊt kh¸ng sinh, ®éc tè nÊm vμ vi khuÈn g©y bÖnh. Binding H., Bingding K., vμ Straub J. (1970) ®· nhËn ®−îc m« sÑo chèng chÞu streptomycine khi nu«i cÊy Petunia hybrida ®¬n béi. Carlson (1973) còng ®· t¹o ®−îc dßng tÕ bμo chèng chÞu chÊt t−¬ng tù methionine (methionine analogue) lμ methionine sulphocimine, cã cÊu tróc gÇn víi ®éc tè cña vi khuÈn g©y bÖnh Pseudomonas tabaci. C©y tõ dßng tÕ bμo chèng chÞu nμy ®· cã kh¶ n¨ng chèng bÖnh tèt h¬n c©y b×nh th−êng. Maliga vμ céng sù (1973) còng c«ng bè t¹o ®−îc c©y chèng chÞu streptomycine tõ m« sÑo ®¬n béi thuèc l¸. Ng−êi ta còng ®· t¹o ®−îc c¸c dßng ®ét biÕn sinh hãa. Tulecke (1960) lÇn ®Çu tiªn t¸ch ®−îc c¸c dßng ®ét biÕn h¹t phÊn dÞ d−ìng arginine b»ng nu«i cÊy h¹t phÊn c©y Ginkgo trªn m«i tr−êng cã chøa arginine. Wildholm (1972) ®· t¸ch ra c¸c dßng tÕ bμo cμ rèt vμ thuèc l¸ chèng chÞu mét vμi ®ång ®¼ng cña axit amin. C¸c dßng thuèc l¸ chän ®−îc cã kh¶ n¨ng tæng hîp L - tryptophane gÊp 18 lÇn tÕ bμo b×nh th−êng. Nh− chóng ta ®· biÕt h¹t cña ®a sè c¸c c©y l−¬ng thùc th−êng thiÕu mét hay vμi axit amin nh− tryptophane, lysine, threonine, methionine lμ c¸c axit amin rÊt quan träng ®èi víi ng−êi vμ ®éng vËt (Nelson, 1969). V× vËy, viÖc chän ra c¸c dßng ®ét biÕn sinh hãa giμu axit amin ë c¸c c©y l−¬ng thùc lμ rÊt quan träng vμ cã thÓ thùc hiÖn ®−îc b»ng ph−¬ng ph¸p g©y ®ét biÕn vμ chän dßng tÕ bμo (S. C. Woo vμ C. C. Chen, 1982). Kü thuËt nμy ®· ®−îc øng dông réng r·i trong nu«i cÊy tÕ bμo c©y d−îc liÖu. Ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« vμ tÕ bμo ®¬n béi kÕt hîp víi kü thuËt g©y ®ét biÕn vμ chän dßng høa hÑn nhiÒu øng dông quan träng trong nghiªn cøu di truyÒn chän gièng. Song ph−¬ng ph¸p nμy cßn vÊp ph¶i mét sè khã kh¨n nh− tû lÖ t¸i sinh c©y tõ h¹t phÊn nãi chung thÊp vμ nhiÒu dßng tÕ bμo chän läc ®−îc víi nh÷ng ®Æc tÝnh quý nh−ng ch−a t¸i sinh thμnh c©y. Mét khi nh÷ng khã kh¨n ®ã ®−îc gi¶i quyÕt th× gi¸ trÞ thùc tiÔn cña ph−¬ng ph¸p nμy sÏ rÊt kh¶ quan. 3.3.1.4. øng dông kü thuËt ®¬n béi trong t¹o gièng míi vμ dßng thuÇn ë ng«, lóa A. C©y lóa 88

Nhê kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn lóa cã thÓ rót ng¾n thêi gian chän gièng míi xuèng tõ 4 ®Õn 6 thÕ hÖ vμ t¹o ra hμng lo¹t c¸c dßng thuÇn míi. Trung Quèc lμ mét trong nh÷ng n−íc ®Çu tiªn triÓn khai c«ng nghÖ ®¬n béi trong t¹o gièng lóa víi quy m« lín. Vμo nh÷ng n¨m 1976, nh÷ng gièng lóa ®Çu tiªn tõ chän gièng ®¬n béi kÐp ®· ®−îc s¶n xuÊt th−¬ng phÈm (Yin cs., 1976). Hμng tr¨m gièng lóa míi ®−îc t¹o ra vμ trång trªn diÖn tÝch hμng triÖu hecta (Jia S.R., 1992). T¹i TriÒu Tiªn, kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn ®· t¹o ra 24 gièng lóa lïn míi (Jain cs., 1997; Sasson, 1993). Thμnh tùu nu«i cÊy m« høa hÑn nhiÒu triÓn väng ®èi víi chän t¹o gièng lóa lμ t¸i sinh c©y lóa tõ nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi ë c¶ hai d¹ng lóa n−íc Japonica vμ Indica do Raina vμ Irfan c«ng bè gÇn ®©y (Raina vμ Irfan, 1998). Trªn 500 ph«i ®· ®−îc t¸i sinh tõ kho¶ng 80.000 h¹t phÊn nu«i cÊy trong ®Üa petri ®−êng kÝnh 3,5 cm. RÊt nhiÒu c©y ®· ®−îc t¸i sinh tõ h¹t phÊn. §©y lμ mét tiÕn bé kü thuËt ®Æc biÖt quan träng ë c©y ngò cèc, cã thÓ më ra triÓn väng míi trong chän t¹o gièng lóa b»ng kü thuËt ®¬n béi vμ kü thuËt gen. Theo lý thuyÕt, tõ mét cÆp lóa lai F1 cã thÓ t¹o ra 4.096 kiÓu gen ®ång hîp kh¸c nhau t¸i sinh tõ h¹t phÊn in vitro (§ç N¨ng VÞnh vμ Phan Ph¶i, 1996). Kü thuËt nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi høa hÑn cã thÓ t¹o ra v« sè c¸c nguån gen ®a d¹ng cho chän gièng. ë n−íc ta, c«ng nghÖ ®¬n béi ®−îc ¸p dông víi hai môc tiªu chÝnh sau: -

Cè ®Þnh −u thÕ lai th«ng qua viÖc rót ng¾n thêi gian t¹o gièng thuÇn chñng b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy bao phÊn con lai F1

-

T¹o dßng thuÇn cã nh÷ng ®Æc tÝnh thÝch nghi víi thô phÊn chÐo vμ mang gen kÕt hîp réng T¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp, ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy bao phÊn kÕt hîp

víi chän dßng biÕn dÞ ®· t¹o ra 50 dßng bÊt dôc ®ùc c¶m øng nhiÖt ®é (TGMS) míi, trong ®ã 5 dßng ®· ®−îc x¸c ®Þnh lμ cã tÝnh bÊt dôc æn ®Þnh, cã −u thÕ lai cao khi lai t¹o vμ ®ang ®−îc sö dông trong chän gièng lóa lai hai dßng. B»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy bao phÊn ®· t¹o ra 12 dßng gièng thuÇn cã −u thÕ lai gÇn t−¬ng ®−¬ng con lai F1. C¸c dßng gièng cã triÓn väng gåm: DT26, DT29, DT32, J1, AC22, AC23, AC24, AC25... ®ang ®−îc kh¶o nghiÖm. Nhê nu«i cÊy bao phÊn lóa cã thÓ rót ng¾n thêi gian chän gièng míi xuèng tõ 4 - 6 thÕ hÖ. Kü thuËt ®¬n béi in vitro còng ®ang ®−îc triÓn khai m¹nh trong chän gièng ë ViÖn lóa §ång b»ng S«ng Cöu Long, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, vv... 89

HiÖn nay, c«ng nghÖ nu«i cÊy bao phÊn vμ h¹t phÊn t¸ch rêi ®−îc dïng phæ biÕn cho c¸c môc ®Ých sau: -

Cè ®Þnh −u thÕ lai vμ c¸c gen h÷u Ých Th«ng qua kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn, ng−êi ta cã thÓ cè ®Þnh −u thÕ lai

vμ c¸c gen h÷u Ých tõ con lai F1 cã −u thÕ lai cao, lμm t¨ng n¨ng suÊt lóa (M.S. Swaminathan, 1995; Chen cs., 1978; Narayanan cs., 1996; Siddiq cs., 1994; Rangasamy, 1994, 1996; Zhu De Yao, 1998). Nu«i cÊy bao phÊn lóa lai Indica/Indica ®· thu ®−îc c¸c dßng cã n¨ng suÊt cao h¬n bè mÑ vμ b»ng 93,2% so víi con lai F1 (Batachandran cs., 1994). -

T¹o c¸c dßng bÊt dôc ®ùc míi vμ c¸c dßng mang gen kÕt hîp réng cho t¹o gièng lóa lai Duy tr× tÝnh tr¹ng bÊt dôc ®ùc vμ kh¶ n¨ng kÕt hîp cña dßng thuÇn lμ yÕu

tè tiªn quyÕt trong t¹o gièng lóa lai. HiÖn nay, s¶n xuÊt lóa lai ë n−íc ta vÉn ph¶i phô thuéc rÊt lín vμo nhËp khÈu gièng lai tõ Trung Quèc. §Ó t¹o ra c¸c dßng bÊt dôc ®ùc míi, c¸c dßng B tiÒm n¨ng vμ rót ng¾n qu¸ tr×nh t¹o gièng, ng−êi ta ®· kÕt hîp lai, lai xa víi nu«i cÊy bao phÊn (Dalmacio cs., 1995; Quing and Han, 1990). KÕt qu¶ nhiÒu c«ng tr×nh cho thÊy kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn cña con lai Japonica/Indica, Javanica/Indica lμ con ®−êng nhanh vμ cã hiÖu qu¶ ®Ó ph¸t triÓn c¸c dßng phôc håi mang gen kÕt hîp réng trong t¹o gièng lóa lai (Yan J. Q cs., 1996; Virmani, 1996). §Ó chän t¹o c¸c dßng bÊt dôc ®ùc nh©n víi c¸c nÒn di truyÒn kh¸c nhau, nu«i cÊy bao phÊn con lai F1 mang gen bÊt dôc ®ùc nh©n sÏ cho phÐp t¹o ra c¸c dßng thuÇn bÊt dôc ®ùc nh©n míi chØ sau mét lÇn nu«i cÊy bao phÊn (Nin Jin cs., 1997; Q.R. Chu cs., 1998a, 1998b). -

