核磁共振基本原理 8讲

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

核磁 共振原 理及 其在 生物学中 的应 用 第七章

仪器和 实验方法 § 7.1 — § 7.3

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

样品 的准备 样品的体积 现代超导谱仪一般 使用 5mm 直径样品 管，溶液体积 0.5ml-0.7ml ，至少 0.4ml 。早期作 13 C-NMR 谱使用 10mm 直径样品管，溶液 体积 1.5-2ml 。

在样品 管中溶液 的深度由两 个因子决定 ，样品若超过一 定高度，超 过部分将 会接收不到发射 线圈发射的 射频造成 浪费；若太低则 样品与空气 磁化率的 不同造成界面磁 化率突变会 影响样品 中磁场的均匀性

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

样品 的浓度

由于核磁共振实验固有的低灵敏度，所以它需 要比一般红外、紫外实验更大的样品量，这往 往成为核磁共振技术在生物学中应用的一个关 键问题 对于质子磁共振波谱，样品浓度一般在 10-2-104 M 。在 FT 谱仪中通过多次波谱累加可以降低 对最低浓度的要求，只要时间足够，在原则上 对于一个分子量 20000 的蛋白质，可以得到 13mg 样品的 1H 核磁共振波谱

样品的 浓度 对于 13C 谱来说，由于 13C 的低灵敏度 ，样品浓度的最低限度是 10-2M 。对 于一个分子量为 20000 的蛋白质， 使用 10mm 直径的样品管，样品体 积是 1.5ml ，则需要大约 300mg 的 样品 天然小蛋白质 同位素标记的蛋白质

5mM >1mM

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

溶剂 的选择 一个理想的溶剂必须满足以下的条件 ： 1. 样品在其中有高溶解度； 2. 在我们所感兴趣的波谱范围内没 有溶剂峰； 3. 在做变温实验的温度范围内保持 液体状态 通常使用一些氘代溶剂 •减少溶剂峰的干扰

锁场 • 采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用 • 氘代氯仿是一个很理想的溶剂，它既适 合于 1H ，也适合于 13C ，在整个质子谱 范围内透明，再加上化学性质惰性，便 宜，所以是常用的溶剂 • H2O 是生物分子最适宜的溶剂 (90%H2O,10%D2O)

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

蛋白 质 NMR 研究的溶液条件

选择的 pH 值尽量在偏酸性如 pH 3~5 ，也 可以稍为高一些，但尽量不要大于 7 。这 是因为蛋白质中的酰胺质子 NH 在 pH 3~5 之间与水的交换最慢，在其他 pH 特别是 7 以上交换加快，导致 NH 的信号减弱甚 至消失，而 NH 的信息对于蛋白质主链乃 至侧链谱峰的认证都十分重要

缓冲体系的成份首先要保证蛋白质的 稳定及高溶解度 ，蛋白质的浓度通 常要求有数 mM 其次要考虑缓冲液中其他成份对蛋白 质谱图的干扰，在这方面磷酸盐缓 冲液最好，其他的如 Tris 或乙酸等 有机成份由于本身也有 CH 质子， 其化学位移与蛋白质中的 CH 相近 ，因而有干扰，特别是缓冲液浓度 较蛋白质高出很多时。如果作同核 谱，最好能用氘代的 Tris 和乙酸等

作异核谱时影响相对小一些，但其他 有机成份也应控制在数十 mM 内。 无机盐浓度不宜大于数百 mM ，否 则会影响核磁谱仪探头的调谐。在 样品溶液中不能有重金属离子污染 ，因有顺磁性会降低核磁信号的强 度和分辨率，必要时可在透析液中 加 EDTA 等除去。

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

样品的处理

离心 ：样品（特别是生物大分子）溶解后，应该离心 除去可能的微小颗粒，以免影响匀场，降低分辨率 除氧 ：在高分辨结构和弛豫研究中除氧是极为重要的 （特别是小分子），溶解在溶液中的分子氧具有顺磁 性，它会极大的减少弛豫时间，必须将氧除去。除氧 的方法通常有两种，一种叫冰冻－抽真空－融化 : 即 把样品放在 NMR 样品管内冰冻，然后抽真空，融化， 重复上述过程四次，最后在真空中将管口封住。另一 种方法是将氮气或氦气，氩气强迫通过整个样品体积 把氧赶走

