5 Qldb Nlktcdbts Cao Hoc 14-22-09 08

Nguyên lý và ứng dụng của phương pháp PCR trong phát hiện và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản

Chẩn đoán bệnh ở thủy sản Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào: 2. tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang được áp dụng ở phòng thí nghiệm 3. lảnh vực nghiên cứu của người chẩn đoán 4. những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ sở các loài địa phương.

Chẩn đoán bệnh ở thủy sản Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn xác có ý nghĩa rất quan trọng.

Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu 1. thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh 2. thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv, cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu. 3. số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích → Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh.

Các vấn đề khác Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép phân tích mà kết quả thu được có tính định lượng để xác định kết quả âm tính và dương tính. Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và dương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật.

Tính hiệu lực của phương pháp Một phương pháp phân tích có tính hiệu lực là phương pháp có thể cho ra kết quả phân biệt rỏ ràng giữ kết quả dương tính và âm tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm bệnh và không bị nhiệm bệnh. Tính hiệu lực của phương phá biểu hiệu qua hai đặc điểm: – –

Tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay không) Tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có nhiễm bệnh)

Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu. Trong trường hợp khác kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học.

Tính ổn định của phương pháp Một phương pháp được gọi là ổn định khi phương pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống nhau sau nhiều lần lập lại. Hai yếu tố quyết định cho tính ổn định của phương pháp là: - biến động giữa các cá thể phân tích - biến động giữa các lần đọc kết quả

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Giải Nobel hóa học (1993)

Kary Mullis

Phương pháp PCR là gì?

PCR là phương pháp khuếch đại nhanh và nhạy có chọn lọc môt trình tự DNA/RNA nhất định từ một mạch khuôn axit nucleic

Nguyên tắc   Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen).

Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.

Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tồng hợp. Hai mồi này gồm mồi xuôi và mồi ngược theo chiều phiên mã gen. PCR.EXE

Các giai đoạn của PCR Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 92-95 oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 37-65 oC tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1phút. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 70-72 oC giúp cho ADN polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.   Chu kỳ gồm ba giai đoạn nói trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng ADN của lần trước. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu. PCR.EXE

Giai đoạn Biến tính 90 80 70 60 50 40

Giai đoạn lai 90 80 70 60 50 40

Giai đoạn kéo dài 90 80 70 60 50 40

Sản phẩm PCR đầu tiên

Khuếch đại trình tự mong muốn

Thành phần của PCR • • • •

Mạch khuôn (template) Mồi (Primers) dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP Thermostable DNA polymerase (enzym chịu nhiệt xúc tác quá trình tổng hợp DNA) • PCR buffer (dung dịch PCR): có chứa Mg2+ cần cho hoạt động của men DNA polymerase CD

Mạch khuôn • • • •

Hệ gen DNA Hệ gen RNA, mRNA Máu (huyết tương) Các mô cơ thể (i.e. nơi bị nhiễm)

Thiết kế mồi • Mồi thường được thiết kế có trình tự bổ sung với mạch khuộn DNA • Chiều dài đoạn mồi khoảng 20-30 nt

3’

T A C A G A T G T C

5’

• Nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-65°C và tương thích giữa mồi xuôi và mồi ngược • Mồi cần phải có xấp xỉ số bazơ nitơ A, T, G,C và tránh các vùng polypurines hay polypyrimidines

5’

3’

• Tránh sự tạo thành hairpin loop • Trình tự phần đầu 3’ kết thúc (3’-end) của mồi không bổ sung nhau (để giảm “primer dimer”)

OH 3’

5’ 3’HO

5’

5’

3’

Web thiết kế mồi • GenomeWeb Primer Design at MRC http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/nuc-primer.html • Primer 3 at the MTI Whitehead Institute http://www.genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3_www.cgi • GeneFisher at Bielefeld University, Germany http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/ • Standford University’s Web Primer http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer • NetPrimer by Premier Biosoft International http://www.premierbisoft.com/netprimer.html

Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperature-Tm) Mồi ngắn hơn 20 nucleotides Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Mồi từ 14-70 nucleotides Tms = 81.5 + 16.6 (log10 [J+] + 0.41 (%G+C) - (600/l)

Mồi từ 20-35 nucleotides Tm = 22 + 1.46 [2(G+C)+ (A+T)]

Chu kỳ nhiệt

Biến tính 93°C - 95°C

Biến tính 92°C- 95°C

25-35 CYCLES

Kéo dài

Lai

70°C-72°C

37°C- 65°C

Bước 1 Biến tính (92oC - 95oC) tách hai mạch AND xoắn kép thành 2 mạch đơn Bước 2 Lai (37oC - 65oC) Mồi lai với trình tự bổ sung trên mạch khuộn DNA Bước 3 Kéo dài (70oC- 72oC) polymerase tổng hợp DNA mới

Exponential amplification (khuếch đại theo cấp số nhân)

Số bản sao được tạo ra

Plateau Effect Sảm phẩm theo lý thuyết

1013

10

Sản phẩm thực tế 11

109

107

105

“Exponential phase” 0

10

20

“Plateau phase” 30

Số chu kỳ

40

50

60

Tối ưu hóa PCR • DNA template concentration – Hàm lượng: 5-100 ng – Tinh sạch

• • • • •

Nồng độ MgCl2 : 1.0 - 6.0 mM Taq DNA polymerase: 1-5 units Nhiệt độ lai Số chu kỳ PCR: 25-40 cycles Thể tích PCR: 13-100 µl