Lai xa kÕt hîp víi nu«i cÊy m« tÕ bμo trong chän t¹o c¸c dßng kh¸ng s©u bÖnh vμ c¸c ®iÒu kiÖn bÊt thuËn cña m«i tr−êng: Ng−êi ta ®· t¹o ®−îc c¸c con lai kh¸c loμi ®Ó chuyÓn gen kh¸ng tõ lóa d¹i

vμo lóa trång. Tuy nhiªn, khã kh¨n gÆp ph¶i khi lai lμ tÝnh kh«ng t−¬ng hîp. Ph−¬ng ph¸p cøu ph«i vμ nu«i cÊy bao phÊn ®· cã hiÖu qu¶ trong viÖc t¹o ra c©y tõ c¸c cÆp lai kh¸c loμi. B»ng ph−¬ng ph¸p nμy ng−êi ta ®· t¹o ®−îc gièng lóa cã gen kh¸ng chuyÓn tõ lóa d¹i O. officianlis vμ O. austrasiensis, kh¸ng víi ba biotype cña rÇy n©u (Jena and Khush, 1997; Multani, 1994). T−¬ng tù, c¸c gen

90

kh¸ng bÖnh ®¹o «n, b¹c l¸ ®· ®−îc chuyÓn tõ O. minuta ®Ó c¶i thiÖn nguån gen cña lóa (Brar and Khush, 1977; Batachandran cs., 1994). -

Tèi −u ho¸ m«i tr−êng nu«i cÊy bao phÊn chän t¹o gièng lóa h¹t dμi chÊt l−îng cao: T¹i tr−êng tæng hîp Louisiana (Mü), ng−êi ta ®· x©y dùng "ChiÕn l−îc chän

gièng lóa h¹t dμi −u viÖt cho miÒn Nam n−íc Mü" b»ng nu«i cÊy bao phÊn lóa. C¸c gièng lóa h¹t dμi cã kh¶ n¨ng t¸i sinh yÕu, tû lÖ 0,5%. B»ng tèi −u ho¸ m«i tr−êng nu«i cÊy, hμng n¨m hä ®· t¹o ®−îc trªn 8.000 dßng thuÇn ®¬n béi kÐp tõ nu«i cÊy bao phÊn cña c¸c cÆp lai F1 h¹t dμi. Môc tiªu lμ chän ra c¸c gièng lóa h¹t dμi cã gi¸ trÞ th−¬ng m¹i cao. NhiÒu dßng tá ra cã chÊt l−îng h¹t cao, chèng chÞu bÖnh ®¹o «n tèt h¬n vμ t¨ng n¨ng suÊt so víi ®èi chøng, cã dßng t¨ng 25% n¨ng suÊt (Chu vμ CS, 1998; 2000). -

Kü thuËt nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi ë lóa HiÖn nay nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi ®ang thu hót sù chó ý cña c¸c nhμ

nghiªn cøu do hiÖu qu¶ cao. Quy tr×nh cã thÓ lμ t¸i sinh c©y trùc tiÕp tõ h¹t phÊn (Mahdal cs, 1996; Zhuo cs, 1996) hay t¸i sinh c©y th«ng qua giai ®o¹n m« sÑo (Wang cs, 1995). Raina vμ Irffran (1998) cho biÕt tõ mét ®Üa petri ®−êng kÝnh 3,5 cm ®· t¹o ®−îc 500 ph«i tõ c¸c h¹t phÊn lóa nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi. Kü thuËt nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi kÕt hîp víi ph−¬ng ph¸p t¹o ph«i v« tÝnh trong c¸c bioreactor ch¾c ch¾n sÏ më ra triÓn väng lín cho kü thuËt chän gièng trªn quy m« lín. -

Nu«i cÊy bao phÊn kÕt hîp víi c¸c chØ thÞ ph©n tö (CTPT) ®Ó t¹o dßng thuÇn vμ chän dßng, gièng mang gen kh¸ng s©u bÖnh:. Ph−¬ng ph¸p chän gièng nhê c¸c chØ thÞ ph©n tö (marker-assisted

selection-MAS) lμ mét ph−¬ng ph¸p chän gièng míi ®ang ¸p dông kh¸ réng r·i ë nhiÒu c©y trång. Ph−¬ng ph¸p nμy cho phÐp x¸c ®Þnh nhanh, chÝnh x¸c sù cã mÆt cña c¸c gen mong muèn, do vËy cã thÓ hç trî cho chän gièng. Chän gièng nhê chØ thÞ ph©n tö kh¾c phôc ®−îc h¹n chÕ cña c¸c ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng, tiÕt kiÖm c«ng søc vμ rót ng¾n ®¸ng kÓ thêi gian t¹o gièng míi. Nã ®Æc biÖt cã hiÖu qu¶ khi ta ph¶i quy tô nhiÒu gen (kÓ c¶ c¸c gen lÆn) vμo mét gièng mμ c¸c ph−¬ng ph¸p chän dßng theo kiÓu h×nh truyÒn thèng gÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n, thËm chÝ ®«i khi kh«ng thÓ thùc hiÖn ®−îc.

91

BÖnh b¹c l¸ g©y ra bëi Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) lμ mét trong c¸c bÖnh nguy h¹i nhÊt ë lóa. Ng−êi ta ®· x¸c ®Þnh ®−îc Ýt nhÊt 18 gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lóa (Konoshita, 1991). Gen kh¸ng b¹c l¸ Xa 21 lμ mét gen tréi, cã nguån gèc tõ gièng lóa d¹i O. longistaminata ®−îc chuyÓn vμo c¸c gièng lóa Japonica (Song cs., 1995) vμ c¸c gièng Indica (Tu cs., 1998). Huang vμ céng sù ®· quy tô bèn gen kh¸ng b¹c l¸ Xa4, Xa5, Xa13 vμ Xa21 vμo gièng lóa NH 56. KÕt qu¶ gièng nμy ®· tá ra kh¸ng bÖnh b¹c l¸ tèt h¬n so víi gièng IRBB21 chØ mang mét gen Xa21. Gen kh¸ng bÖnh ®¹o «n ë lóa vμ sè chñng nÊm g©y bÖnh ®¹o «n hÕt søc ®a d¹ng. Konoshita (1991), Mackill vμ Bonman (1992) cho biÕt cã 30 locus gen kh¸ng ®¹o «n ë lóa, trong ®ã 20 locus kh¸ng bÖnh chÝnh vμ 12 locus chÝnh kh«ng allen víi nhau. NhiÒu gièng kh¸ng bÖnh ®¹o «n ®· ®−îc x¸c ®Þnh vμ t¹o ra nh− gièng tÎ tÐp cña n−íc ta mang bèn gen kh¸ng bÖnh ®¹o «n, gièng 5173 chøa gen Pi-2(t) kh¸ng bÖnh ®¹o «n; gièng IR20 cã gen Pi-20, gièng IR64 cã gen Pi-20 vμ gen Pi-ta. C¸c gièng nμy ®· gãp phÇn ng¨n chÆn bÖnh ®¹o «n ë nhiÒu n¬i. §Ó ph¸t triÓn c¸c gièng lóa chÞu h¹n, viÖc nghiªn cøu c¸c ®Æc ®iÓm cña rÔ lóa: mËt ®é, ®é s©u (Fukai vμ Cooper, 1995), kh¶ n¨ng ®iÒu tiÕt ¸p suÊt thÈm thÊu lμ rÊt quan träng. ViÖc lËp b¶n ®å ph©n tö lóa liªn quan ®Õn c¸c ®Æc ®iÓm cã lîi cho tÝnh chÞu h¹n cña rÔ ®· d−îc tiÕn hμnh ë mét sè phßng thÝ nghiÖm (Yadav cs., 1997; Champoux cs., 1995). Tõ nh÷ng c«ng tr×nh nμy, b−íc ®Çu ®· x¸c ®Þnh mét sè chØ thÞ ph©n tö liªn quan ®Õn ®Æc ®iÓm rÔ cã lîi cho tÝnh chÞu h¹n, ®Æc biÖt lμ ®é dÇy, ®é ¨n s©u, tû lÖ rÔ ¨n s©u/th©n... C¸c chØ thÞ nμy cã thÓ dïng trong chän gièng víi sù trî gióp cña marker ph©n tö. C¸c b−íc chän gièng cã thÓ tiÕn hμnh theo tr×nh tù sau: -

Lai gièng cã c¸c ®Æc tÝnh n«ng häc vμ chÊt l−îng −u viÖt víi gièng mang gen kh¸ng ®Ó t¹o ra dßng lai F1

-

Nu«i cÊy bao phÊn con lai F1, t¹o ra dßng thuÇn víi c¸c ®Æc tÝnh kh¸c nhau

-

Sö dông kü thuËt chØ thÞ ph©n tö ®Ó chän c¸c dßng thuÇn mang gen kh¸ng bÖnh

-

Kh¶o nghiÖm c¸c dßng thuÇn chän läc trong nh÷ng ®iÒu kiÖn s¶n xuÊt kh¸c nhau ®Ó chän gièng tèt, kh¸ng bÖnh.

