Bab Iii Fix.docx

BAB III METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu susu ultramilk rasa cokelat low fat, larutan induk BSA 1,28 mg/mL, larutan Lowry B (Na2CO3 2 % dalam NaOH 0,1 N, larutan Na-K-Tartrat 2 % dan larutan CuSO4.5H2O 1%,), larutan Lowry A (larutan Follin Ciocalteus dan akuades), tissue roll dan kertas label. 3.2 Alat Percobaan Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu rak tabung, tabung reaksi, gelas kimia 100 mL, gelas kimia 50 mL, pipet tetes, kuvet, pipet skala, bulb, labu semprot, vortex dan spektrofotometer 20D+.

3.3 Prosedur Percobaan 3.3.1 Uji Kadar Karbohidrat Sebanyak 1 g sampel dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan dengan aquades. Sejumlah 10 mL larutan dimasukkan dalam labu Kjeldahl 500 ml, ditambahkan 10 ml H2SO4 (93 – 98% bebas N). Ditambahkan 5 gr campuran Na2SO4 – HgO (20 : 1) untuk katalisator. Larutan kemudian dididihkan sampai jernih dan dilanjutkan pendidihan sampai 30 menit lagi. Setelah dingin dinding labu Kjeldahl dicuci dengan aquades dan dididihkan lagi selama 30 menit. Kemudian setelah dingin ditambahkan 140 ml aquades dan ditambahkan 35 ml larutan NaOH-Na2S2O3, beberapa butiran zink. Kemudian dilakukan destilasi; destilat ditampung sebanyak 100 ml dalam Erlenmeyer yang berisi 25 ml larutan jenuh asam borat dan beberapa tetes indikator

metilen biru. Selanjutnya larutan dititrasi dengan 0,02 N HCl dan 0,1 N HCl. Titik akhir titrasi ditunjukkan dengan warna merah muda. 3.3.1 Pembuatan Larutan Standar Pembuatan larutan deret standar dilakukan melalui proses pengenceran larutan induk BSA 10 mg/mL. Larutan deret standar yang dibuat adalah dengan konsentrasi 1 mg/mL; 2 mg/mL; 4 mg/mL dan 8 mg/mL. Larutan induk yang dipipet dengan volume 0,2 mL; 0,4 mL; 0,8 mL dan 1,6 mL. Kemudian ditambahkan akuades dengan volume masing-masing 1,8 mL; 1,6 mL; 1,2 mL; 0,4 mL, dan kemudian dihomogenkan.

3.3.2 Pembuatan Reagen Lowry 3.3.2.1 Pembuatan Reagen Lowry A Pereaksi Lowry A dibuat dengan mencampurkan larutan follin-clocalteus dengan akuades dengan perbandingan 1:1. Dipipet larutan follin-clocalteus sebanyak 2 mL dan akuades sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam gelas kimia dan dihomogenkan. 3.3.2.2 Pereaksi Lowry B Pereaksi Lowry B dibuat dengan mencampurkan Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N, CuSO4.5H2O 1%, dengan Na-K-tartrat 2 % dengan perbandingan 100:1:1. Dipipet larutan Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N sebanyak 20 mL, CuSO4.5H2O 1 % sebanyak 0,20 mL dan Na-K-tartrat 2 % sebanyak 0,20 mL dimasukkan ke dalam gelas kimia kemudian dihomogenkan.

3.3.3 Preparasi Sampel Larutan sampel dilakukan dengan pengenceran 10 kali, yaitu dengan memipet sampel sebanyak 0,2 mL, lalu diencerkan dengan akuades sebanyak 1,8 mL sehingga volume total larutan adalah 2 mL. Kemudian dihomogenkan.

3.3.4 Penentuan Kadar Protein Sampel Disiapkan 6 buah tabung reaksi kemudian dipipet masing-masing 2 mL larutan sampel, larutan standar 1 mg/mL; 2 mg/mL; 4 mg/mL dan 8 mg/mL, dan blanko. Kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Pada setiap tabung reaksi, ditambahkan 2,75 mL pereaksi Lowry B, lalu dihomogenkan menggunakan vortex dan didiamkan selama 15 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan pereaksi Lowry A sebanyak 0,25 mL, lalu dihomogenkan menggunakan vortex dan didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi dengan menggunakan spektronik 20D+ pada panjang gelombang maksimum.