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

核磁共 振谱 仪的 主要指 标 分辨率 (res oluti on) 谱仪的分辨率被定义为能区分两个接近的共振峰的能力 ，和一般光谱仪不一样它不是由能区分的最小频率间距 -υ2 表示，因为 -υ2 与仪器的频率有关， 1 1 250MHz 的谱仪可以区分的频率间距自然大于 60MHz 谱 仪。核磁共振谱仪的分辨率受到谱线宽度的限制，谱线 不是无限窄的，它有一定的宽度，用共振峰半高处的宽 度表示。表观线宽不仅取决于弛豫过程，而且取决于仪 器本身 老式的谱仪用 10%(v/v) 的邻二氟苯 / 四氯化碳作为标样 ，测定某条指定的谱线的半高宽，大致在 0.1-0.5Hz 现代的 FT 谱仪用 1-3% 氯仿 / 氘代丙酮作为标样，测定

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

氯仿 / 氘代丙酮的 NMR 谱

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

核磁共 振谱 仪的 主要指 标 线型 (l inesh ape) 仅仅最小线宽还不足以表征分辨率，特别是所观察的两个 峰高度相差甚大时，这时分辨率在很大程度上受到强峰接 近基线处形状的影响。这时还要进行一种波峰 检验 (Hump test) 老式的谱仪用 10%(v/v) 的氯仿 / 四氯化碳作为标样，测定 氯仿主峰的 0.5% 处即 13C 卫星线高度处谱线的宽度，大致 在 7-15Hz 现代的 FT 谱仪用 1-3% 氯仿 / 氘代丙酮作为标样，测定氯 仿主峰的 0.55% 及 0.11% 处谱线的宽度

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

C 卫星线 指与 13C 相耦合的质子产生的 谱线 13

旋转边带 样品旋 转时由于磁场不够均 匀而在强峰两边产生 的弱峰，与主峰的距 离为旋转速度的倍数

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

氯仿 / 氘代丙酮的 NMR 谱 (Hump test)

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

核磁共 振谱 仪的 主要指 标 灵敏度 (sen sitiv ity) 灵敏度是指谱仪能够测量出弱信号的能力。核磁共振谱 仪的灵敏度不仅受到放大器增益的限制，而且受到电子 线路中随机噪声的限制，如果弱信号和噪声振幅大小相 同，则弱信号就不能检测出来。 灵敏度以信噪比表示 S/N ＝ 2.5H/h 其中 H 是信号高度， h 是噪声振幅的峰－峰值。 h 值除 以 2.5 的原因是：按照噪声理论，噪声振幅的峰值是无 意义的，只有均方根噪声才有意义，二者之间的转化因 子在核磁共振中选为 2.5

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

1

H 灵敏度

老式的谱仪用 1%(v/v) 的乙基苯 / 四氯化碳作为标样，测 定某些指定谱线的信噪比，大致在 20-300 或更高 现代的 FT 谱仪用 0.1%(v/v) 的乙基苯 / 氘代氯仿作为标样 ，同样测定某些指定谱线的信噪比 13

C 灵敏度

老式的谱仪用 90% 的乙基苯 / 四氯化碳作为标样，测定某 些指定谱线的信噪比，得到的信噪比和质子一般同数量级 现代的 FT 谱仪用 10%(v/v) 的乙基苯 / 氘代氯仿 (1H 去耦 ) 或 ASTM(40% p-Dioxane/60% 氘代苯 ) (1H 不去耦 ) 作为标 样，同样测定某些指定谱线的信噪比

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

脉冲付里 叶变换超导 核磁共振谱 仪

脉冲付里 叶变换超导 核磁共振谱 仪

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

脉冲付里叶变换 核磁共振 谱仪

•Magnet •Probe •Console •Computer

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

超导磁体

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

对磁体的要求 •高磁场强度 •高均匀性 •高稳定性

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

对磁体的要求：高磁场强度

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

高场谱仪分辨率的提高

Oestradiol-acetate

900 MHz

1450

1400

1350

1300

1250

1200

1150

1100

600 MHz

950

900

850

800

750

Hz

400 MHz

Hz Current Data Parameters NAME txioestradiol EXPNO 3 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20010126 Time 16.50 INSTRUM spect PROBHD 5 mm TXI 13C Z PULPROG zg TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 4 DS 0 SWH 7440.476 Hz FIDRES 0.113533 Hz AQ 4.4040694 sec RG 180 DW 67.200 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K D1 3.00000000 sec ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 10.00 usec PL1 -4.00 dB SFO1 900.0236581 MHz

650

600

550

Hz

F2 - Processing parameters SI 65536 SF 900.0200000 MHz WDW GM SSB 0 LB -0.30 Hz GB 0.3 PC 4.00

