9 Cultivo De Embriones Bovinos

Cultivo de embriones bovinos: Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiólogicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro. Parte (II) A.T. Palasz y J. de La Fuente Dept. de Reproducción Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos. INIA, Madrid Dr. Palasz

Dr. de la Fuente

Introducción

Una rutina diaria de limpieza y control de la asepsia en las superficies en contacto con los envases de los embriones prevendrán una posible contaminación de los cultivos en el incubador

En la producción in vitro de embriones bovinos los elementos constitutivos son de importancia capital, así el uso de suero sanguíneo y de células somáticas resultan ser las principales fuentes de la inconsistencia de los resultados obtenidos (datos científicos no concluyentes) y aun más relevante, una fuente potencial de contaminación con agentes víricos infecciosos. Por estas razones se han llevado a cabo numerosos intentos para desarrollar un sistema de cultivo más definido y eficiente, sin ningún tipo de producto biológico, para la producción in vitro por FIV de embriones bovinos. De igual manera, los requerimientos fisiológicos para el mantenimiento y desarrollo de los embriones resultan fundamentales y sus márgenes de variación reducidos. En el presente artículo se pretende revisar los principios básicos y las medidas de control de calidad para los sistemas de FIV bovina.

Cultivo: Constituyentes del Medio y Condiciones de Cultivo Medio de Cultivo En numerosos laboratorios los medios de cultivo suelen ser comprados al fabricante y solo en algunos casos fabricados en el propio laboratorio, dependiendo generalmente de la complejidad del medio en sí mismo. Los medios auto

fabricados suelen tener un coste superior ya que se requieren medidas de asepsia estrictas y la mejor calidad posible de agua y de componentes, que a su vez han de haber sido testados para evitar una posible toxicidad sobre los embriones. Después de pesar todos los componentes del medio, la preparación final debe ser realizada bajo una mesa de flujo laminar y las soluciones finales almacenadas en recipientes estériles, bien de plástico o de cristal. Normalmente los medios complejos, por ejemplo el Ham´s F-10, deben ser utilizados antes de las 2 semanas de su preparación y guardados a 4º C antes de su uso. Por el contrario el PBS o las soluciones salinas pueden ser almacenadas por más de 6 meses a 4ºC. Los cambios en el pH y la exposición a la luz de los medios almacenados son los factores responsables del deterioro de alguno de sus componentes. El piruvato, los antibióticos y L-glutamina se degradan espontáneamente durante el almacenaje y por lo tanto deben ser adicionados inmediatamente antes de su utilización. Otros componentes del medio, como son los factores de crecimiento y el suero deberán haber sido alicuotados y congelados a –70ºC, ya que esta temperatura previene el deterioro y la desnaturalización de las proteínas,que producen su indisolubilidad al precipitar los componentes del medio. Nosotros hemos encontrado que la repetición de sucesivas congelaciones no afecta a la eficacia del suero para su utilización normal en los medios de cultivo ni en las transferencias de los embriones (Palasz et al, 1995). No se recomienda el almacenar el agua por un prolongado periodo de tiempo, ya que los metales pesados pueden llegar a diluirse desde los envases de plástico y de vidrio. Todas las soluciones deben ser testadas para medir su pH (la adición de rojo fenol al medio permite la visualización de una posible desviación del pH) y osmolaridad

Efectos del tipo de conservante añadido trigo sobre la producción y composición Cultivoaldeensilado embrionesde bovinos: Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiológicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro química de la leche

Nut rición

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Embriones PIV de 4-8 células

antes de proceder a su esterilización mediante filtración con un filtro de presión positiva con un tamaño de poro de 0.22 µm, inmediatamente antes de su uso. Todas las preparaciones de nuevos medios deben ser testadas por una posible contaminación y para demostrar su habilidad a facilitar el desarrollo de embriones en cultivo. Un ensayo muy preciso y conveniente es el cultivo de estadíos tempranos (2 células) de embriones de ratón. A pesar de que los embriones de ratón son menos sensibles que los de otras especies, este bio-ensayo da información como control de calidad y de una posible toxicidad.