Các dạng PCR • PCR một bước (one steo PCR): thao tác cơ bản • PCR 2 bước (PCR tổ-Nested PCR): sử dụng hai cặp mồi • PCR phức (Multiplex PCR): khuếch đại đồng thời hai hay nhiều đoạn DNA mục tiêu trong một mẫu • PCR phiên mã ngược (RT-PCR): định tính biểu hiện gen hoặc phát hiện vi-rút RNA • PCR thời gian thật (RealTime PCR)

Nested PCR

Mồi F1

Mạch khuôn Mồi R1 Mồi F2

Sản phẩm PCR thứ nhất Mồi R2

Sản phẩm PCR tổ

Ưu và khuyết điểm của nested-PCR • Tăng tính đặc hiệu (do sử dụng 2 cặp mồi) • Tăng độ nhạy (khuếch đại 2 lần) • Sử dụng để phát hiện sinh vật hiện diện ở mức thấp

Rủi ro do ngoại nhiễm cao

Multiplex PCR • Phương pháp phát hiện nhanh cùng lúc nhiều đoạn AND trong cùng một phản ứng • Hổn hợp PCR có nhiều cặp mồi – Từ nhiều sinh vật – Từ nhiều gen của cùng một sinh vật • Ưu điểm quan trọng là giảm thời gian phân tích mẫu

Multiplex PCR

Multiplex PCR of WSSV & HPV

M N 1 2 3 4 5

262 bp HPV 232 bp WSSV 122 bp nội chuẩn

Nguyên lý của RT-PCR

AAAAAA 3’ TTTTTT

mRNA 5’

Tổng hợp mạch cDNA thứ nhất

Reverse transcriptase

AAAAAA TTTTTT

mRNA 5’ 1st stranded cDNA 3’

3’ 5’

RNaseH

Cắt mạch khuôn RNA

AAAAAA TTTTTT

5’ 3’

3’ 5’

DNA polymerase

Tổng hợp mạch cDNA thứ 2 AAAAAA TTTTTT

5’ 3’

Double stranded cDNA

3’ 5’

Phương pháp PCR bao gồm các bước:

2.

Ly trích DNA/RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn

3.

Chuẩn bị các thành phần của phản ứng (PCR mix)

4.

Khuếch đại bằng máy chu kỳ nhiệt

5.

Điện di

6.

Đọc kết quả

Đối chứng Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phải có những đối chứng sau: •

Không có ADN/ARN (chung am) phản ứng PCR không có mạch khuôn ADN để kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm

•

ADN/mRNA của vật chủ: (noi chuan) để chắc chắn axit nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiêu với hệ gen của vật chủ

•

Đối chứng dương: phản ứng PCR có mạch khuôn ADN đặc hiệu với mồi

Giếng 1-2 là sản phẩm khuếch đại bước 1 Giếng 4 là mẫu đối chứng dương Giếng 5, 6 và 7 là những mẫu dương tính với WSSV Giếng 8 là mẫu đối chứng âm.

Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ Thủy sản ban hành năm 2004. (nguồn: http://www.fistenet.gov.vn/standard.asp)

Gel chuẩn dùng chẩn đoán WSSV kit IQ2000

Cột 1: Mẫu nhiễm WSSV nặng Cột 2: Mẫu nhiễm WSSV trung bình Cột 3: Mẫu nhiễm WSSV nhẹ Cột 4: Mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ Côt 5: Mẫu không nhiễm WSSV Cột 6: Nước cất Cột 7: Mẫu chuẩn một, 2000 bản sao/phản ứng Cột 8: Mẫu chuẩn hai, 200 bản sao/phản ứng Cột 9: Mẫu chuẩn3, 20 bản sao/phản ứng Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp Những mẫu WSSV âm tính chỉ hiện lên vạch 848 bp là DNA của tôm.

Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000

Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng Cột 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng Cột 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng Cột 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng Cột 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng Cột 7: Mẫu nhiễm YHV nặng Côt 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ Cột 9: Mẫu nhiễm GAV nặng Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ Cột 11: Mẫu âm tính YHV/GAV Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp

Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000

Phương pháp chẩn đoán Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng 2. CộtNhững mẫu YHV/GAV âm chỉ hiện 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bảntính sao/phản ứng vạch 848 bp là RNA thông tin Cộtcủa 3: Mẫu tôm.chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng 4: Mẫu chuẩn nhiễm bảnứng sao/phản 3. CộtNếu mẫu hiện lên GAV vạch2000 tương với ứng vạch 277 bp và vạch 777 bp thì Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng mẫu nhiễm YHV nặng. Cột 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng 4. CộtNếu mẫu chỉYHV hiệnnặng vạch tương ứng vạch 277 bp thì mẫu nhiễm YHV nhẹ. 7: Mẫu nhiễm 8: Mẫu nhiễm 5. CôtNếu mẫu hiệnYHV lênnhẹ vạch tương ứng với vạch 406 bp và vạch 777 bp thì Cộtmẫu 9: Mẫu nhiễmGAV GAV nặng nhiễm nặng. Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ 6. CộtNếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 406 bp thì mẫu nhiễm GAV nhẹ. 11: Mẫu âm tính YHV/GAV 7. CộtNếu mẫu lượng chỉ hiện tương ứng848, vạch 680 M: Trọng phânvạch tử được đánh dấu, 630, 333bp bp thì mẫu âm tính YHV/GAV.

Các hạn chế của phương pháp PCR 1. Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb (kết quả tốt với các đoạn DNA dưới 1.5 kb) 2. Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước 3. Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic)