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Cultivo de embriones bovinos: Esterilización y control de calidad y toxicidad en los laboratorios de producción de embriones. Parte (I) A.T. Palasz y J. de La Fuente Dept. de Reproducción Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos. INIA, Madrid Julio de la Fuente

Introducción

Una rutina diaria de limpieza y control de la asepsia en las superficies en contacto con los envases de los embriones prevendrán una posible contaminación de los cultivos en el incubador

Aunque los procedimientos para el cultivo de embriones han sido establecidos hace mas de 100 años (Heape, 1891), el desarrollo de técnicas in vitro para producir embriones ha ido tomando relevancia durante el paso del tiempo. Sin embargo la aplicación, desde un punto de vista comercial, de los embriones producidos por fecundación in vitro (FIV) es aun muy limitada debido fundamentalmente a la baja eficiencia y repetibilidad de los sistemas de cultivo in vitro. Es por tanto de gran importancia disponer de estrictas medidas de control de la calidad en el laboratorio de FIV, así como tratar de evitar la toxicidad que sobre el semen y los embriones pueden llegar a producir los materiales utilizados para su manipulación.

Medidas de Control de Calidad En el Laboratorio El laboratorio debe estar separado de los locales para el alojamiento y la obtención de embriones y gametos de los animales y solo deberán tener acceso a él las personas directamente relacionadas con la manipulación in vitro de los embriones. El suelo y las paredes deberán limpiarse de forma rutinaria con desinfectantes, de probada acción no toxica para los embriones, al igual que las zonas de trabajo como son las mesadas y en particular la mesa de flujo laminar, que ha de ser limpiada frecuentemente con

una solución de alcohol al 70%. En condiciones de granja se ha de hacer un esfuerzo adicional usando papel limpio, a ser posible estéril, para las superficies de manipulación de los embriones. Deberá estar prohibido, fumar, comer o beber en todas aquellas zonas donde se manipulen los embriones y la higiene personal (usando batas limpias, cubre zapatos y guantes de plástico), así como procurar una desinfección metódica (con alcohol) antes de manipular a los embriones.

Equipamiento Solo el equipamiento estrictamente necesario; Microscopio, lupa y micromanipuladores, platina calentadora, estufa de cultivo, congelador y Biocongelador, osmómetro y pH-metro, deben estar dentro del laboratorio. Ha de tenerse un cuidado especial para mantener limpias las superficies externas de los equipos, limpiándolas al menos semanalmente. Deben ponerse coberturas a los microscopios y micromanipuladores, limpiar las superficies donde se depositen las placas con las muestras con una solución de alcohol al 70%, con tiempo suficiente para permitir que el alcohol se evapore antes de empezar a trabajar con los embriones. Ha de ponerse una atención especial al incubador, ya que la elevada temperatura y la alta humedad ambiental hacen un caldo de cultivo perfecto para el crecimiento de cualquier bacteria, hongo o virus. Una rutina diaria de limpieza y control de la asepsia en las superficies en contacto con los envases de los embriones prevendrán una posible contaminación de los cultivos en el incubador, el cual además ha de situarse en una zona de tráfico ligero del personal y de mínimo movimiento

Efectos del tipo de conservante añadido al ensilado de trigo sobre la producción y composición química de la leche

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Diferentes tipos de jeringas y filtros.

de aire. El contenedor del agua del incubador ha de limpiarse mensualmente y rellenarse con agua destilada, añadiendo 10-12 gotas de solución de limpieza de baños maría de Sigma (Sigma #S-5525) por cada 5 litros. Debe instalarse un filtro de 200 nm de poro en los tubos de entrada de gases al incubador. Mientras que algunos técnicos piensan que se ha de limpiar mensualmente el incubador, otros tienen la estrategia contraria, esto es, la de no tocar los incubadores mientras no exista contaminación. Diariamente debe controlarse la temperatura, CO2 y la humedad y ajustarse si fuera necesario.

La toxicidad potencial de los diferentes tipos de jeringas Se conoce desde hace bastante tiempo que algunos materiales resultan ser tóxicos para los diferentes tipos celulares, en especial después de determinados métodos de esterilización. Así pues, está siendo una practica habitual el testar la posible existencia de toxicidad en los materiales que van a estar en contacto directo con los gametos y embriones. El lubricante del émbolo de ciertos tipos de jeringas de plástico ha sido determinante para la generación de problemas tóxicos, tanto en el esperma como en los embriones.