B. C©y ng« ë ng«, viÖc øng dông kü thuËt ®¬n béi trong thùc tiÔn chän t¹o gièng cßn ®ang gÆp nhiÒu khã kh¨n vμ h¹n chÕ: 92

-

Kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y tõ bao phÊn vμ no·n nu«i cÊy in vitro nãi chung cßn thÊp vμ phô thuéc rÊt nhiÒu vμo kiÓu gen (genotype). Mét sè gièng cã ph¶n øng trong nu«i cÊy rÊt cao, nh−ng hÇu hÕt c¸c gièng ®Òu cã ph¶n øng thÊp hoÆc kh«ng ph¶n øng. HiÖu qu¶ t¸i sinh còng ®¹t thÊp, chØ 3-5% ph«i cã thÓ t¸i sinh thμnh c©y.

-

TÇn suÊt c¸c c©y ®¬n béi kÐp thu ®−îc tõ nu«i cÊy bao phÊn rÊt thÊp (chØ 20% sè c©y thu ®−îc lμ ®¬n béi kÐp). Kh¶ n¨ng lμm nhÞ béi ho¸ c¸c c©y ®¬n béi ®Ó thu nhËn c¸c dßng nhÞ béi ®ång hîp cßn rÊt thÊp.

-

Ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh cã thÓ lμ mét ph−¬ng ph¸p thay thÕ kh¾c phôc ®−îc mét sè h¹n chÕ trong nu«i cÊy bao phÊn, nh−ng cßn rÊt Ýt nghiªn cøu theo h−íng nμy. MÆc dï vËy, kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn ng« ®Ó thu nhËn c¸c dßng ®¬n béi

kÐp ®· ®−îc øng dông thμnh c«ng ë mét sè n−íc. ë Trung Quèc, h¬n 100 dßng thuÇn ®· thu ®−îc tõ 30 tæ hîp kh¸c nhau (Wu vμ cs., 1983), mét sè gièng ®−îc ¸p dông trong t¹o gièng lai vμ ®· ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt nh− AC 4115, Elite DK 524... (Genovesi, 1987). Kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn c©y ng«: a. C¸c giai ®o¹n ph¸t triÓn kh¸c nhau cña h¹t phÊn ng« ë møc ®é in vivo, tiÕp theo sau qu¸ tr×nh ph©n chia gi¶m nhiÔm cña tÕ bμo, c¸c h¹t phÊn ®¬n béi ®¬n nh©n ®−îc gi¶i phãng ra khái tø tö råi tr¶i qua hai lÇn ph©n bμo nguyªn ph©n ®Ó thu ®−îc mét h¹t phÊn ba nh©n (Pescitelli vμ Petolino. 1988). Giai ®o¹n ®¬n nh©n sím cã ®Æc ®iÓm kÝch th−íc nh©n t−¬ng ®èi lín chiÕm 1/3 ®Õn 1/2 thÓ tÝch tÕ bμo. §Õn gi÷a giai ®o¹n ®¬n nh©n c¸c h¹t phÊn cã kÝch th−íc lín h¬n, nh©n nhá h¬n víi sù h×nh thμnh cña kh«ng bμo trung t©m lín, nh©n bÞ ®Èy vÒ phÝa ®èi diÖn víi lç h¹t phÊn (pollen pore). §Õn cuèi giai ®o¹n ®¬n nh©n tÕ bμo h¹t phÊn cã thÓ tÝch t¨ng lªn vμ tr¶i qua lÇn ph©n bμo nguyªn ph©n lÇn thø nhÊt. §Õn ®Çu giai ®o¹n hai nh©n, c¸c nh©n gièng nhau vÒ kÝch th−íc nh−ng ngay sau ®ã b¾t ®Çu biÖt ho¸, nh©n sinh d−ìng cã kÝch th−íc lín h¬n. Tíi cuèi giai ®o¹n hai nh©n, nh©n nμy di tró ®Õn phÝa ®èi diÖn vμ n»m gÇn lç h¹t phÊn, nh©n sinh s¶n di tró vÒ phÝa lç h¹t phÊn råi tr¶i qua sù ph©n bμo nguyªn ph©n lÇn thø hai ®Ó thu ®−îc mét h¹t phÊn ba nh©n. b. Ph¸t triÓn cña h¹t phÊn trong nu«i cÊy bao phÊn in vitro 93

Trong kü thuËt nu«i cÊy in vitro, c¸c c©y ®¬n béi cã thÓ h×nh thμnh trùc tiÕp th«ng qua ph¸t sinh ph«i hoÆc gi¸n tiÕp qua h×nh thμnh m« sÑo. Trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy bao phÊn in vitro, chØ mét tû lÖ nhá c¸c h¹t phÊn tr¶i qua qu¸ tr×nh ph¸t triÓn thÓ giao tö in vivo b×nh th−êng. Trong nh÷ng giê ®Çu tiªn cña nu«i cÊy bao phÊn c¸c h¹t phÊn b¾t ®Çu tr−¬ng lªn, sau ®ã mét phÇn lín h¹t phÊn b¾t ®Çu chÕt. Trong tuÇn ®Çu tiªn, tû lÖ h¹t phÊn sèng sãt gi¶m ®i tõ 80 - 90% xuèng 10% thÊp h¬n (Pescitelli vμ cs, 1990). Trong sè c¸c h¹t phÊn sèng sãt, mét sè h¹t b¾t ®Çu tr¶i qua sù ph©n chia nguyªn ph©n. Sau nhiÒu lÇn nguyªn ph©n liªn tiÕp, c¸c h¹t phÊn ph¸t triÓn thμnh c¸c cÊu tróc ®a bμo mμ vÉn n»m trong vá hat phÊn nh÷ng cÊu tróc nμy ®−îc gäi lμ "nh÷ng h¹t phÊn ph¸t sinh ph«i thuÇn tuý" (Pace vμ cs 1992). Sau giai ®o¹n nμy c¸c cÊu tróc tÕ bμo ®a nh©n t¨ng tr−ëng vÒ kÝch th−íc vμ t¸ch khái vá h¹t phÊn. C¸c cÊu tróc ph¸t sinh ph«i ®−îc t¸ch ra hoμn toμn vμ ®−îc bao bäc bëi líp tÕ bμo ngo¹i vi. Cuèi cïng lμ c¸c cÊu tróc t−¬ng tù ph«i (embryo like structure ES) ®a bμo h×nh thμnh. Nu«i cÊy bao phÊn ph¶i chän ®óng giai ®o¹n ph¸t triÓn thÝch hîp cña h¹t phÊn ®Ó cã thÓ thu nhËn tû lÖ t¸i sinh vμ sè l−îng c¸ thÓ tù nhÞ béi ho¸ (dßng ®¬n béi kÐp) cao. Giai ®o¹n nu«i cÊy hiÖu qu¶ nhÊt lμ giai ®o¹n tÕ bμo h¹t phÊn tõ tÕ bμo ®¬n nh©n sím ®Õn ®Çu giai ®o¹n hai nh©n. C¸c hoa ®ùc ®−îc t¸ch khái c©y cho bao phÊn (donor plants) khi phÇn lín c¸c h¹t phÊn ®ang ph¸t triÓn tõ gi÷a ®Õn cuèi giai ®o¹n ®¬n nh©n (mid- to late uninucleate stage). Th«ng th−êng c¸c bao phÊn ®−îc xö lý nhiÖt ®é l¹nh tr−íc khi nu«i cÊy. Sau giai ®o¹n xö lý l¹nh c¸c bao phÊn chøa c¸c h¹t phÊn ë giai ®o¹n gi÷a hoÆc cuèi giai ®o¹n ®¬n nh©n ®Õn ®Çu giai ®o¹n hai nh©n ®−îc t¸ch khái hoa vμ cÊy lªn m«i tr−êng t¹o cÊu tróc ph«i (induction medium - ký hiÖu IM). C¸c bao phÊn chøa c¸c h¹t phÊn ë nh÷ng giai ®oan nμy ®−îc xem lμ thÝch hîp nhÊt cho qu¸ tr×nh sinh s¶n ®¬n tÝnh ®ùc in vitro. Sau kho¶ng 4 - 6 tuÇn nh÷ng cÊu tróc ph«i ®Çu tiªn xuÊt hiÖn vμ xuÊt hiÖn nhiÒu. C¸c cÊu tróc ph«i nμy khi ®¹t kÝch th−íc kho¶ng 2 - 3 mm ®−îc chuyÓn th¼ng sang m«i tr−êng t¸i sinh ®Ó ph¸t triÓn thμnh c©y hoμn chØnh (t¸i sinh trùc tiÕp). Mét c¸ch kh¸c, c¸c cÊu tróc ph«i cã thÓ dïng ®Ó t¹o m« sÑo cã kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y hoμn chØnh (t¸i sinh gi¸n tiÕp qua giai ®o¹n m« sÑo). §Ó t¹o nªn c¸c cÊu tróc m« sÑo cã kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y, c¸c cÊu tróc ph«i cã thÓ ®−îc chuyÓn sang m«i tr−êng chøa 2,4D vμ mét l−îng BAP thÝch hîp. Sau khi chuyÓn sang m«i tr−êng t¸i sinh c¸c m« sÑo ph¸t triÓn thμnh c©y hoμn chØnh. T¸i sinh gi¸n tiÕp dÔ dμng t¹o ra sù ph¸t triÓn cña nhiÒu c©y non tõ cïng mét m« sÑo cã nguån gèc tõ mét h¹t phÊn. 94

Mét quy tr×nh nu«i cÊy bao phÊn hay h¹t phÊn t¸ch rêi vÒ c¬ b¶n cã thÓ chia lμm ba giai ®o¹n: 1.

