Caderno De Lab

Extração de DNA 1 - 200µl de sangue 2 – 1,5ml de Lise I, homogeneizar bem 3 – Centrifugar a 6000/8000 rpm por 2 min e descartar o sobrenadante 4 – Repedir os procedimentos 2 e 3 até que o precipitado se torne claro ( normalmente 3X) 5 – Ressuspender o precipitado em 300 µl de Lise II, adicionar 5 µl de proteinase k (10mg/ml) e deixar pelo menos 1:30 hr a 60°C. (Overnight a 45°C) 6 – Precipitar com 1ml de álcool (sempre gelado),(agitar). 7 – Centrifugar a 6000rpm por 5min. (secar) 8 – Ressuspeder com 250 µl de água de injeção 9 – Estocar na geladeira.

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Géis Gel de Agarose • • •

90 ml de TBE 1X 1,9 g de gel de agarose 3,0 μl de brometo de etidio

Vidrarias Utilizadas: • • • •

Béquer 250ml Pipetas de 20ml, 10ml, 5ml e 2ml Micropipeta de 10 - 100µl Micropipeta de 100 - 1000µl

Gel 8% - 29:1 Acri:Bis TBE Glicerol A.P.S Água TEMED

5,599 2,1 1,49 300µl 11,6088 12µ Volume = 21ml

Gel 10% - 29:1 Acri:Bis TBE Glicerol A.P.S Água TEMED

7,0ml 2,1ml 1,47 300µl 10,230 12µl Volume = 21ml

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Gel Poliacrilamida Desnaturante 16% - 28:2 Acri:Bis TBE A.P.S Água TEMED Uréia

10,66ml 2,0ml 300µl 7ml 12µl 9,6g Volume = 21ml

Gel Poliacrilamida Desnaturante 18% - 28:2 Acri:Bis TBE A.P.S Água TEMED Uréia

12ml 2,0ml 300µl 6ml 15µl 9,6g Volume = 21ml

Corrida no gel • • •

5µl de amostra 5 µl de corante Micropipeta de 1-10µl

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Coloração para géis de Poliacrilamida • • • • • • • • •

1,5 ml de nitrato de prata 100ml de fixador Tempo: 3 min – Homogeneizando 100ml revelador (não colocar diretamente no gel) 10ml Hidróxido de sódio 2ml de formaldeído Desprezar o revelador Adicionar fixador para interromper a revelação OBS: 2 lavagens com água filtrada para retirar o excesso de prata

Solução Fixadora Álcool Ácido acético Água

160ml 7ml 833ml

Solução de nitrato de prata 10% •

10 g de nitrato de prata em 100ml de água.

Solução Reveladora •

Estoque: 22,5g de NaOH em 100ml de água. OBS: Para cada 100ml de ravelador adcionar 1ml de formaldeído (esse procedimento deve ser feito somente no momento da revelação)

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Corante para gel de agarose • • •

0,25% de azul de bromofenol 0,25% de xilenocianol Glicerol 30% em água mili-Q p/ 10ml Azul de Bromotimol Xilenocianol Glicerol Água mili-Q

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0,025g 0,025g 3ml 7ml

Soluções Estoque Solução Estoque de TRIS 1M • • • •

24,22g de TRIS 150ml de água destilada Completar o volume para 200ml Acertar o pH para 8,0 com HCl concentrado

Solução de Lise de Células Vermelhas • • •

12,1g de Tris-base (10mM) 10,2g de MgCl2 (10mM) 5,8g de NaCl (10mM)

Completar para um volume final de 1L e ajustar o pH para 7,6. Autoclavar e diluir 1:10 no momento do uso para obter 1XRCLB

Solução de Proteínase K ( à da extração de tecido) • •

Solução Mãe 10mg/ml Distribuir em alíquotas de 50.

Buffer PCR – Tampão 10X – Solução Estoque UFPI _ CMRV | Laboratório Células e Moléculas

(NH4)2SO4 TRIS MgCl2 Twen H2O

1ml 3,750ml 150µl 100µl 5ml

DATA: Volume: 20 µL

Mix para PCR

Soluções

n

n+1

BUFFER DNTP Primer 1 Primer 2 Taq DNA Pol Água

2µL 2 µL 1 µL 1 µL 0,3 – 0,5 14 µL

12 µL 12 µL 6 µL 6 µL 0,5 µL 84 µL

Amostra : 0,5µL

Programa de PCR Nome: GABRB2

Desnaturação Inicial Desnaturação Alinhamento

Extensão

T(°C)

Temp o

95° 95° 58°

3’ 20’ 15’

72°

20’

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Tubo 01 02 Nº de Ciclos

03 04

35

05 06 07 08 09 10 11 12

Amostra

Extensão Final

72°

5’

Tempo de Conservação

n + 1 é o número total de soluções Cada reação terá um V de 20µL. No Total para cada primer será feito um MIX cujo volume total será 120 µL. Na verdade o Vtotal será um pouco maior já que o volume da amostra não está incluso no cálculo

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13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30