Espermatozoides Fueron realizados dos experimentos para determinar hasta que punto podían resultar espermicidas los émbolos de las jeringas de plástico (Broussard et al., 1993). Los émbolos de goma o de plástico fueron cultivados por separado junto al diluyente espermático durante 24 horas a 40C. Después de la incubación el diluyente fue conservado a -200C hasta el momento de la colecta del semen. Como control se utilizó diluyente incubado a 40C durante 24 horas. Los tratamientos consistieron en lo siguiente: Grupo A; Semen equino mas diluyente control, Grupo B; Semen equino mas diluyente incubado con émbolos de goma, Grupo C; Semen equino mas diluyen-

El numero de espermas vivos, los porcentajes de movilidad y de movilidad progresiva, fueron determinados después de la colecta cada 15 minutos durante 1 hora. En el primer experimento, el numero de espermas vivos no se vio afectado por el tratamiento. Sin embargo, se apreció un descenso (P < 0.01) de la movilidad progresiva y de los porcentajes de movilidad a los 30, 45 y 60 minutos en el Grupo B (diluyente incubado con émbolos de goma) al ser comparado con los otros cuatro grupos, no se apreciaron diferencias en el semen mantenido en jeringas con émbolos de goma o de plástico. En el segundo experimento, los porcentajes de progresión espermática se incrementaron después de la adición de diluyente fresco.

Embriones La toxicidad potencial de diferentes jeringas producidas por diferentes fabricantes fue estudiada mediante el cultivo de embriones de ratón (Boone y Shapiro 1990). El medio de cultivo fue expuesto a diversos útiles de plástico durante 16 horas y después colocado en placas multi pocillos en las que fueron incubados embriones de ratón de dos células, durante 72 horas en 5% CO2 en aire y a 37ºC. Se encontraron (Tabla 1) diferencias significativas en la frecuencia de desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Tabla 1.

Desarrollo de embriones de dos células de ratón hasta el estadio de blastocisto después de ser expuestos a varios tipos de recipientes plásticos a temperatura ambiente durante 1 hora (Boone y Shapiro 1990) Tipo de recipiente plástico Nombre comercial Blastocistos n/n (%) Placa multi pocillos Falcon 294/327 (89.9)a Jeringas (embolo de goma) Jeringas (embolo plástico) Jeringas (embolo plástico)

Becton Dickinson Fortune Monoject ab Porcentajes con diferentes superíndices son diferentes (P< 0.05)

te incubado con émbolos de plástico, Grupo D; Semen equino mas diluyente control incubado con émbolos de goma y Grupo E; Semen equino mas diluyente control incubado con émbolos de plástico. Cada grupo contenía 5 ml de diluyente y semen a una concentración de 1.0 x 106 sperm./ml. En un segundo experimento, las incubaciones con semen fueron durante 45 minutos, y luego el diluyente fue retirado y reemplazado por diluyente fresco.

3/88 (3.4)b 83/93 (89.3)a 52/56 (92.9)a

En otro estudio, realizado con embriones de ratón de dos células (Scott Fitzgerald et al., 1993; n=50) fueron cultivados en medio expuesto a émbolos de jeringa negros de goma (Becton Dickinson); los embriones se desarrollaron y realizaron 3-4 divisiones (69% embriones de 8-células) pero todos los embriones terminaron haciéndose atrésicos (P<0.001 comparados con los controles). Los efectos tóxicos de los émbolos de goma

Palasz A. T. y de La Fuente J.

Mórula PIV.

y requiere de una muy larga aireación en evitación de su toxicidad. Las radiaciones son un método muy rápido, usado principalmente para esterilizar equipamientos sensibles al calor, pero requiere unas instalaciones especiales y operadores muy cualificados. Los líquidos químicos son efectivos en el tratamiento de paredes, suelos y muebles, pero tampoco ningún producto químico determinado es efectivo para todo tipo de patógenos y además los productos químicos suelen ser muy tóxicos para los embriones. Todos los equipos no reutilizables pueden ser esterilizados con una de las siguientes alternativas:

Calor seco Los útiles han de ser mantenidos a 1600C durante 2 horas.

Saturación de vapor Blastocisto PIV.

Hay numerosos métodos de esterilización mediante calor, gas, radiación y productos químicos, pero la saturación de vapor es el método más completo y efectivo

Los útiles han de ser mantenidos a 1210C y 104 kilopascals de presión durante 30 min. Existen en el mercado modelos, tipos y marcas de autoclave, que pueden realizar esta función ajustándose a las necesidades de cada laboratorio.

Vapor de oxido de Etileno (esterilización por gas)

Eclosión de blastocisto PIV.

de las jeringas pueden ser evitados mediante el lavado con jabón y enjuagando con agua destilada (Boone y Shapiro 1990).

Lavado y esterilización de los equipos Todo el vidrio y el resto de material reutilizable utilizado para la producción y manipulación de los embriones debe ser enjuagado con agua destilada y mantenido durante 24 horas en una solución al 1% de un detergente no toxico (p.ej., Alconox; Alconox Inc. 9E 40th St, New York), posteriormente lavado al menos 5 veces en agua destilada, secado y preparado para su esterilización. La esterilización es el proceso mediante el cual destruiremos los microorganismos (bacterias, hongos y virus) mediante calor o por reacción química. Hay numerosos métodos de esterilización mediante calor, gas, radiación y productos químicos, pero la saturación de vapor es el método más completo y efectivo. La saturación de vapor bajo presión se utiliza para destruir la vida microbiana en una gran variedad de materiales, tales como el cristal, utensilios de laboratorio y medios de cultivo. El calor seco se utiliza para esterilizar materiales que son sensibles en su mezcla y no pueden ser atravesados por el vapor. La esterilización con gas de óxido de etileno es un proceso lento, utilizado para diversos materiales, que puede provocar daños por calor

Los útiles han de ser envueltos en un material poroso al oxido de etileno y después expuestos a un mínimo de 500 mg de oxido de etileno por cada 1000 cm3 durante 30 minutos. Los equipos han de ser desarmados para facilitar la penetración del gas. El tiempo adecuado de aireación se sitúa por encima de los 30-40 días ya que el gas residual puede matar a los embriones.

Filtración de membrana Solo puede realizarse con soluciones. El medio de cultivo ha de ser filtrado con filtros de poro de 0.22 µm (p.ej.: Millipore) mediante la utilización de presión positiva.

Esterilización con Gas de Oxido de etileno Cuatrocientos embriones de ratón de 8 células fueron cultivados in vitro en placas plásticas de poli-estireno y en placas de vidrio, para analizar la toxicidad potencial de la absorción o retención del oxido de etileno. Las placas de cultivo fueron esterizadas con gas (Amprolene) y aireadas a 21ºC durante varios periodos de tiempo. Los residuos de gas posteriores a la esterilización fueron determinados por la medida de la diferencia de pesos, donde las placas de plástico aumentaron su peso de forma exponencial. Después de una semana de aireación, se retuvieron 0.625 mg de oxido de etileno por mg de plástico de la placa de cultivo. Para determinar el efecto de los residuos del gas sobre el cultivo in vitro los embriones fueron colec-

Cultivo de embriones bovinos: Esterilización y control de calidad y toxicidad en los laboratorios de producción de embriones

Nut rición Estufa de calor seco.

tados de hembras de ratón (C57BL/6N) en un medio fosfatado salino (PBS) y posteriormente mezclados al azar en varias placas de cultivo con diferentes periodos de aireación. Los embriones fueron cultivados en medio de Whitten con 3 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), en una humedad saturada y 5% CO2 en aire atmosférico a 37oC. El desarrollo embrionario fue medido usando las tablas morfológicas y las medidas de calidad sistemáticas, junto con una tinción de acetato de fluoresceína. El desarrollo apareció retardado entre las 8 a 16 células, cuando se utilizaron 12 horas o menos de aireación de las placas de poli-estireno. La aireación durante 24 a 36 horas resultó ofrecer un desarrollo sub-optimo, con menos (P<0.01) blastocistos y mayores grados de degeneración celular a las 48 horas de cultivo in vitro, al comparar con el control (placas esterilizadas por el fabricante, sin gas de oxido de etileno),y con los grupos de una semana de aireación (Schiewe et al., 1985). El efecto de introducir embriones de ratón en una pajuela de plástico para semen esterilizadas con oxido de etileno, fue medido al comparar su desarrollo in vitro frente al desarrollo alcanzado por los embriones que se introdujeron en pajuelas que no fueron expuestas al gas. Así, se usaron un total de 920 embriones de ratón de 8 células a mórula para los siguientes experimentos. Las pajuelas fueron esterilizadas con gas de oxido de etileno y aireadas a temperatura ambiente durante varios periodos de tiempo por encima de las 24 hasta las 144 horas. Los embriones fueron aspirados dentro de las pajuelas con el medio modificado de Brinster y mantenidos durante 2 horas, para ser luego expulsados a una placa con el mismo medio y bajo aceite mineral. El porcentaje de desarrollo in vitro hasta el estadio de blastocisto después de 24 horas de cultivo fue usado como mejor criterio para determinar el efecto producido por el gas.

Autoclave.