Giai ®o¹n t¹o cÊu tróc ph«i tõ c¸c h¹t phÊn nu«i cÊy. C¸c cÊu tróc ph«i nμy sau ®ã cã kh¶ n¨ng ph©n chia tÕ bμo vμ biÖt ho¸ c¬ quan h×nh thμnh c©y hoμn chØnh trong nh÷ng ®iÒu kiÖn thÝch hîp.

2.

Giai ®o¹n biÖt ho¸ c¬ quan vμ t¸i sinh c©y ®¬n béi tõ c¸c cÊu tróc ph«i (giai ®o¹n t¸i sinh).

3.

Giai ®o¹n l−ìng béi ho¸ bé nhiÔm s¾c thÓ cña c¸c c©y ®¬n béi t¹o thμnh c©y ®¬n béi kÐp (doubled haploids) ®ång hîp tö cïng nguån gen.

C¸c ph−¬ng ph¸p nh»m gi¶m tû lÖ chÕt cña h¹t phÊn th−êng gãp phÇn n©ng cao tÇn sè t¹o cÊu tróc ph«i. Th«ng th−êng mét h¹t phÊn ®¬n lÎ sÏ h×nh thμnh mét cÊu tróc ph«i nh−ng còng cã tr−êng hîp mét h¹t phÊn h×nh thμnh nhiÒu cÊu tróc ph«i. ViÖc nghiªn cøu vμ øng dông kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn ë ng« còng ®· thu hót ®−îc mèi quan t©m cña c¸c nhμ khoa häc trong n−íc (Lª Huy Hμm vμ cs, 1995, 1998, 1999). Trªn c¬ së ®ã, viÖc nghiªn cøu tèi −u ho¸ c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy lμ cÇn thiÕt ®èi víi ch−¬ng tr×nh nghiªn cøu chän vμ c¶i t¹o gièng, nghiªn cøu di truyÒn vμ kü thuËt gen ®èi víi c©y ng« ë ViÖt Nam trong thêi gian tíi, phôc vô ®¾c lùc cho viÖc t¹o gièng ng« míi, ®Æc biÖt lμ ng« lai. Vμo n¨m 1998, trªn c¬ së c¸c gièng ng« CM2, CM8, ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®· hoμn thiÖn quy tr×nh nu«i cÊy bao phÊn víi tÇn sè t¸i sinh cao (3080%). Víi quy tr×nh nμy, thêi gian t¹o dßng thuÇn rót ng¾n tõ 5 - 8 thÕ hÖ ngoμi ®ång ruéng xuèng cßn 8 th¸ng trong phßng thÝ nghiÖm. ViÖn ®· tiÕp tôc nghiªn cøu ¸p dông quy tr×nh nμy ®Ó s¶n xuÊt c¸c dßng thuÇn cho s¶n xuÊt. C¸c nghiªn cøu tËp ®oμn ng« ViÖt Nam ®· chØ ra r»ng: c¸c gièng ng« ViÖt Nam nh×n chung cã ph¶n øng thÊp trong nu«i cÊy bao phÊn, do ®ã cÇn ph¶i c¶i tiÕn quy tr×nh vμ n©ng cao ph¶n øng cña c¸c gièng ng« ViÖt Nam (Lª Huy Hμm, §ç N¨ng VÞnh vμ cs, 1995, 1996, 1997). C¸c nghiªn cøu tiÕp theo tiÕn hμnh t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp cho thÊy cã thÓ n©ng cao hiÖu qu¶ nu«i cÊy bao phÊn b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p sau: -

N©ng cao hiÖu qu¶ cña nu«i cÊy bao phÊn b»ng c¶i tiÕn quy tr×nh nu«i cÊy: nh− xö lý nhiÖt bao phÊn tr−íc vμ sau khi cÊy, xö lý mannitol, c¶i tiÕn quy tr×nh t¸i sinh c©y tõ ph«i trong nu«i cÊy bao phÊn...), c¶i tiÕn thμnh 95

phÇn m«i tr−êng muèi kho¸ng, c¸c bæ sung h÷u c¬...). Mét trong c¸c c«ng tr×nh nμy ®· ®−îc trao gi¶i cña Héi c¸c nhμ sinh häc Ch©u ¸ Th¸i B×nh D−¬ng trong héi th¶o t¹i Hång K«ng th¸ng 7/1996, sau ®ã ®−îc ®¸nh gi¸ xuÊt s¾c t¹i Héi nghÞ N«ng nghiÖp toμn quèc ë Thμnh phè Hå ChÝ Minh th¸ng 9/2000. §Æc biÖt, c¸c nghiªn cøu gÇn ®©y nhÊt tiÕn hμnh t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®· ph¸t hiÖn t¸c dông cña tõ tr−êng cã thÓ t¨ng hiÖu qu¶ nu«i cÊy bao phÊn ng« lªn 3 lÇn. §©y còng lμ mét trong nh÷ng nghiªn cøu ®Çu tiªn trªn thÕ giíi trong lÜnh vùc øng dông tõ tr−êng vμo c«ng nghÖ tÕ bμo thùc vËt (Lª Huy Hμm, §ç N¨ng VÞnh vμ CS, 2001: “Nghiªn cøu ho¹t tÝnh sinh häc cña n−íc nhiÔm tõ, dung dÞch ho¹t chÊt sinh häc trong m«i tr−êng nhiÔm tõ vμ øng dông trong s¶n xuÊt phôc vô nghμnh n«ng nghiÖp” - ®Ò tμi phèi hîp ViÖn VËt lý øng dông & ThiÕt bÞ khoa häc vμ ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp th¸ng 1/2001). C¸c nghiªn cøu nμy ®· kh¼ng ®Þnh tiÒm n¨ng c¶i tiÕn vμ n©ng cao hiÖu qu¶ cña quy tr×nh nu«i cÊy bao phÊn ng«, øng dông cã hiÖu qu¶ cho chän gièng ë ViÖt Nam . -

N©ng cao hiÖu qu¶ cña nu«i cÊy bao phÊn b»ng ph−¬ng ph¸p di truyÒn: C¸c nghiªn cøu tiÕn hμnh t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp trªn mét sè gièng ng« cho thÊy lai h÷u tÝnh gi÷a c¸c gièng ng« cã ph¶n øng thÊp víi gièng ng« cã ph¶n øng cao trong nu«i cÊy bao phÊn cã thÓ t¹o ra gièng ng« vμ c¸c cÆp lai F1 cã ph¶n øng cao, n©ng hiÖu qu¶ nu«i cÊy bao phÊn lªn hμng chôc lÇn (Lª Huy Hμm, §ç N¨ng VÞnh vμ cs 1999, 2000; Hoμng Thuú D−¬ng, 1999). ViÖn ®· sö dông s¬ ®å lai ®Ó t¹o ra mét lo¹t c¸c dßng ng« ViÖt Nam cã ph¶n øng cao trong nu«i cÊy bao phÊn.

T¹o dßng thuÇn b»ng sö dông dßng kÝch t¹o ®¬n béi: Bªn c¹nh viÖc nghiªn cøu t¹o dßng thuÇn b»ng nu«i cÊy bao phÊn, ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®· s−u tËp vμ nghiªn cøu c¸c dßng kÝch t¹o ®¬n béi sau: +

C¸c dßng kÝch t¹o ®¬n béi ®ùc: Line Ig1 Ri- nj/ig 1 Ri-nj; Line Ig Maitainer ; Line 1873-7 fertile Ig/ig X (N) ig/ig; Line 182 F1 Ig/ig X (N) ig/ig (ACR-nj/ACR-nj); Line Kindiger Ig Maitainer: ig1 ig1 B-3Ld IgI Ri-nj.

+

C¸c dßng kÝch t¹o ®¬n béi c¸i: Stock 6 Rig-col.sant; Stock 6 Ri-nj B1Pl1/same; Coe Stock 6 ACR-g Colored scutelum; (Coe Stock 6 C/C-I wx AR) X same. 96