Agua Ovarios de matadero

Es conveniente recordar que el mayor componente de los medios de cultivo es el agua (>98%) y que su calidad tiene un profundo efecto sobre el desarrollo de los embriones en cultivo (Whittingham, 1971). El restante 1-2% son iones inorgánicos, amino ácidos, carbohidratos, vitaminas, antioxidantes, hormonas y factores de crecimiento, cuya pureza química tampoco debe ser ignorada. En la actualidad se han desarrollado sistemas muy sofisticados de purificación del agua, Agua de Grado y Tipo I, la cual puede ser suministrada de forma comercial (Millipore Ltd; Barnstead/Thermolyne Corporation). Aunque una gran cantidad de contaminantes encontrados en el agua hacen necesario la realización de múltiples test, el indicador de pureza mas común es la resistividad (resistencia ofrecida por el agua al paso de una corriente eléctrica). Así, a mayor resistividad mayor el grado de pureza del agua. La mayor resistividad es de 18.3 megaohms (Tipo I-RGW) a 25ºC. Solo este tipo de agua debe ser usada en los medios de cultivo de embriones. No está recomendado el almacenamiento del agua pura, ya que con el paso del tiempo puede llegar a deteriorarse, mayormente debido a la disolución de metales pesados procedentes de los recipientes, bien sean de cristal como de plástico. Ha quedado demostrado que el desarrollo de los embriones hasta el estadío de blastocisto es mayor en los medios preparados con agua fresca Milli-Q que en aquellos preparados con agua guardada durante 1 ó 2 semanas (35%, 18% y 18%, respectivamente; Nagao et al., 1995). No obstante, y a pesar de contar con una composición óptima del agua, el medio de cultivo es muy dependiente y se puede ver muy afectado por parámetros físicos como son la temperatura, pH, osmolaridad, composición del gas utilizado durante el periodo de cultivo in vitro, luz y la cantidad de embriones en un determinado volumen de medio de cultivo.

Iones inorgánicos Las funciones de los iones inorgánicos son catalíticas y fisiológicas. La composición iónica de la mayoría de los medios de cultivo se basa en el análisis bioquímico de la sangre o del liquido oviductal, así es como ejemplo el medio de Fluido Oviductal Sintético (SOF; Tervit, 1972). Sin embargo, no hay que olvidar que el fluido oviductal no resulta ser un simple filtrado de plasma (Leese, 1988). La composición iónica, el pH, la osmolaridad y el contenido de macromoléculas contenidas en el líquido oviductal difieren enormemente de los del plasma sanguíneo (Gandolfi et al, 1989). Está generalmente aceptado que el cloruro sódico es necesario para regular la osmolaridad

Aspiración de ovocitos para FIV

del medio de cultivo, y que el calcio y el potasio son esenciales para el desarrollo embrionario, son muy efectivos en un rango muy amplio que va desde 0.4 a 10 mM. La ausencia de calcio en el medio de cultivo resulta en una reducción de las divisiones embrionarias y en una incapacidad para la compactación de las mórulas. Cationes como el Ca++ y Mg++, así como las glicoproteinas, juegan un papel importante en el proceso de adhesión celular. El fosfato parece ser efectivo solo a una muy determinada concentración de 0.35 mM en los medios de cultivo para embriones bovinos (Kim et al., 1993).

Substratos energéticos Las fuentes de energía más comunes en el medio de cultivo son el lactato, el piruvato y la glucosa. Todos es-