El desarrollo de los embriones incluidos en las pajuelas tratadas (esterilización con gas) fueron desde 0% (24 h de aireación) a 33% (144 h de aireación; Tabla 1). Los embriones control llegaron a un desarrollo del 50 al 95 % con un promedio del 72% de desarrollo normal. A todos los tiempos de aireación estudiados las diferencias en porcentajes de desarrollo normal entre los grupos tratados y el control fueron altamente significativas (P <0.01; Tabla 2), según se determinó por el test de Chi-cuadrado.

Tabla 2. Porcentajes de crecimiento normal de los embriones expuestos al contacto con Pajuelas de plástico esterilizadas con oxido de etileno Grupo Tiempo de aireación en Horas a 24

48

72

96

120

144

Tratados (%)

0

20

19

30

32

33

(n)

(44)

(50)

(95)

(64)

(82)

(168)

Control (%)

90

95

65

85

50

57

(n)

(25)

(55)

(69)

(95)

(43)

(160)

a

entre cada tiempo de aireación las diferencias entre grupos son muy significativas (p <0.01).

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Palasz A. T. y de La Fuente J.

Los resultados indican que las pajuelas de semen esterilizadas con oxido de etileno tienen la posibilidad de destruir a los embriones alojados en ellas. Bajo estas condiciones experimentales, fue insuficiente un periodo de 144 horas de aireación de las pajuelas para que no resultaran toxicas para los embriones de ratón (Hagele et al., 1987).

Test de toxicidad de las pajuelas de congelación de 0.25 ml Embriones de ratón de 8 a 16 células fueron cultivados en medio de Ham´s F-10 conteniendo 5 mg/ml BSA y posteriormente introducidos de forma aleatoria en cuatro tipos de pajuelas de plástico de 0.25 ml (de 8 a 10 embriones por pajuela): 1) Pajuelas amarillas (no estériles), 2) Amarillas (preparadas de forma comercial y ¿estériles?), 3) Transparentes (preparadas de forma comercial y ¿estériles?) y 4) Transparentes (no estériles). Filtración de membrana. Tabla 3. Desarrollo de embriones de ratón de 8 a 16 células hasta el estadio de blastocisto después de su exposición a varias pajuelas de plástico de 0.25 ml a 39ºC por 24 h y posteriormente cultivados en medio Ham´s F-10 durante 24 horas mas (4 replicas) Tipo de pajuela N Embriones desarrollados a las 24 h (%) Blastocistos (Grupo) Control (en gotas) Amarilla (no estéril) Amarilla (IMV*) Transparente (IMV*) Transparente (no estéril)

38 37/38 (97.3) 41 34/41 (82.8) 34 12/34 (35.3) 35 14/35 (40.0) 34 29/34 (85.3) abc Porcentajes con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P< 0.05).

Las pajuelas conteniendo los embriones fueron mantenidas en un incubador a 39ºC durante 24 horas y posteriormente trasferidos de nuevo a medio fresco de Ham´s F-10 en gotas de cultivo durante otras adicionales 24 horas. Los resultados sugieren que las pajuelas preparadas de forma comercial contienen algunos factores que actúan reduciendo el Pajuelas preparadas para desarrollo embrionario (Tabla 3). Por esto podría ser que las pajuelas comerciales fueran esterilizadas con gas de oxido de vitrificación.

a las 48h (%) 37/38 (97.3)a 31/41 (75.6)b 11/34 (32.3)c 6/29 (20.7)c 20/34 (58.8)b

etileno antes de su venta, aunque si que estarían del orden de 40 días de aireación antes de ser distribuidas.

Referencias Boone WR, Shapiro SS. Quality control in IVF laboratory. Theriogenology 33:23-50, 1990. Broussard IR, Goodeaux SD, Goodeaux LL, Thibodeaux JK, Moreau JD, Godke RA, Roussel JD. The effect of different types of syringes on equine spermatozoa. Theriogenology 39:389-399, 1993. Hagele WC, Moker JS, Mapletoft RJ. The effect of ethylene oxide gas sterilization of semen straws on mouse embryo survival. Theriogenology, 27:236. 1987. Heape W. Preliminary notes on the transplantation and growth of mammalian ova within uterine foster mother. Proc R Soc. London 48:457, 1891. Schiewe MC, Schmidt PM, Wildt Toxicity potential of absorbed-retained ethylene oxide residues in culture dishes on embryo development in vitro. J Anim Sci. 60:1610-1618, 1985. Scott Fitzgerald L, Sundaram SG, Smith S. The relevance and use of mouse embryo bioassays for quality control in assisted reproductive technology program. Fert. Steril 60:559-68, 1993.