C¸c nghiªn cøu tiÕn hμnh trong n¨m 1999 - 2000 cho thÊy c¸c dßng kÝch t¹o ®¬n béi trong nh÷ng ®iÒu kiÖn thÝch hîp cã thÓ t¹o ra 3-5% h¹t ®¬n béi. HiÖn nay, ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®ang kÕt hîp víi nhμ khoa häc Mü - Bryan Kindiger - t¸c gi¶ cña mét sè dßng kÝch t¹o ®¬n béi ®Ó chuyÓn c¸c gen kÝch t¹o ®¬n béi vμo c¸c gièng ng« cã nguån gèc néi ®Þa. Nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh: Vμo ®Çu n¨m 1932, White ®· tiÕn hμnh nu«i cÊy no·n cña c©y Antirrhinum. TiÕp ®ã, mét sè nghiªn cøu nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh ë mét vμi c©y trång kh¸c nh− Cooperia pedunculata còng ®−îc tiÕn hμnh nh−ng kh«ng thu ®−îc kÕt qu¶ (Maheshwari, 1958; Maheshwari vμ Lal, 1969). §Õn n¨m 1964, Tulecke míi thu ®−îc m« sÑo ®¬n béi tõ nu«i cÊy no·n cña c©y Ginkgo biloba. Song ®Õn thêi ®iÓm nμy, nghiªn cøu thμnh c«ng t¹o c©y ®¬n béi tõ bao phÊn ë c©y cμ Datura innoxia (Guha vμ Maheshwwari, 1964) ®· h−íng sù chó ý cña nhiÒu nhμ khoa häc vμo t¹o c©y ®¬n béi b»ng trinh sinh ®ùc trong suèt h¬n mét thËp kû. Cho m·i ®Õn ®Çu nh÷ng n¨m 70, nghiªn cøu t¹o c©y ®¬n béi th«ng qua nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh vÉn cßn bá ngá. Tuy nhiªn, ë mét sè loμi c©y trång, viÖc t¹o c©y ®¬n béi b»ng trinh sinh ®ùc kh«ng ®¹t kÕt qu¶ nh−: hμnh, lóa mú, cñ c¶i ®−êng, hoa h−íng d−¬ng... (Keller, 1990). §iÒu nμy mét lÇn n÷a lμm håi sinh sù quan t©m vμo t¹o c©y ®¬n béi trinh sinh c¸i. Uchimiya vμ cs (1971) ®· nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh ë ng« vμ c©y Solanum melongena. Hä ®· thu ®−îc m« sÑo trªn m«i tr−êng bæ sung IAA vμ kinetin, mÆc dï nguån gèc cña nh÷ng m« sÑo nμy ch−a ®−îc x¸c ®Þnh song kÕt qu¶ kiÓm tra tÕ bμo häc ®· kh¼ng ®Þnh lμ ®¬n béi. §ång thêi hä còng quan s¸t ®−îc sù ph©n chia tÕ bμo ®¬n béi cña c¸c m« sÑo nμy. §Õn cuèi nh÷ng n¨m 70, ®· cã h¬n 100 b¸o c¸o vÒ ph«i t¹o ra tõ nu«i cÊy tói ph«i. Nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu b−íc ®Çu vÒ kü thuËt nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh ®Ó t¹o c©y ®¬n béi ®· ®−îc Yang vμ Zhou (1982) tæng kÕt: "Nu«i cÊy no·n cã thÓ lμ mét trong nh÷ng ph−¬ng ph¸p hiÖu qu¶ ®Ó t¹o c©y ®¬n béi". Tuy nhiªn kü thËt nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh cßn gÆp nhiÒu khã kh¨n vμ phøc t¹p do viÖc t¸ch tÕ bμo trøng ®èi víi thùc vËt h¹t kÝn lμ rÊt khã vμ rÊt dÔ g©y th−¬ng tæn ®Õn m« thùc vËt (Keller, 1996). B»ng nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh, tû lÖ t¹o c©y ®¬n béi ë mét sè c©y trång nh− hμnh, cñ c¶i ®−êng biÕn ®éng tõ 5-20%, lóa 1,5-12% vμ ë d©u t»m tû lÖ t¹o c©y ®¬n béi còng ®¹t 3-6%. Nh»m lμm t¨ng thªm hiÖu qu¶ t¹o c©y ®¬n béi trinh sinh c¸i, cÇn tËp trung nghiªn cøu c¸c yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh tÕ 97

bμo nu«i cÊy in vitro nh−: kiÓu gen, giai ®o¹n ph¸t triÓn cña tói ph«i, xö lý nhiÖt tr−íc vμ sau nu«i cÊy, m«i tr−êng vμ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy... (Sita, 1997). Quy tr×nh nu«i cÊy no·n ng« ®· thμnh c«ng ë n−íc ta vμ ®¹t ®−îc tr×nh ®é quèc tÕ. C¸c nghiªn cøu tiÕn hμnh t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp cho thÊy cã thÓ dïng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh ®Ó t¹o dßng thuÇn ë ng«. Hai ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy no·n ®· ®−îc ¸p dông: 1.

Nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh t¸ch rêi: cho hÖ sè t¸i sinh trùc tiÕp thÊp. §¹i ®a sè no·n h×nh thμnh m« sÑo, tû lÖ t¸i sinh c©y vμ tû lÖ sèng sãt khi ®−a ra ngoμi thÊp.

2.

Nu«i cÊy cïng lóc nhiÒu no·n trªn mét phÇn cña lâi b¾p ng«: C¸c nghiªn cøu tiÕn hμnh víi m« nu«i lμ mét phÇn cña lâi b¾p ng« vμ no·n ch−a thô tinh ®· kh¼ng ®Þnh −u thÕ v−ît tréi so víi nu«i cÊy no·n t¸ch rêi. Quy tr×nh nu«i cÊy ®¬n gi¶n, no·n ph¸t triÓn trùc tiÕp thμnh h¹t, sè h¹t ®¬n béi in vitro ®¹t 4 5%, tû lÖ h¹t tù nhÞ béi ho¸ ®¹t 45%, tû lÖ n¶y mÇm cao, c©y con trong èng nghiÖm ph¸t triÓn khoÎ, dÔ chuyÓn ra bÇu ®Êt víi tû lÖ biÕn dÞ thÊp. C¸c nghiªn cøu t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®· kh¼ng ®Þnh kh¶ n¨ng n©ng cao hiÖu qu¶ t¹o dßng thuÇn ë ng« th«ng qua m« nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh vμ tiÒm n¨ng øng dông cho chän gièng lμ rÊt hiÖn thùc. Trong c¸c héi th¶o quèc tÕ vÒ chän t¹o gièng ng« ng¾n ngμy t¹i B¨ng Cèc (11/1999), B¾c Kinh (10/2000), Hamburg (3/2001), c¸c c«ng tr×nh nμy ®· ®−îc ®¸nh gi¸ lμ mét trong nh÷ng nghiªn cøu c¬ b¶n nhÊt vÒ øng dông ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy no·n ch−a thô tinh cho chän t¹o gièng ng«.

3.3.2. Kü thuËt chän t¹o biÕn dÞ tÕ bμo soma vμ kh¶ n¨ng øng dông BiÕn dÞ tÕ bμo soma - mét hiÖn t−îng chung vμ phæ biÕn x¶y ra trong nu«i cÊy m« in vitro. C¨n cø vμo qui luËt cña Vavilèp, trong nh÷ng ®iÒu kiÖn m«i tr−êng gièng nhau cã thÓ quan s¸t thÊy c¸c biÕn dÞ di truyÒn gièng nhau ë c¸c loμi gÇn nhau vÒ ph©n lo¹i. Sè liÖu cña h¬n 30 n¨m qua cho thÊy m« vμ tÕ bμo t¸ch rêi, nu«i cÊy trªn m«i tr−êng nh©n t¹o lμ nguån kh«ng cã giíi h¹n cña c¸c biÕn dÞ di truyÒn. Larkin vμ Scowcroft (1981) ®−a ra kh¸i niÖm biÕn dÞ tÕ bμo soma lμm tªn gäi chung cho c¸c lo¹i biÕn dÞ nμy. 3.3.2.1. Nguån gèc cña c¸c biÕn dÞ tÕ bμo soma Nh÷ng thay ®æi di truyÒn x¶y ra tr−íc khi nu«i cÊy m« in vitro: 98

Trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn c¸ thÓ, ph©n ho¸ vμ giμ ho¸ cña m« vμ tÕ bμo mét sè c¸c thay ®æi di truyÒn ®· x¶y ra vμ ®−îc tÝch luü trong c¸c tÕ bμo soma (D'amato, 1985). Nhê kü thuËt nu«i cÊy m«, c©y ®−îc t¸i sinh tõ tÕ bμo soma sÏ lμ c¸c ®ét biÕn. C¸c nhμ khoa häc ®−a ra kh¸i niÖm automutagenesis - tù ®ét biÕn (®ét biÕn x¶y ra kh«ng do c¸c t¸c nh©n tõ bªn ngoμi g©y nªn hay lμ ®ét biÕn tù nã - automuctagenesis). De Vries (1901) - ng−êi khëi x−íng Häc thuyÕt vÒ ®ét biÕn cho r»ng c©y bÞ ®ét biÕn do ®−îc t¸i sinh tõ h¹t giμ (cã nhiÒu ®ét biÕn ®· tiÒm Èn tõ tr−íc trong h¹t giμ). Ba m−¬i n¨m sau, Nawacin chøng minh ®ét biÕn ë h¹t giμ lμ do c¸c chÊt tham gia qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt vμ c¸c s¶n phÈm cÆn b· cã trong h¹t g©y nªn. C¸c chÊt nμy cã thÓ lμ: hîp chÊt chøa l−u huúnh, amin, amino axit, amids, aldehyde, alkloide, phenol, quinone, axit nucleic vμ c¸c s¶n phÈm kh¸c. Nguyªn nh©n g©y ®ét biÕn cã thÓ do cÊu tróc b×nh th−êng cña h¹t vμ tÕ bμo bÞ ph¸ vì - c¸c enzym tiÕp xóc víi c¸c chÊt vμ t¹o ra s¶n phÈm ®ét biÕn. Tuú theo ph−¬ng thøc nu«i cÊy tÕ bμo soma, ng−êi ta ph©n biÖt c¸c lo¹i biÕn dÞ d−íi ®©y: -

BiÕn dÞ dßng tÕ bμo m« sÑo (callusoclonal variation): khi c©y biÕn dÞ t¸i sinh tõ m« sÑo (callus)

-

BiÕn dÞ dßng tÕ bμo trÇn (protoclonal variation) - khi c©y biÕn dÞ t¸i sinh tõ tÕ bμo trÇn. Ngoμi ra Evans vμ céng sù (1984) cßn ®−a ra kh¸i niÖm "biÕn dÞ giao tö"