Grupo de ovarios para PIV

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Aminoácidos y vitaminas Los medios de cultivo más frecuentemente utilizados, como son el Ham´s F-10 o el TCM-199, contienen del orden de 20 aminoácidos, sin embargo, aún están poco definidas sus funciones en los medios de cultivo. Normalmente los 20 aminoácidos están implicados en la síntesis proteica. Si a los medios de cultivo solamente se les enriquece con una gran cantidad de aminoácidos esenciales, una porción de ellos se degradarán para proveer de una fuente de nitrógeno que sirva para la síntesis de aminoácidos no esenciales. Se acepta de forma general que los aminoácidos sirven como fuente de energía, tampones intracelulares del pH, y como “pool” para la síntesis proteica. Se ha demostrado que la retirada de ciertos aminoácidos, así como la inclusión de otros puede llegar a mejorar las condiciones de cultivo (Keskintepe et al., 1995; Steeves y Gardner 1999). Muchos de los aminoácidos nutricionales, como la fenilalanina, tirosina, lisina, valina y treonina son apenas utilizados por las células embrionarias (Eagle, 1959), mientras que otros, como la glutamina, son activamente metabolizados y muy utilizados como fuente de energía durante el desarrollo embrionario (Rieger et al., 1992). Sin embargo, en otros estudios, al suplementar con los 20 aminoácidos esenciales y con aminoácidos no esenciales, el resultado fue que se incrementó el desarrollo embrionario (Takahashi y First, 1992) y se vio que la acción de los aminoácidos sobre el desarrollo embrionario era dependiente del estadío de desarrollo (Kim et al., 1993; Lane y Gardner, 1997).

Placas de cultivo

Mesa de flujo laminar y estereo-microscopios

tos substratos se han encontrado en el líquido oviductal, sus funciones difieren en los medios de cultivo de las diferentes especies animales y en los diferentes estadíos de desarrollo. En los estadios mas tempranos (embriones de 1-2 células) se utiliza el piruvato y/o el lactato pero no la glucosa. De hecho, la adición de glucosa a los embriones bovinos fertilizados de una célula cultivados en SOF resulta en un descenso del desarrollo embrionario posterior (Takahashi y First, 1992), así como en una desviación en la proporción de sexos de los embriones bovinos producidos in vitro (Gutiérrez Adán et al., 2001). Otras fuentes de energía, incluyendo la glucosa, son utilizadas a partir del estadio de 8 células. Ha quedado claramente demostrado (Rieger et al, 1992) que los embriones bovinos utilizan la glucosa como principal fuente de energía desde las 8 células hasta el estadío de blastocisto. Kobayashi et al, (1994) han reportado que se incrementan los blastocistos bovinos producidos in vitro utilizando bajas concentraciones de glucosa en el medio (0.4 mg/ml) en combinación con una baja (5%) tensión de oxígeno. El piruvato-glucosa puede llegar a ser sustituido por una mezcla de piruvato-ribosa e incluso en algunos medios determinados por galactosa.

Las vitaminas juegan un importante papel como coenzimas en el metabolismo de los carbohidratos y de los aminoácidos (Lehninger, 1975), igualmente está demostrado que las vitaminas hidrosolubles son necesarias para la expansión del blastocisto y la salida de la zona pelucida en los embriones de hámster y de conejo (Kane et al., 1988). Pero, por encima de todo, los efectos de las vitaminas sobre el crecimiento de los embriones bovinos han resultado generalmente no concluyentes (Takahashi y First, 1992). Colina e Inositol, generalmente incluidas como vitaminas, juegan un papel de substratos mas que de catalizadores. La colina es un precursor de la fosfatidilcolina y de la esfingomielina, dos de los mayores fosfolípidos estructurales de la capa exterior de las membranas embrionarias.

Hormonas Existe una clara evidencia de que algunas hormonas, como es la insulina, tienen un gran efecto sobre el desarrollo de los embriones. Así, la adición de insulina a los medios de cultivo resulta en un incremento de las tasas de desarrollo morfológico y del transporte de glucosa al blastocisto (Gardner y Kaye, 1991). A la vista de la microscopía electrónica, la supervivencia post descongelación y los porcentajes de gestación, la adición de insulina y selenio a los medios de cultivo de embriones bovinos, resultan en una mayor calidad de los blastocistos (Shamsuddin et al., 1993). La suplementación con hormonas, tales como LH, FSH y estradiol 17β, de los medios de maduración de los ovocitos bovinos, se ha demostrado que ofrecen efectos beneficiosos sobre el porcentaje de complejos cúmulo-ovocito (COC) que son capaces de completar la maduración meiótica con el consecuente desarrollo in vitro (Sirard, 1988; Saeki et al., 1991).