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

对磁体的要求：高均匀性

•在 100MHz 的谱仪中，假若磁场变化 10-9 ，就会使频率变化 0.1Hz ，所失去的分辨率就等于或超过自然线宽 •影响磁场均匀性的原因： 磁体设计方案；探头形状与材料；样 品管厚度不均匀，同心度不好；样品溶解不均匀，有悬浮颗粒； 磁体附近有铁磁性物体 •解决方法：在探头周围放置多组线圈，称为匀场线圈，通上适当 大小的电流，产生校正磁场，提高总磁场的空间均匀度 •低温匀场线圈：同主线圈一起浸在液氦中，平常电流不可调节 •室温匀场线圈：工作在室温，有二三十组线圈，每换一个样品均 需调节其电流大小（称为匀场 ） •要进一步提高分辨率，可以让样品管绕其自身的轴旋转，以平 均掉垂直于转轴平面中的磁场梯度。样品旋转会伴随旋转边带的 产生，转速不同，边带的位置也不同。样品旋转不能太快，否则 会产生涡流。通常旋转速度为 20-50Hz ，一般边带小于主峰的 1-

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

对磁体的要求：高稳定性

磁场变化的原因：磁体的老化；附近有金属物体移动；温 度的波动 解决方法：监视 2H 锁信号的共振频率（由氘代溶剂提供 ）

场频联锁： 磁场变化 共振频率变化 总磁场保持不变

产生校正电流

产生补偿磁场

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

探头 功能：放置样品管，发 射射频脉冲，接收核磁 信号； 组成：射频线圈及调谐 电路；梯度磁场线圈； 热电偶，加热器件，传 送恒温气流的杜瓦管道 ；样品管进出用的气流 通道

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

脉冲谱仪普遍采用单线圈探头，发射与接收由同一线圈完成

匀场系统 (The Shim System) • • • •

低温匀场系统 室温匀场系统 the on-axis (spinning) shims (z,z2,z3,z4..) the off-axis (non-spinning) shims (x,y,xy...)

锁场系统 (The lock-system) • 氘锁系统 • 保证磁场稳定

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

脉冲发生器 •频率综合器：产生所需频率的射频电流 •脉冲编程器：控制脉冲的时序，长度， 幅度，相位甚至形状 •射频放大器：产生足够的功率（几十至 几百 W ） •通常一台谱仪有若干射频通道，分别工 作在不同的核的共振频率上，在实验中可 以同时施加作用于不同核的射频脉冲

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

接收器 •前置放大器：由于核磁信号很弱，前置放大器总 是尽量靠近探头，其性能决定了仪器能达到的信噪 比 •相敏检波：从射频信号中检出低频的核磁信号 （相当于旋转坐标系中的信号），并完成正交检波 •模数转换器：或称 ADC ，完成模拟信号的数字化 ，一般谱仪考虑到转换速度和动态范围，配置的为 16bit ADC ，其动态范围为 -28 到 28-1 即 -32,768 到 32,767

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

核磁共 振信号的检 测 样品中磁化强度矢量按 Bloch 方程在空间运动，磁化强度 矢量在空间的运动将在接收线圈中引起感应电动势，假设 线圈在 y 轴方向

所以在接收线圈上可以得到包含核磁化向量的大小，进 动频率和起始相位的高频信号（高频 FID ）

单一线 圈不能区分 正负频率和 相位

正交 检波区别正 负频率及 相位

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

相敏 检波器 及正 交检 波

相敏检波器实际上相当于一个混频器或模拟乘法器，接收到的 核磁信号与参照信号（与射频场同频）经相敏检波器得到的输 出为低频 FID ，但不能区别正负频率及相位 两路正交的相敏检波器完成正交检波，以区别正负频率及相位

数据获取

sfo1: spectrometer frequency offset of the first (observe) channel

bf1 is the so-called basic-spectrometer frequency, e.g. 500.13 MHz and o1 is the offset,

sfo2: spectrometer frequency offset of the second (decoupler) channel • required for example for acquisition of proton decoupled carbon spectra. The proton frequency is then defined on the second channel and should correspond to the center of the proton spectrum.

如何选择谱宽 dwell time. The signal is sampled stroboscopically and neighboring data points are separated by the dwell time.

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

离散采样 •脉冲付里叶变换核磁共振方法的优点之一是可 以对数据进行各种处理（信息加工） •模拟的 FID 信号必须经过离散采样，并对信号 数字化，才能送到计算机处理 •采集的离散化数据同原始的模拟数据有相同点 , 也有不同点 : 在一定条件下 , 离散化数据可以代表原始的 模拟数据 •采样定 理

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

采样 定理 要使采集的离散的时间序列能代表原来的模拟信号， 采样速率必须遵守采样定理，即

fs ≥ 2fh 其中 fs 是采样频率，表示每秒钟采样次数， fh 为被采 样的模拟信号的最高频率。从上式可见，每个周期至 少采取两点 采样速率不够引起将导致信号折迭现象 ，这是离散化 导致的后果 dw = 1/sw or dw = 1/2sw