(gameto-clonal Variation) khi c©y ®−îc t¸i sinh tõ c¸c tÕ bμo sinh dôc (gamete). Nh÷ng biÕn dÞ di truyÒn x¶y ra vμ ®−îc ph¸t hiÖn trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro gäi chung lμ ®ét biÕn tÕ bμo dßng. Nh÷ng thay ®æi di truyÒn x¶y ra trong qu¸ tr×nh in vitro: Mét nguån biÕn dÞ tÕ bμo soma quan träng lμ thay ®æi trong bé m¸y di truyÒn x¶y ra khi nu«i cÊy t¹o m« sÑo vμ ph©n ho¸ c¬ quan in vitro. Chroqui vμ Bercetch (1985) cho biÕt auxin g©y ra ®a béi ho¸ bªn trong tÕ bμo nu«i cÊy (endopolyploidization). Oono (1982) nu«i cÊy m« sÑo tõ h¹t lóa vμ t¸i sinh c©y tõ m« sÑo cho biÕt BAP cã nång ®é 30 mg/l t¹o ra tÇn sè ®ét biÕn lín gÊp 50 lÇn so víi BAP ë nång ®é 2 mg/l. Møc ®é ®ét biÕn tÕ bμo soma lín ®Õn møc tÇn sè ®ét biÕn do c¸c chÊt ®ét biÕn g©y ra còng kh«ng cao h¬n (Larkin and Scowcroff, 1981). Orton (1984) cho biÕt trong thêi gian nu«i cÊy trªn m«i tr−êng dinh d−ìng, hÖ gen cña c¸c tÕ bμo thùc vËt ®· tr¶i qua qu¸ tr×nh c¶i tæ nhanh chãng vμ ®· 99

ph¸t hiÖn nh÷ng thay ®æi sè l−îng, cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ, ®ét biÕn gen. TÇn sè ®ét biÕn gen nhiÒu khi rÊt cao (10-2-10-1) tÝnh theo locus trªn c©y. Thay ®æi di truyÒn phæ biÕn nhÊt x¶y ra trong tÕ bμo nu«i cÊy lμ ®a béi thÓ. Sau khi m« ®−îc nu«i cÊy, nh©n tÕ bμo cã thÓ tr¶i qua qu¸ tr×nh néi ph©n (endoreduplication) lμm sè l−îng nhiÔm s¾c thÓ trong tÕ bμo t¨ng lªn gÊp ®«i hoÆc h¬n n÷a nh−ng kh«ng xÈy ra ph©n chia tÕ bμo. KÕt qu¶ sè l−îng nhiÔm s¾c thÓ cña tÕ bμo t¨ng lªn. Qu¸ tr×nh néi ph©n cña nhiÔm s¾c thÓ tr−íc khi ph©n bμo ®· cho phÐp ng−êi ta nhËn ®−îc c©y l−ìng béi ®ång hîp (dihaploid) tõ h¹t phÊn ®¬n béi trong nu«i cÊy bao phÊn. Phæ réng c¸c biÕn ®æi nhiÔm s¾c thÓ ®· ®−îc quan s¸t thÊy ë nhiÒu loμi c©y trång kh¸c nhau (Murashige vμ Nakano, 1967; Sacristan vμ Melchers, 1960; Sunderland 1973; Nishi vμ Mitsuoka, 1969). Nghiªn cøu tÕ bμo häc cho thÊy 10% sè loμi ph©n ho¸ c¬ quan kh«ng kÌm theo hiÖn t−îng néi ph©n nhiÔm s¾c thÓ, 90% sè loμi ph©n ho¸ c¬ quan cã kÌm theo néi ph©n nhiÔm s¾c thÓ. §ét biÕn tÕ bμo soma x¶y ra ë c¸c gen trong tÕ bμo chÊt ®· ®−îc chøng minh b»ng ph−¬ng ph¸p t¸ch ADN ty thÓ vμ lôc l¹p nhê enzyme c¾t (Kemble R.T cs, 1984). §ét biÕn tÕ bμo soma ®· øng dông vμo chän gièng hiÖu qu¶ ë nhiÒu c©y trång nh− mÝa, khoai t©y, cμ chua, thuèc l¸, lóa vμ lóa m×. ë Petunia ®· nhËn ®−îc gièng míi gäi lμ Velevetrose, gièng mÝa Q47 (Larkin and Scrowroft, 1981). BiÕn dÞ di truyÒn trong nu«i cÊy m« lóa: §ét biÕn tÕ bμo soma ®· ®−îc ph¸t hiÖn bëi nhiÒu c«ng tr×nh nu«i cÊy tÕ bμo lóa. Nhμ khoa häc NhËt b¶n Oono (1978) ®· t¸i sinh c©y qua m« sÑo cã nguån gèc tõ h¹t cña c©y nhÞ béi ®ång hîp gåm 75 h¹t vμ ®· chøng minh ®Çy søc thuyÕt phôc vÒ sù tån t¹i cña ®ét biÕn tÕ bμo soma vμ di truyÒn ®ét biÕn ®ã. Oono ®· ph©n tÝch 800 dßng c©y nhËn ®−îc tõ tÕ bμo soma vμ thÕ hÖ con c¸i tù thô. KÕt qu¶ cho biÕt chØ cã 28,1 % sè c©y lμ gièng víi c©y mÑ vÒ c¸c ®Æc ®iÓm ph©n tÝch. Phæ biÕn dÞ di truyÒn réng ®· quan s¸t thÊy ë c¸c ®Æc ®iÓm nh− ®é h÷u thô cña h¹t, chiÒu cao c©y, thêi gian trç ®ßng. §ét biÕn s¾c tè chlorophyl thÊy ë 8,4% sè dßng. Ph©n tÝch c©y t¸i sinh tõ m« sÑo cho biÕt ®a sè c¸c biÕn ®æi di truyÒn x¶y ra trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy. Ph©n tÝch di truyÒn cho biÕt ®ét biÕn ®· x¶y ra ë n¨m tÝnh tr¹ng vμ biÓu hiÖn víi tÇn sè 0,03 - 0,7% trªn mét ph©n chia tÕ bμo. Oono (1975) cho biÕt c¸c c©y nhËn ®−îc tõ m« sÑo cña bao phÊn nu«i cÊy còng cã c¸c biÕn dÞ kh¸c nhau. Sau ®ã Oono (1982) ®· t¸ch c¸c ®ét biÕn ®ång hîp chiÒu cao c©y, ®ét biÕn c¸c tÝnh tr¹ng sè l−îng vμ chÊt l−îng, ®ét biÕn lÆn vμ ®ét biÕn tréi x¶y ra ë c¸c dßng nhËn ®−îc qua nu«i cÊy m« lóa. Mét nhμ khoa häc NhËt B¶n 100

kh¸c lμ Fukui (1983) ®· nhËn ®−îc 12 c©y t¸i sinh qua m« sÑo cã nguån gèc tõ 1 h¹t lóa, trong ®ã ®· t¸ch ®−îc c¸c ®ét biÕn kh¸c nhau nh− ®ét biÕn chÝn sím, ®ét biÕn b¹ch t¹ng, ®ét biÕn thÊp c©y vμ bÊt dôc. Dabarh (1983) còng nhËn ®−îc c¸c d¹ng ®ét biÕn lóa cã ý nghÜa thùc tiÔn tõ mét m« sÑo ban ®Çu. TÇn sè ®ét biÕn tû lÖ thuËn víi tuæi m« sÑo. C¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu trªn chøng tá tÇn sè biÕn dÞ cao vμ phæ biÕn dÞ réng trong nu«i cÊy m« ë lóa cã ý nghÜa quan träng ®èi víi chän gièng. Ph©n tÝch biÕn dÞ trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy giao tö ®¬n béi th−êng phøc t¹p h¬n do khã ph©n biÖt biÕn dÞ di truyÒn víi ph©n ly tÝnh tr¹ng x¶y ra trong gi¶m ph©n. Nh÷ng biÕn dÞ sè l−îng nhiÔm s¾c thÓ ë m« sÑo vμ c©y lóa nhËn ®−îc trong nu«i cÊy bao phÊn lμ rÊt phæ biÕn vμ ®−îc ghi nhËn bëi rÊt nhiÒu t¸c gi¶ (Nishi vμ Mitsuoka, 1969; Oono, 1975; §ç N¨ng VÞnh cs, 1979; §ç N¨ng VÞnh cs, 1987; Qiren chu cs, 1985...). Trong c¸c c«ng tr×nh trªn, tÇn sè c©y cã møc ®é béi thÓ kh¸c nhau (1x, 2x, 3x, 4x, 5x, x = 12 nhiÔm s¾c thÓ) vμ lÖch béi rÊt cao. Raina S.K (1983) ®· nhËn ®−îc 347 c©y tõ bao phÊn cña bèn con lai F1, trong ®ã 7 c©y nhËn ®−îc tõ m« sÑo cã biÓu hiÖn biÕn dÞ di truyÒn. T¸c gi¶ ®· chøng tá biÕn dÞ tÕ bμo dßng giao tö (gametoclone) x¶y ra trong nu«i cÊy bao phÊn. Schlaeffer (1982) nhËn ®−îc c¸c ®ét biÕn thÊp c©y (thÊp h¬n 15- 30% so víi gièng ban ®Çu calrose 76) qua nu«i cÊy bao phÊn. Ph©n tÝch ®a h×nh ®é dμi ®o¹n ph©n c¾t ADN ë c¸c c©y lóa t¸i sinh tõ nu«i cÊy m« cho thÊy 23% sè c©y t¹o ®−îc tõ nu«i cÊy in vitro dμi h¹n ®· thÓ hiÖn c¸c biÕn ®æi trong cÊu tróc ADN, so víi tû lÖ 6,3 % c©y t¸i sinh tõ nu«i cÊy ng¾n h¹n. Nh− vËy, thêi gian nu«i cÊy tÕ bμo kÐo dμi ë tr¹ng th¸i ch−a ph©n ho¸ (m« sÑo) lμ mét yÕu tè quan träng lμm ph¸t sinh c¸c ®ét biÕn gen vμ sau ®ã lμ ®ét biÕn ë c©y t¸i sinh (Moller E. cs, 1990). BiÕn dÞ tÕ bμo soma trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy ph«i ë ng« vμ kh¶ n¨ng øng dông thùc tiÔn: Quan s¸t c©y con nhËn ®−îc tõ m« sÑo ph«i non vμ thÕ hÖ con c¸i cho thÊy phæ biÕn dÞ di truyÒn rÊt réng. Green C. E. cs (1977) lÇn ®Çu tiªn m« t¶ c¸c c©y nhËn ®−îc tõ m« sÑo ph«i ho¸ (embryogenic callus) ë ng« víi nhiÒu biÕn dÞ ®Æc ®iÓm h×nh th¸i (th©n, l¸) vμ ®é h÷u thô. Ph©n tÝch tÕ bμo cho thÊy cã mét c©y kh¶m ®a béi víi nhiÔm s¾c thÓ sè 5 trong tÕ bμo ®−îc nh©n lªn nhiÒu lÇn vμ mét c©y cã ®o¹n tø béi. TiÕp theo c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ®Çu tiªn nμy, mét lo¹t c¸c c«ng bè kh¸c ®· kh¼ng ®Þnh tÇn sè biÕn dÞ cao x¶y ra víi c¸c tÝnh tr¹ng h×nh th¸i vμ n«ng häc quan träng nh− cao c©y, ®é dμi b¾p, sè hμng trªn b¾p, ®é chÝn sím 101