Cultivo de embriones bovinos: Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiológicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro

Nut rición Factores de crecimiento Entre un gran número de factores de crecimiento que tienen un papel importante en la proliferación celular del embrión, los más importantes parecen ser los relacionados con la insulina (insulin-like growth factors; IGF), los de transformación (transforming growth factors; TGF) y los epidérmicos (epidermal growth factors; EGF). Los péptidos de IGF afectan al transporte de membrana y a las actividades enzimáticas en las células embrionarias. La IGF-I y la insulina se ha demostrado que incrementan la producción estrogénica en los embriones de cerdo en cultivo, lo cual es necesario para la transición del estadio de mórula al de blastocisto (Hofig et al., 1990). La adición de TGF-B al medio de cultivo también estimula las actividades mitóticas en la masa interna celular del blastocisto (ICM), sobre todo cuando el embrión se encuentra en un estadío inicial de blastocisto (Marguant-LeGuaienne et al., 1989). La familia de los EGF de los factores de crecimiento se ha visto que causan un incremento significativo en el desarrollo en los embriones bovinos de 2 a 8 células, así como en el paso de mórula a blastocisto (Yang et al., 1993). Por otra parte, un estudio realizado por Shamsuddin. et al., (1993) demostró que los EGF no estimularon el desarrollo embrionario hasta el blastocisto pero que si incrementaron la ruptura zonal de los blastocistos.

Proteínas de origen biológico Una forma de suplementar proteínas a los embriones in vitro es mediante la adición al medio de suero fetal (FCS) o de albúmina del suero bovino (BSA), los cuales son usualmente añadidos a la mayoría de los medios de cultivo embrionario. Estos dos compuestos realizan un papel similar, aunque no del todo conocido y ambos están compuestos de una forma muy variable, debido a la escasa definición de sus componentes (Barnes y Sato, 1980; Bavister, 1992). El suero fetal y la BSA afectan al pH del medio y actúan como quelantes de iones metálicos, contienen factores de crecimiento y ciertas cantidades variables de hormonas que inciden en la proliferación y diferenciación celular (Ball et al., 1985), además sirven como agentes activos de superficie (Palasz et al., 1995). Las proteínas biológicas que contienen acarrean un peligro potencial de contaminaciones cruzadas y de esta manera los embriones pueden aparecer infectados con virus y otros patógenos provenientes de las donantes de las proteínas (Rossi et al., 1980). Debido fundamentalmente a este hecho, la posible contaminación, además de su variable aportación en cuanto a constituyentes y funciones, los medios con productos biológicos deberían ser sustituidos por medios definidos que permitieran similares tasas de crecimiento embrionario in vitro.

Sustitutivos del suero y de la tensión superficial La tensión superficial de los medios de cultivo ha resultado ser un factor importante en el cultivo in vitro de los embriones de mamíferos (Palasz et al., 2000). Esto ha sido resuelto tradicionalmente por la adición de BSA, pero en la