采样定 理

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

信号 折迭 现象

采样速率是 2000Hz ， 1600Hz 处的谱线由于采样速率不够 而折迭，将出现在 400Hz 处

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

数字分 辨率

根据采样定理，要得到一个最高频率为 (Hz) 的谱，所 需要的最小采样速度是每秒 2∆ν 个点，如果采集的数据点数 目是 N ，整个 FID 采集时间是 At ，则满足以下关系式 2∆ν At = N 如果采用正交检波，则射频照射频率可以放在谱的中心，这 时谱宽为 2∆ν ，经过 Fourier 变换后的频域信号谱线频率的 数字精确度（数字分辨率）相当于谱宽为点数所除，为 FID 采集时间的倒数

注意要区分谱仪分辨率和这里所说的数字分辨率。前者是由磁 场的均匀度决定的，而后者由可选择的谱宽和数据点决定，它 是对谱仪分辨率的实际限制，影响信号的确定和线型

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

相干叠加 •采样得到的 FID 信号可以进行多次累加以提高信噪比 •由于信号是有规律的出现的，所以 n 次累加所得信号的 大小与累加次数 n 成正比 •而噪声是随机的 , 假设噪声按高斯分布 , 正的和负的等 几率分布 , 则经过 n 次累加 , 噪声的大小和累加次数 n 的平方根成正比 •于是信噪比等于

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

FFT 快速 Fourier 变换 FID 信号必须经过 Fourier 变换才能变为普通的核磁共 振波谱。这种变换是靠计算机上进行的离散 Fourier 变 换实现的，它的正负变换的表示式分别为

直到 1965 年 Cooley-Tukey 提出了快速 Fourier 变换算 法，使原先的 N2 次运算减为 (Nlog2N)/2 次运算，使运 算次数大大减少，并且节省了计算机的内存，才使脉冲 付里叶变换谱仪成为现实

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

窗函数 处理 可以对 FID 信号进行 数学处理，以提高信 噪比或提高分辨率 各种窗函数形式 (a) 未加权 FID; (b) 线性截趾 ; (c) 升指数函数 ; (d) 梯形函数 ; (e) 降 指数函数 ; (f) 卷积差函数 ; (g) 正 弦钟函数 ; (h) 移位的正弦钟函数 ; (i)LIRE; (j)Gauss 函数

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

改进灵敏度或分辨率的各种 方法比较 ( 计算机模拟谱 ) ( 左 ) 无噪声 ; ( 右 ) 含有噪 声 ; (a) 未加权波谱 ; (b) 梯 形函数 ; (c) 升指数函数 ; (d) 卷积差函数 ; (e) 正弦钟 函数 ; (f) LIRE; (g) Gauss 函 数

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉

相位 调整（ 调相 ）

•通常 Fourier 变换 得到的核 磁共振波谱需要进行调相 形成复数对的低频 FID 信号 经过 Fourier 变换得到复数 频域信号，相当于吸收信号 和色散信号，一般保留实部 当核磁化向量的起始相位为 零时，其实部对应于吸收信 号，虚部对应于色散信号 当核磁化向量的起始相位不 为零时，实部及虚部并不简 单地对应于吸收信号和色散 信号，而是它们的线性 叠加

BRUKER 谱仪 • sw: spectral width • gives the width of the acquired spectrum (on Bruker instruments, sw is in units of ppm, swh in units of Hz). • dw: dwell time • is the time spacing between sampling of two consecutive data points. • dw = 1/sw or dw = 1/2sw • The dwell time is determined by the inverse of the spectral width (or the inverse of twice the spectral width, depending on the quadrature detection mode).

• td: time domain data points • The number of points that are sampled is called "time domain" data points (td). The longer the FID is sampled the better will be the resolution in the spectrum provided • there is still signal in the FID. • aq: acquisition time • determines the total time during which a single FID is sampled • aq = td * dw • for 1D spectra, aq is set such that the signals have completely decayed towards the end of the FID (which corresponds to the transverse relaxation time T2). If aq is set to a shorter value, the resolution is lower, if aq is >> T2, only noise will be sampled at the end of the FID, and therefore the experimental time is unnecessarily prolonged.The complete measuring time for a simple 1D spectrum is approx. • ttot = ns (RD+aq) • in which ns is the number of scans and RD the relaxation delay (vide infra).

• ns: number of scans • the number of FIDs which are co-added. The signal to noise ratio of a measurement increases as • which means that in order to improve the S/N by a factor of two the measurement time must be increased by a factor of 4. Sometimes, the minimum number of ns is determined • by the phase-cycle of an experiment. • RD: relaxation delay • time between end of sampling of the FID and start of the next experiment. On Bruker instruments, the relaxation delay is characterized by the parameter d1. The effective • time for relaxation is given by the repetition rate • S • N ∀ ns