(Nesticky M. cs 1984; Glaser V.P,1984; Glaser V.P,1984). Mét sè dßng ng« míi cã nhiÒu −u viÖt so víi gièng ban ®Çu ®· nhËn ®−îc tõ c©y t¸i sinh. Mét vμi gièng lai t¹o ra víi sù tham gia cña c¸c dßng míi nμy cã n¨ng suÊt cao h¬n nhiÒu so víi gièng lai ®èi chøng (Earle E.D. vμ Gracen V. E, 1985; Gracen V.E. vμ Earle E. D,1985). C¸c nhμ di truyÒn vμ chän gièng ®Æc biÖt quan t©m tíi c¸c biÕn dÞ x¶y ra trong néi bμo quan (tÕ bμo chÊt). C¸c polypeptid tham gia vμo qu¸ tr×nh h« hÊp, quang hîp, tæng hîp ATP ®−îc m· ho¸ bëi c¸c gen ty thÓ vμ lôc l¹p. C¸c tÝnh tr¹ng kh¸c nh− bÊt dôc ®ùc tÕ bμo chÊt, kh¶ n¨ng chèng chÞu c¸c chÊt kh¸ng sinh vμ ®éc tè còng do ADN néi bμo quan, trong ®ã cã ADN ty thÓ quy ®Þnh (Cornu A. cs, 1981; Kool A. T. cs ,1986). Cornu (1981) cho biÕt khi nu«i cÊy ph«i non cña c¸c dßng ng« bÊt dôc ®ùc kiÓu T ®· nhËn ®−îc c©y h÷u thô vμ kh¸ng ®éc tè nÊm Drechslera maydis g©y bÖnh. Ph©n tÝch cho hay ®· cã nh÷ng thay ®æi cÊu tróc ë ADN ty thÓ dÉn ®Õn kh«i phôc kh¶ n¨ng h÷u dôc ë dßng bÊt dôc. Qu¸ tr×nh kh«i phôc kh¶ n¨ng h÷u thô vμ kh¶ n¨ng chèng chÞu kh«ng phô thuéc vμo sù cã hay kh«ng cã ®éc tè g©y bÖnh cña nÊm Drechslera maydis trong m«i tr−êng chän läc (Brettell cs 1979; Brettell cs 1980). Nh÷ng biÕn dÞ tÕ bμo soma ®· x¶y ra trong nu«i cÊy m«, mÆc dï kh«ng cã sù can thiÖp cña t¸c nh©n g©y ®ét biÕn vμ m«i tr−êng chän läc (Brettall vμ Ingram, 1979). TÝnh tr¹ng bÊt dôc ®ùc tÕ bμo chÊt vμ c¶m øng víi ®éc tè T cã thÓ x¶y ra do mét thay ®æi di truyÒn ®éc nhÊt trong tÕ bμo chÊt vμ thay ®æi nμy cã thÓ ®−îc phôc håi l¹i víi tÇn sè cao. VËy cã thÓ t¹o ra c¸c dßng bÊt dôc ®ùc kiÓu T chèng chÞu ®éc tè g©y bÖnh T b»ng nu«i cÊy m« hay kh«ng? KÕt qu¶ lai t¹o cho thÊy sù kh«i phôc kh¶ n¨ng h÷u thô cña c¸c dßng bÊt thô ®ùc tÕ bμo chÊt in vitro lμ do nh÷ng thay ®æi trong tÕ bμo chÊt (Gracen V. E. vμ Earle E. D., 1985). Sù phôc håi liªn quan ®Õn sù mÊt ADN t−¬ng tù nh− plasmid S1 vμ S1 ë ty thÓ (Escorte cs,1985). Sù biÕn mÊt cña c¸c plasmid tù do S1 vμ S2 trong ty thÓ cã thÓ do chóng l¹i g¾n vμo ADN ty thÓ. Qu¸ tr×nh håi phôc quan s¸t thÊy trong nu«i cÊy ph«i non ë ng« ®· më ra m« h×nh míi cho viÖc nghiªn cøu c¬ chÕ ph©n tö cña hiÖn t−îng bÊt dôc ®ùc tÕ bμo chÊt. Mét thay ®æi lý thó kh¸c lμ sù chuyÓn ng−îc l¹i tõ h÷u thô thμnh bÊt thô tÕ bμo chÊt. Gracen vμ Earle (1985) th«ng b¸o ®· nhËn ®−îc mét d¹ng bÊt dôc ®ùc kiÓu C míi hoÆc mét lo¹i bÊt dôc ®ùc tÕ bμo chÊt hoμn toμn míi nhê nu«i cÊy m« ph«i non. Ph¸t hiÖn nμy më ra triÓn väng sö dông nu«i cÊy ph«i non ®Ó t¹o ra c¸c d¹ng bÊt dôc ®ùc tÕ bμo chÊt cho s¶n xuÊt h¹t lai. BiÕn dÞ ë c¸c c©y nh©n v« tÝnh: 102

Nh÷ng thay ®æi di truyÒn ë gen nh©n, lôc l¹p, ty thÓ x¶y ra trªn c©y t¹o ra c¸c c©y kh¶m di truyÒn. B»ng ph−¬ng ph¸p nh©n v« tÝnh cã thÓ t¹o c¸c dßng v« tÝnh ®ét biÕn tõ c¸c bé phËn kh¸c nhau trªn c¸c c©y ®ét biÕn kh¸c nhau. B¶ng 23. Sù kh¸c nhau vÒ biÕn dÞ di truyÒn ë c¸c c©y sinh s¶n v« tÝnh vμ h÷u tÝnh C©y sinh s¶n v« tÝnh

C©y sinh s¶n h÷u tÝnh

- B¶o tån ®a d¹ng vÒ sè l−îng nhiÔm

- B¶o tån vμ di truyÒn sè nhiÔm s¾c

s¾c thÓ - c¸c møc lÖch béi vμ tam béi

thÓ lμ ch½n (qu¸ tr×nh meios kh«ng

kh¸c nhau. VÝ dô, c¸c gièng mÝa cã sè

bÞ ph¸ vì)

l−îng NST rÊt kh¸c nhau, dao ®éng tõ 40, 48, 55, 64, 72,77, 78, 80, 96... ®Õn 130 NST. - Cã thÓ t¸ch ®−îc c¸c d¹ng ®ét biÕn tõ

- ChØ c¸c ®ét biÕn x¶y ra trong giao

m« vμ tÕ bμo sinh d−ìng - tÕ bμo s«ma

tö míi di truyÒn ®−îc

(Th©n, cñ, rÔ, chåi,m¾t ghÐp...), vÝ dô c¸c gièng ®a béi ho¸ hoÆc c¸c gièng bÊt dôc ®ùc kh«ng h¹t thu nhËn ®−îc tõ c¸c ®ét biÕn tù nhiªn ë m¾t ghÐp cam chanh. - Trong ®iÒu kiÖn in vitro , cã thÓ t¸ch

- Trong ®iÒu kiÖn in vitro , cã thÓ

ra c¸c tÕ bμo ®¬n riªng biÖt, côm tÕ bμo,

t¸ch ra c¸c tÕ bμo ®¬n riªng biÖt,

m« vμ c¬ quan cã ®ét biÕn → t¸i sinh

côm tÕ bμo, m« vμ c¬ quan cã ®ét

chóng thμnh c©y ®ét biÕn hoμn chØnh -

biÕn → t¸i sinh chóng thμnh c©y

Nh©n tiÕp b»ng ph−¬ng ph¸p v« tÝnh →

®ét biÕn hoμn chØnh - Nh©n tiÕp

T¹o dßng v« tÝnh ®ét biÕn

b»ng ph−¬ng ph¸p v« tÝnh → T¹o dßng v« tÝnh ®ét biÕn.