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Estufa de cultivo para PIV

son procesos biológicos y físico-químicos muy diferentes) sugiere que ambos (suero y BSA) poseen propiedades comunes o al menos muy parecidas, más allá de sus componentes nutricionales. Al mismo tiempo, la polivinilpirrolidona (PVP; Saeki et a1, 199l; Leibo y Oda 1993), el alcohol de polivinilo (PVA; Keskintepe et al., 1995), el hialuronato de sodio (SH; Joly et al., 1992; Palasz et al., 1993) y el ET surfactante (Palasz et al., 1995), han sido utilizados de forma exitosa como reemplazantes del suero y la BSA en los medios de colecta, cultivo y congelación de las células germinales de mamíferos. Aunque algunas de las moléculas citadas pueden recordar o tener similitudes con la albúmina, de ninguna manera pueden provocar las posibles reacciones que realizaría el suero y además son inertes desde el punto de vista fisiológico (Catálogo de Merck, 1989). En los sistemas biológicos, la actividad superficial es evidente para los compuestos de bajo peso molecular como son el glicerol y los aminoácidos, así como los polímeros macromoleculares como los fosfolípidos y las proteínas (Encyclopedia of Chemical Technology, 1970). Todos ellos realizan importantes funciones in vivo en cuanto al ensamblamiento y funcionamiento de muchas estructuras biológicas como son las membranas celulares y los revestimientos surfactantes de los alvéolos pulmonares (Possmayer et al., 1984), así como en los fluidos uterinos y oviductales (Nichol et al., 1992). Una sustancia activa a nivel superficial tiene la tendencia de absorber dentro de la superficie de las membranas celulares y a ser incorporada dentro de esas membranas. Las mediciones de la tensión superficial proveen de una indicación muy efectiva de las propiedades absorbentes y de la capacidad de interacción de moléculas en una determinada superficie estática en gas-liquido de los medios de cultivo. Las concentraciones momentáneas de los agentes activos de superficie (proteínas) pueden resultar en una significativa reducción de la tensión superficial de los medios de cultivo. La absorción de proteínas al citoplasma celular a través de la membrana bi-capa permite el mantenimiento de la integridad y de la forma de la membrana, y por tanto puede controlar la circulación de metabolitos (hacia dentro y hacia fuera) en el embrión. Ya que estos agentes actúan como “intercambiadores”, pueden potencialmente afectar al trasporte de oxígeno a través de los componentes gas-líquido de el medio de cultivo, lo cual puede tener un efecto muy profundo sobre el desarrollo embrionario (Tervit et al., 1972; Berthelot y Terqui, 1996).

Equipo de purificación de agua

actualidad algunos polímeros sintéticos pueden reemplazar las propiedades de actividad de las membranas, aunque de ninguna manera puedan reemplazar las propiedades embrio-tróficas de la BSA o del suero en los medios de cultivo. Estas últimas han de ser sustituidas por factores de crecimiento en los medios químicamente definidos. La actividad superficial de los fosfolípidos y de los surfactantes químicamente definidos se expresa por la formación de micelas en soluciones acuosas. Los micelas forman una agrupación de micelas que atrapa las moléculas en solución (a los nutrientes en los medios de cultivo) y su disponibilidad para las células ha desarrollar (de los embriones) está en relación con los cambios en la tensión superficial de las soluciones. La efectividad del suero y de la BSA en la colecta de los embriones, en el corto o largo periodo de cultivo y en los medios de congelación o descongelación (los cuales

Keskintepe et al., (1995) han reportado la posibilidad de producir un medio de cultivo sintético para los embriones bovinos constituido por medio SOF al que se le añadió PVA, agentes quelantes, citrato y aminoácidos no esenciales, pero sin ser añadida la BSA. El alcohol de polivinilo es un polímero coloidal con poca actividad química y su eficacia en los medios de cultivo ha de ser debida a sus propiedades como activador de superficie más que a las coloidales. En otro estudio reciente (Palasz et al., 2000), la tensión superficial del PVA fue más aparente que la del PVP, cuando ambos fueron utilizados a los niveles habituales en los medios de cultivo. Esto puede explicar el porqué el PVA es más frecuentemente utilizado en los medios de cultivo in vitro de los embriones de mamíferos (Kane, 1987; Eckert y Niemann, 1995) de lo que es el PVP (Berthelot y Terqui, 1996; Kim et al., 1996).

Cultivo de embriones bovinos: Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiológicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro

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Nut rición Antibióticos Los medios de cultivo suelen ser complementados de forma estandarizada por 0.1% de antibióticos para suprimir el crecimiento de microorganismos contaminantes y para prevenir la expansión de patógenos. Aunque no son necesarias altas concentraciones de antibióticos, 10 veces la concentración normal de Penicilina G y de Estreptomicina durante 72 horas se ha visto que no resulta toxica para los embriones a 37º C (Riddel et al, 1985). De cualquier manera no está recomendado que se incluyan en los medios antibióticos almacenados durante largos periodos de tiempo, ya que la vida media de la mayoría de los antibióticos se encuentra entre los dos días a las dos semanas, dependiendo del tipo de antibiótico y de la temperatura de almacenamiento.

