Nmr引言

核磁共振波谱及其 核磁共振波谱 在 生物学中的应用 2003 年 9 月 4 日

联系方法 生命科学学院结构生物学实验室 施蕴渝 3607464 yyshi@ ustc.edu.cn 牛小刚

教材 核磁共振原理及其在生物学中 的应用 夏佑林，吴季辉 ，施蕴渝 学习方式 上课，阅读，作业，

• http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/nmr-main. htm • http://www.ch.ic.ac.uk/local/organic/nmr.html • http://www.spincore.com/nmrinfo/

在大规模测序完成后 蛋白质科学成为新的科学 前沿 蛋白质是生物学功能 的主要承担者

"Proteins are central to our understanding of cellular function and disease processes, and without a concerted effort in proteomics, the fruits of genomics will go unrealized." Nature 409, 747 (2001)

基因组研究为蛋白质科学研 究创造了前所未有的机遇 人类： 约 3-4 万个基因 大约 10 万个蛋白 发现新蛋白 , 测定新结构 , 揭示新 功能

蛋白质组学

活细胞水平上生物学功能 分子机制

创新药物 的研 究的 基础

现有 483 个药物分子靶标 ，在未来结构基因组学研 究中可能扩大 10-20 倍。

PDB Holdings List: 2-Sep-2003 Molecule Type

Proteins, Peptides, and Viruses

E x p . T e c h .

X-ray Diffracti on and other NMR

Total

Protein/Nu Nucleic cleic Acid Acids Complexes

Carbohy total drates

17415

841

689

14

18959

2737

93

540

4

3374

20152

934

1229

18

22333

• 在日本第三代同 射光源 Spring-8 同 射工厂已于 1997 年 10 月建成，其中有 4 条结 构生物学光束线， 2 条结构基因 组专用光束线。

RIKEN NMR Park 规模化的核磁实验室 900 MHz x 4 800 MHz x 6 600 MHz x10

进一步 发 展为 40 台

蛋白 质三维 结构 测定的 主要方 法 • X- 射线晶体衍射 ， • NMR • 电镜三维 重构 • 交叉学科

核磁共 振波谱技 术 • PDB 数据库中 15- 20 % 结构 由 NMR 测定 • PDB 数据库 中， NMR 测定的 结 构 75% 无晶体 结构 • 精度相 当 2.0-2.5 A 的晶体结 构 • 最大 MW 30KD 260 个残基 • 预期上限 60~70 KD

• 发展迅 速 , 国际上给 以极大重

生物大分子的复杂性 推动核磁共振波谱学的发展 • 19 46 年， Purc ell 和 Bl och 观察到 核磁共振现象。 于 1952 年获得 诺贝尔 物理奖

• 1945 -1951 年间， 化学位移和 自旋偶 合的发现， NM R 技术的化学 应用。 • 1953 年 世界上第一 台商品化 NM R 谱仪 . • 1964 年 世界上第一 台超导磁场 的 NMR 谱仪 • 1971 年 世界 上第一台脉 冲傅立叶变 换 NMR 谱仪

NMR 在生物分子中的应用 • 开始于 50 年代 • 困难

•1976 年 R.R.Ernst 发表了二维核磁共振的理 论和实验的文章。获得 1991 年诺贝尔化学 奖

• 1979 年开始瑞士 K.Wuthrich 发展了用核 磁共振波谱测定生物大分子溶液结构的 方法首先将 2D-NMR 的方法用于蛋白质， 1982 年发表了用 2D-NMR 对蛋白质 1H 谱 进行分析的系统方法。 • 1998 年提出 TROCY 方法， 2002 年获诺 贝尔化学奖 Th e 200 2 Nob el Pr ize in C hemis try:

600MHz TXI 1H{13C/15N} with Z-gradient 2D NOESY 0.5 mM Lysozyme 90% H2O 10% D2O 50 mM NaCl

56 min.

多维 异核核 磁共 振 • 90 年代 • 13 C, 15 N 标记 , 多维异核核磁 共振波谱 • 2D NMR < 100 个残基 • 3D,4D NMR 15~35 KD • 相当 2.5A 分辨率晶 体结构 • •

多维 NMR CBCA(CO)NH triple resonance spectrum of 2mM RNase T1 in 90% H2O taken with a 600MHz Triple Resonance 1 H{13C/15N} NMR CryoProbeTM with Z-gradient. Experiment time for the full 3D spectrum was 3.8h and 2 scans were accumulated for each increment. The experiment time for the first 1H,13C plane of the CBCA(CO)NH experiment was 6min.

生物大分子核磁共振技术 不断发展 核自旋体系演化的密度算符理论 新的实验方法 , 新的脉冲序列 样品制备技术 , 标记技术 计算生物学 , 生物信息学

90 年代末结 构基 因组学 对 NMR 技术提 出新 的要求 1. 快速 测定蛋白质 的三维结构 2. 分子 识别 , 测定复合物 的三维结构 蛋白质 - 蛋白质 蛋白质 - 核酸 蛋白质 - 配基 3. 分子 柔性与运动 性 4. 膜蛋 白

新实验方法

生物样 品新 的标记 方法 • 13C/15N/ 2H 标记 蛋白质 • 13C/15N/ 标记 DNA 和 RNA • 选择 性标记 • 自旋 标记

Residual dipolar couplings 实 验 有希望用较少的实验数据 快速解出蛋白质结构

residual dipolar couplings 实验

Residual dipolar  couplings are  proportional  to (3 cos2 θ ­1) The additional information from magnetic interactions in partially aligned molecules allows the alignment of parts of the structures that are not well constrained by NOEs.0 J. H. Prestegard Nature Stuctural Biology, NMR II Special Issue. 1998

TROSY 实验 transverse relaxation optimized spectroscopy CRINEPT 实验 分子量 极限 被突 破 250kD

Line Width vs Frequency in TROSY τ c (ns) Mr 320 800,000 60 150,000 20 50,000 dN-H

0.104 nm

HSQC vs TROSY, Aldolase (78 kDa, 1 mM !)

Through Hydrogen Bonding Cross-hydrogen bond 3hJCO,N coupling constant:

Correlation between 3hJCO,N coupling constant value and the hydrogen bond length, RNO: RNO = 2.75 -0.25ln(3hJCO,N)+-0.06 JCO,N coupling constants give valuable additional information for a structure refinement 3h

90 年代末核磁共振波谱技术的 新进展 高场超 导核磁谱仪 的使用 900MHz •

800MHz

高磁 场谱仪 分

辨

率:

∆ ω ∝ ∆a (B0)

灵

敏

度:

S/N ∝ γ

5/2

(B0)3/2  磁各向异性 : m ∝ (B0)2 弛

豫

率 : R1,2 ∝ f (B0)

NMR Sensitivity & Dispersion H freq.

0.1% EB S/N CH2

Resolution

Price ($)

600MHz

1200:1

1.00

800k

700MHz

1512:1

1.17

1,400k

800MHz

1847:1

1.33

2,000k

900MHz

2110:1

1.50

4,500k

1

低温 探头 CryoProbe 30K Sensitivity 500MHz ~1-1.5GHz 节约测量时间

低样品浓度

Experiment Time Comparison a) sensitivity specification for standard TXI 5mm, 0.1% ethylbenzene: 500MHz: 900:1 b) sensitivity specifications for CryoProbeTM TXI 5mm, 0.1% ethylbenzene: 500MHz: 600MHz: 800MHz

3000:1 4000:1 6000:1

c) relation between experiment time and sensitivity*: experiment time = (SNCryoProbe/SNstandard probe)2 * assuming ideal conditions

Experiment Time Comparison Experiment times: Comparison conventional versus CryoProbes

2.8%

800MHz

6.3%

600MHz

CryoProbe Conventional Probe

11%

500MHz 0

20

40

60

80

100 %

Automated structure analysis

生物大分子 NMR 能提供什 么重要信息

NMR 在生物大分子上的应用 • 蛋白 质三维 结构 测定 , 原子 分辨 率下的 结构 与功能 研 究 • 分子 柔性与 运动 性 • 复合 物结构 测定 , 分子识 别 • 膜蛋 白