3.3.2.2. C¸c h−íng øng dông cña hiÖn t−îng biÕn dÞ tÕ bμo s«ma Nh− ®· ph©n tÝch ë trªn, viÖc g©y t¹o vμ chän läc c¸c ®ét biÕn tÕ bμo s«ma x¶y ra trong nu«i cÊy in vitro cã nhiÒu øng dông ®a d¹ng: -

T¹o ra dßng tÕ bμo nu«i cÊy cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt c¸c chÊt ho¹t tÝnh sinh häc víi n¨ng suÊt cao (xem c«ng nghÖ bioreactor)

-

T¹o ra c¸c gièng c©y trång mang nh÷ng ®Æc tÝnh biÕn dÞ quý, vÝ dô, c¸c nhμ khoa häc ë §μi Loan ®· chän t¹o ®−îc gièng chuèi thÊp c©y, chèng chÞu bÖnh 103

thèi rò do nÊm Fusarium g©y ra. ë n−íc ta, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc ®· t¹o ®−îc gièng lóa míi DR2 cã kh¶ n¨ng chÞu h¹n, chÞu l¹nh b»ng ph−¬ng ph¸p chän läc c¸c biÕn dÞ tÕ bμo soma in vitro tõ mét gièng lóa kh«ng cã kh¶ n¨ng chèng chÞu. Gièng nμy ®· ®−îc c«ng nhËn lμ gièng quèc gia. 3.3.3. Kü thuËt nu«i cÊy tÕ bμo trÇn (protoplast) vμ thao t¸c di truyÒn ë møc tÕ bμo 3.3.3.1. T¸ch nu«i tÕ bμo trÇn Kh¸c víi tÕ bμo vi sinh vμ tÕ bμo ®éng vËt, tÕ bμo thùc vËt cã thμnh tÕ bμo cøng ®−îc t¹o ra bëi nhiÒu lo¹i polime kh¸c nhau. Thμnh tÕ bμo cã chøc n¨ng c¬ häc, t¹o khung x−¬ng tÕ bμo vμ hÖ mμng liªn kÕt gi÷a c¸c tÕ bμo víi nhau. Thμnh phÇn ho¸ häc cña tÕ bμo rÊt phøc t¹p. Celllose lμ thμnh phÇn chñ yÕu cña mμng tÕ bμo thùc vËt. C«ng thøc ho¸ häc tæng qu¸t cña cellulose lμ (C6H15O5)n. Ph©n tö cellulose cã h×nh sîi dμi, thËm chÝ rÊt dμi víi sù liªn kÕt cña hμng ngh×n c¸c ph©n tö ®−êng ®¬n víi nhau. Ngoμi cellulose cßn cã hemicellulose, pectin, lignin, mét sè chÊt bÐo vμ chÊt kho¸ng, pectin cßn ®ãng vai trß quan träng liªn kÕt gi÷a c¸c tÕ bμo víi nhau. TÕ bμo trÇn (protoplast) lμ tÕ bμo ®· ®−îc t¸ch khái mμng tÕ bμo (mét líp polyme bao bäc tÕ bμo) vμ mμng liªn kÕt gi÷a c¸c tÕ bμo. C¸c enzym ®ãng vai trß chñ yÕu trong ph©n huû mμng tÕ bμo vμ t¹o ra tÕ bμo trÇn lμ cellulase vμ pectinase. TÕ bμo sau khi bÞ mÊt líp mμng cøng sÏ cã d¹ng h×nh cÇu d−íi ¸p suÊt thÈm thÊu phï hîp cña m«i tr−êng. TÕ bμo trÇn cã thÓ ®−îc t¸ch ra tõ c¸c m« hoÆc c¬ quan kh¸c nhau ë c©y nh− l¸, rÔ, m« sÑo nu«i cÊy in vitro ( H×nh 5). ¦u thÕ cña kü thuËt t¸ch vμ nu«i cÊy tÕ bμo trÇn lμ tÕ bμo kh«ng cã mμng cøng, ë tr¹ng th¸i ®¬n bμo, mËt ®é tÕ bμo thu ®−îc trªn 1 ®¬n vÞ thÓ tÝch m«i tr−êng cã thÓ rÊt cao (®¹t 106 tÕ bμo/1ml m«i tr−êng). TÕ bμo trÇn ë mét sè c©y trång cã kh¶ n¨ng t¸i sinh rÊt m¹nh, vÝ dô tÕ bμo m« thÞt l¸ ë thuèc l¸, c¶i dÇu, ... B»ng thao t¸c di truyÒn ë tÕ bμo trÇn cã thÓ dÔ dμng t¹o ra c¸c tÕ bμo biÕn ®æi gen. TÕ bμo víi kiÓu gen biÕn ®æi sÏ ®−îc b¶o tån khi t¸i sinh tÕ bμo thμnh c©y hoμn chØnh.

104

C¾t l¸ trong m«i tr−êng PCM, dïng enzym t¸ch tÕ bµo trÇn

Ly t©m thu ®−îc c¸c tÕ bµo trÇn

ch bµo trÇn

T¸i sinh callus trªn m«i tr−êng

Ph©n chia tÕ bµo

Nu«i tÕ bµo trÇn trong m«i tr−êng

C©y con invitro

Chåi t¸i sinh H×nh 5: T¸ch nu«i tÕ bµo trÇn tõ m« l¸ vµ t¸i sinh c©y (c¶i dÇu)

105

Mét sè øng dông cña kü thuËt tÕ bμo trÇn a/ Lai xa: Ng−êi ta cã thÓ dÔ dμng lai tÕ bμo trÇn cña c¸c c©y kh¸c loμi víi nhau: khoai t©y víi cμ chua, cam ba l¸ víi cam ngät vμ t¹o ra con lai kh¸c loμi. b/ Lai tÕ bμo chÊt t¹o ra c¸c dßng ®ång ®¼ng bÊt dôc: Ph−¬ng ph¸p t¹o dßng ®ång ®¼ng bÊt dôc ®−îc tãm t¾t nh− sau: -

T¹o quÇn thÓ tÕ bμo trÇn tõ c¸c dßng cñng cè bÊt dôc (dßng B tiÒm n¨ng) víi tÕ bμo chÊt b×nh th−êng

-

T¹o quÇn thÓ tÕ bμo trÇn tõ c¸c dßng bÊt dôc ®ùc tÕ bμo chÊt (dßng A tiÒm n¨ng) víi tÕ bμo chÊt bÊt dôc

-

Ph¸ nh©n cña dßng A tiÒm n¨ng b»ng chiÕu x¹ hoÆc ho¸ chÊt

-

Dung hîp (hay lai) hai lo¹i tÕ bμo trÇn víi nhau vμ t¸i sinh tÕ bμo lai thμnh c©y

-

Chän läc c¸c c©y tõ tÕ bμo lai mang toμn bé gen nh©n cña dßng B vμ tÕ bμo chÊt cña dßng A tiÒm n¨ng. C©y chän läc bÊt dôc ®ùc sÏ lμ dßng A ®ång ®¼ng bÊt dôc ®ùc cña dßng B,

gièng hÖt nhau vÒ gen nh©n, dßng A chØ kh¸c dßng B ë tÝnh tr¹ng bÊt dôc ®ùc tÕ bμo chÊt. Nh©n dßng c©y lai th«ng qua thô phÊn c©y nμy b»ng phÊn cña dßng B ®Ó t¹o ra dßng A. Dßng B tiÒm n¨ng trë thμnh dßng B cñng cè (Maintainer) cña dßng A. Ph−¬ng ph¸p nμy cho phÐp nhanh chãng t¹o ra c¸c dßng thuÇn ®ång ®¼ng bÊt dôc phôc vô cho t¹o gièng −u thÕ lai. Nh−ng hiÖn nay kü thuËt nμy ch−a ®−îc øng dông víi nhiÒu c©y kinh tÕ quan träng nh− lóa, ng«.... c/ ChuyÓn n¹p c¸c c¬ quan tö Trong qu¸ tr×nh dung hîp tÕ bμo trÇn gi÷a hai loμi hoÆc hai gièng sÏ x¶y ra chuyÓn n¹p c¸c c¬ quan tö (t¸i tæ hîp tÕ bμo chÊt). Trong tÕ bμo chÊt ë thùc vËt cã rÊt nhiÒu c¬ quan tö nh− lôc l¹p, ty thÓ,.... víi nhiÒu ®Æc tÝnh di truyÒn quan träng nh− kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh, tÝnh tr¹ng bÊt dôc hoÆc h÷u dôc, gen quang hîp, v.v.... Lai tÕ bμo chÊt cã thÓ t¹o ra c¸c dßng tÕ bμo hoÆc dßng gièng c©y trång cã nh÷ng ®Æc tÝnh di truyÒn tÕ bμo chÊt míi. d/ T¹o ra c¸c t¸i tæ hîp míi cña ADN: Trong qu¸ tr×nh dung hîp tÕ bμo cã thÓ t¹o ra c¸c t¸i tæ hîp míi cña nhiÔm s¾c thÓ hoÆc ADN. Trong qu¸ tr×nh lai tÕ bμo khi xö lý b»ng phãng x¹, nhiÔm s¾t thÓ cña nh©n cã thÓ bÞ ®øt g·y mét c¸ch 106

ngÉu nhiªn, dung hîp tÕ bμo trÇn cã thÓ cßn t¹o ra t¸i tæ hîp ADN gi÷a c¸c loμi hoÆc c¸c ®ét biÕn gen kh¸c nhau. e/ øng dông trong nghiªn cøu c¬ b¶n ®Ó x¸c ®Þnh chøc n¨ng cña tÕ bμo chÊt vμ c¬ quan tö th«ng qua ph©n tÝch con lai tÕ bμo chÊt. f/ Thao t¸c di truyÒn: V× tÕ bμo trÇn kh«ng cã mμng cøng nªn rÊt thuËn tiÖn cho nhiÒu thao t¸c di truyÒn kh¸c nhau nh− chuyÓn gen hoÆc nhiÔm s¾c thÓ, tiÓu bμo tö, nh©n tÕ bμo b»ng c¸c vi thao t¸c (vi tiªm vËt liÖu di truyÒn vμo tÕ bμo), xung ®iÖn... Thao t¸c di truyÒn trªn tÕ bμo trÇn ë mét sè loμi cã kh¶ n¨ng t¸i sinh in vitro m¹nh nh− c¶i dÇu, thuèc l¸, khoai t©y.... cã thÓ gãp phÇn t¹o ra hμng lo¹t c¸c gièng míi chuyÓn gen trong t−¬ng lai.

107