Requerimientos fisiológicos Temperatura, pH, dióxido de carbono y tensión de oxígeno, osmolaridad y humedad relativa de los incubadores.

Osmómetro

Osmolaridad y pH La osmolaridad normal del suero sanguíneo y de la mayoría de los medios de cultivo es de alrededor de los 308 mOsm. Sin embargo, osmolaridades más bajas (del orden de 246 mOsm) se han encontrado óptimas para los medios de cultivo de embriones de rata y medios dentro del rango de los 275 a 285 mOsm se han usado para el cultivo de embriones bovinos en muchos laboratorios (Gordon, 1994). Generalmente se acepta que los embriones pueden tolerar un amplio rango de osmolaridad si la relación potasio:calcio se mantiene constante. No obstante, se recomienda la medición de la osmolaridad antes y después del cultivo in vitro de los embriones. El pH del medio de cultivo debe estar entre el 7.2 al 7.4, mientras que en los medios de fecundación se recomienda ligeramente superior (7.6-7.8). Debe ser recordado que la adición de un 10% de suero o un 0.3% de BSA produce una tendencia a bajar el pH en un 0.1. Como muchos medios para cultivos durante largos periodos de tiempo son fosfatados (usado mayormente como sustancia tampón) el nivel de este bicarbonato controla el pH. Estos medios son normalmente equilibrados con el gas en el que se va a realizar el cultivo, generalmente 5% de CO2 en aire, lo cual mantiene el pH alrededor del 7.4. Sin embargo, sin CO2 y HCO3+, los embriones de ratón no se dividen por encima de las 2 a 4 células, lo cual sugiere que ambos tienen funciones adicionales (Whittingham, 1971). El dióxido de carbono resulta necesario para la regulación del pH intracelular (Carney y Bavister, 1986), y la presencia de bicarbonato se ha visto que incrementa el pH intracelular de los espermatozoides bovinos (Vijayaraghavan et al., 1985).

Gas atmosférico y temperatura Las condiciones más habituales de cultivo de los embriones de 5% CO2 y 95% de aire, proveen de niveles de oxígeno en la fase gaseosa del 20%, lo cual es mucho mayor que los niveles de oxígeno medidos en el oviducto y el útero del conejo (Bavister y Fisher, 1991). La presión parcial de oxí-

pHmetro

geno en los fluidos corporales es significativamente menor que en el aire. Así, la existencia de altos niveles de oxígeno han sido asociados al bloqueo del desarrollo embrionario, lo cual generalmente es contrarrestado con un co-cultivo en BOEC (Ellington, et al., 1990) o con células bovinas del cumulus o de la granulosa. Sin embargo, cuando los embriones crecen en medios definidos sin la presencia de suero o de BSA, se aprecian tasas superiores de desarrollo cuando el nivel de O2 ha sido reducido por debajo del 10% (Tervit et al., 1972; Thompson et al., 1990). La mayoría de los laboratorios de producción de embriones bovinos in vitro utilizan temperaturas de cultivo de 39ºC, lo cual representa un incremento de 2ºC sobre las temperaturas que se utilizaban hace una década. La razón principal para este cambio es que la penetración espermática y la subsiguiente fecundación fueron superiores al realizarse a 39ºC (Watson et al., 1991). Hay, no obstante, algún otro trabajo que reporta mayores tasas de división de los embriones bovinos cultivados in vitro a 37ºC (Alfonso y Hunter, 1992). Es de gran importancia recordar que la temperatura corporal de la vaca es cercana a los 39ºC, mientras que los 37ºC son mas cercanos a la temperatura corporal humana.

Palasz A. T. y de La Fuente J.

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