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

核磁共 振在 生物科 学 中的 主要应 用 •测定生 物大分 子空 间结构 •研究生 物大分 子与 配基的 相互 作用 •测定生 物大分 子的 动力学 性质 •跟踪蛋 白质的 折叠 过程 , 捕获折 叠过程 中瞬 态中间 物 •测定可 滴定基 团的 解离常 数 •测量溶 液中分 子的 扩散系 数 •研究酶 反应机 理 •跟踪活 细胞的 代谢 过程 •用于医 学成像 以及 神经科 学中 的脑功 能成 像

膜蛋 白 • 受体，离子通道 药物 作用靶点 • PDB 数据库 中 < 30 个膜蛋 白 , • ~160 00 水溶性蛋 白 •人 ~360 00 个基因 • ~10 万个蛋 白质 • 真核细胞中 ~3 0% 膜蛋白 • < 0. 2% 膜蛋白结

膜蛋白 结构 • 蛋白质晶体学 , 电镜三维重构 • NMR 小肽 <50 残基 , 蛋白质 • 在去垢剂形成的微胶囊 (micelles) 中 , 液 体 NMR • 在去垢剂或脂形成的双层微胶囊 (bicelles) 中 , 液体 NMR • 在脂形成的脂双层 (bilayers), • 固体 NMR

蛋白质动 力学 • • • • •

蛋白质 运动性和功 能有密切关 系 酶的柔性运动性 与酶反应机 理 NM R 弛豫时间 1 H/ 2 D 交换速率

药物设计 和筛 选 • 高通量筛 选 • 设计，筛 选结合

•SAR － By-NM R 选

药物筛

药物设计 和筛 选

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

蛋白质 折叠 –去折 叠研究

• Schematic diagram summarizing the roles of unfolded, partially folded proteins, and misfolded proteins in biology.

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

捕获折 叠过程中瞬 态中间物

用 NMR 连续监 测蛋白质复 性过 程

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

•

Stopped-flow 19F NMR spectra of the refolding of 6-19F-tryptophan labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase following dilution from 5.5 to 2.75 M urea at 5 °C in the presence of 3.8 mM NADP+

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

平衡常数 测量 A + B ← → AB k ,k 1

−1

围棋高级认知功能的 fMRI 研究 1. 围棋 - 高级智能 中华 文化 瑰宝 2. 专业棋 手 - 高级智 能学习 3. 围棋 - 象棋比 较 : 为人工 智能提 供启示 国际象 棋：计 算 机 - 战胜 - 世界 冠军 围　　 棋：业 余棋 手 - 战胜 - 计 算 机 反射 镜

BLANK

30sec

RANDOM 30sec

GAME

30sec

BOLD signal change (%)

BOLD signal time course in left and right BA7 6 4 2 0 -2 -4 0

30

60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 Time (s)

A. ( 上 ) 围棋

B. （下） 国际 象棋的 fMRI 结果

围棋 与国际 象棋 的区别 ：较 强的激 活 围 棋 - 右侧， 国际 象棋 - 左侧。 有证 据表明 : 右半球 参与整 体水 平加 工 . 本结果 提示 ： 围棋 -- 更依赖于 - 整体 水平 加工，

Left Right

国 际象 棋 -- 更注 重于 - 局部计 算。

Genome, Proteome, Metabolomics, Systems Biology

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

核磁共振 现象 •核磁共振（ Nuclear Magnetic Resonance ， 简写为 NMR ），是指核磁矩不为零的核， 在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼 分裂（ Zeeman Splitting ），共振吸收某一 特定频率的射频（ radio frequency 简写为 rf 或 RF ）辐射的物理过程。

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

核磁矩与磁 场的相 互作用

1

H,13C,15N 等核自旋量子数 I=½, 在外磁场中有两种取

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

核磁 能级间 的跃 迁

核磁共振基本原理 - 引言 吴季辉

乙醇 CH 3 CH 2 OH 的 1H 谱