Anexo C - Actividade 1

ANEXO C ORIENTAÇÕES

PARA A REALIZAÇÃO DE UMA EXPERIÊNCIA ALTERNATIVA QUE INCLUI

CONSTRUÇÃO DA

TINA DE ELECTROFORESE

Material Para a “tina” de electroforese 

Uma pequena caixa de plástico com aproximadamente 8x12 cm (por exemplo, uma caixa de pontas de micropipetas vazia)



Dois pauzinhos de gelado normais



Dois pauzinhos de gelado mais estreitos



Tesouras



Fita adesiva/cola



Dois pedaços de fino de aço inoxidável com 5’’ (polegadas)



Dois fios eléctricos com pinças de crocodilo



Cinco pilhas de 9 V

Para o gel e o padrão 

Água



Bicarbonato de Sódio



Agar em pó ou agarose



Faca ou outro objecto cortante

Para as amostras 

Água



Corante alimentar



Glicerina (disponível nas farmácias)



Pipetas descartáveis

Preparação 1. Construir um pente para criar poços no gel, onde serão colocadas as amostras. Cortar os paus estreitos de gelado, de forma a que estes fiquem ligeiramente acima da base da caixa de electroforese, quando

A

suspensos a partir de um pau de gelado normal (aproximadamente 3-4cm dependendo da altura da caixa). Colar os paus de gelado estreitos no pau de gelado normal, de forma a obter um pente com cinco dentes, distribuídos uniformemente. Colar o outro pau de gelado normal do outro lado do pente para fixar bem os dentes, verificar se estes estão distribuídos uniformemente e se não tocam no fundo quando colocados na caixa. Colocar o pente verticalmente perto do topo da caixa.(Ilustração

B

A) 2. Fazer uma solução tampão com 0,2% de bicarbonato de sódio, dissolvendo 2g de bicarbonato num litro de água. Serão necessários aproximadamente 100ml (Ilustração B) 3. Fazer uma solução de gel a 1%, adicionando 1g de agar-agar em pó a 100ml de solução tampão de bicarbonato de sódio. Serão necessários cerca de 40-50ml de solução de gel. Para dissolver o pó, aqueça a solução num microondas, C

parando de vez em quando para agitar vigorosamente a solução. Tenha atenção pois a solução irá ferver assim que esteja quente o suficiente. Quando vir bolhas desligue o microondas e agite até que as partículas de agar-agar estejam totalmente dissolvidas. A solução deverá ser translúcida e solidificará à temperatura ambiente. 4. Logo que a solução esteja pronta a utilizar, deite-a na caixa de forma a cobrir cerca de 0,5cm dos dentes do pente.

Cortar aqui

5. O gel só necessita de ter metade do tamanho da caixa. Além disso, é necessário reservar espaço para os eléctrodos. Logo que o gel solidifique (5-10minutos) corte parte da extremidade do gel mais distante do pente. Sem descolar o pente, corte uma tira fina dessa extremidade também, para colocar o eléctrodo. O gel terá agora cerca de 6cm de comprimento e 8 de largura. As partes cortadas podem ser reutilizadas aquecendo-as novamente (Ilustração C)

D

6. Dobre cada um dos fios de aço inoxidável e coloque-os ao longo da largura da caixa, em cada uma das extremidades do gel. Se necessário use fita para fixar os fios à caixa. Estes serão os eléctrodos positivo e negativo (Ilustração D) 7. Ligue as 5 pilhas, encaixando o pólo positivo de umas no pólo positivo das outras. Ligar uma das extremidades dos cabos aos dois pólos das pilhas disponíveis e a outra extremidade aos eléctrodos. O sistema eléctrico deverá agora estar pronto a utilizar (Ilustração E)

8. Prepare 5 amostras diferentes misturando 1-2 gotas de corante alimentar com 1 ml de glicerina e 1 ml água num tubo pequeno. Utilize azul, vermelho, verde, amarelo e violeta (obtido a partir da mistura de corante alimentar azul e vermelho). 9. Quando a preparação de gel estiver pronta, verta a solução tampão suficiente para cobrir o gel solidificado. Verifique se encheu o espaço deixado pelo gel cortado e se o gel está completamente submerso.

10. Remova o pente puxando suavemente sem contrair o gel. Os poços devem ser preenchidos com solução tampão. 11. Utilize a pipeta com ponta de agulha para transferir ~ 10 μl de cada amostra para um poço vazio. O volume da ponta fina da pipeta é de cerca 10 μl. Coloque a ponta directamente em contacto com a solução tampão acima do poço e esprema a amostra

E

suavemente para dentro do poço. Ela deve cair no poço, pois é mais densa do que a solução tampão ao redor. Deve usar uma nova pipeta para cada amostra para evitar a contaminação entre amostras. Se tiver apenas algumas pipetas, enxagúe bem a ponta numa taça de água antes da reutilização (Ilustração F). F 12. Quando todas as amostras estiverem carregadas, ligue o fio condutor desde a bateria aos eléctrodos presos em fios de aço inoxidável fixados à caixa. Ligue o terminal negativo ao eléctrodo na parte superior do gel (perto do pente) e o terminal positivo ao eléctrodo na parte inferior do gel. Deve ver bolhas a formar-se ao longo dos eléctrodos, quando o circuito estiver pronto (Ilustração G). G 13. Aguarde entre 15-20 minutos e observe o que acontece a cada amostra. 14. Analise os resultados

Nota: as imagens deste anexo foram retiradas/adaptadas de Gel Electrophoresis - Draft, in Julie Yu, Exploratorium, 2007