4. Analisis Cuantitativo De Carbohidratos

Misión del programa: “La formación de profesionales químicos que lideren el desarrollo, potencien la investigación y apoyen el aprovechamiento de los recursos naturales del entorno mediante procesos científicos y tecnológicos”.

UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS, Escuela de Ciencias Químicas Laboratorio de Bioquímica II

Compilador: Angélica María García T 4. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE CARBOHIDRATOS Material a traer por parte del estudiante: cinta de enmascarar o marcador para rotular, papel de aluminio, gotero (2), guantes, tapabocas, jabón, toalla (2, una para uso personal y otra para el trabajo práctico). INTRODUCCIÓN Los monosacáridos o azúcares simples están constituidas por alcoholes polivalentes con una función aldehído o cetona. Son por tanto polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas. Están formados por C, H, O y corresponderán a la formula (CH2O)n en donde n=3 o un número mayor. Los más frecuentes son las pentosas (C5H10O5) como la más importante se cuenta la Ribosa y las hexosas (C6H12O6), siendo la más abundante la Glucosa. Por otra parte, los disacáridos son compuestos derivados de los monosacáridos al unirse dos de estos por un enlace acetal o glucosídico. Según se establezca este tipo de enlace, existen disacáridos reductores y no reductores. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación y todos ellos se basan en el mismo principio: Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. Una de las técnicas analíticas más reconocidas consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma, así la espectrofotometría permite relacionar la cantidad de radiación absorbida por una sustancia con la concentración de esa misma mediante la Ley de Lambert-Beer. CONSULTA PREVIA A LA PRÁCTICA a. Indique el fundamento químico y espectrofotométrico de cada una de los siguientes métodos: Benedict, método colorimétrico fenol-H2SO4 para la determinación de carbohidratos totales, método para la determinación de azúcares reductores por el DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico). b. Dibuje las representaciones de Fisher, Haworth, bote y silla para la glucosa. c. Realice un diagrama de flujo de la practica a realizar. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales: 18 tubos de ensayo, 1 gradilla, 2 vasos de precipitados de 100 y 400 mL, vaso de 600 mL, pipeta de 1, 5 y 10 mL, pipeteador, pinza para tubos de ensayo, 10 tubos de centrifuga, 2 varillas de agitación, probeta, papel indicador, plancha de calentamiento, estufa a 80°C, espectrofotómetro. Reactivos: agua destilada, glucosa/sacarosa 0,05M, monosacárido M1, disacárido M2, jugo M3, fenol al 80%, H2SO4 concentrado, Test de Nelson, HCl concentrado, NaOH 3M, glucosa 0,05M, reactivo de Benedict (solución 1: 173 g de citrato de sodio, 100g de Na2CO3 anhidro y completar hasta 850 mL con agua, agite. Solución 2: 17.4 g de sulfato de cobre pentahidratado en 100 mL de agua. Luego adicione la solución 2 a la 1, este es el reactivo final).

PROCEDIMIENTO 1. Determinación Cuantitativa (espectrofotométrica) de azúcares totales 1.1. Preparar el siguiente set de tubos: mL

Tubo

1

2

3

4

5

6

H2O 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 glucosa/sacarosa 0,05 M 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Muestra prob. 1 Muestra Prob. 2 Muestra Prob. 3 Fenol al 80% (tome la fase orgánica) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Homogenizar y dejar reposar durante 15 minutos H2SO4 conc. 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Homogenizar y dejar reposar durante 30 minutos

X1

X2

X3

0,25

0,25

0,25

0,25 0,25 0,05

0,05

0,25 0,05

1,5

1,5

1,5

Lea la absorbancia de los tubos a 492 nm (si las muestras están demasiado coloreadas, considere dilución y tenga en cuenta factor de conversión), tomando el tubo 1 como blanco. Determine la concentración (mg/mL, glucosa/sacarosa) de cada una de las muestras problema. No olvide el factor de dilución que deba utilizar, según el caso. 2. Reconocimiento poder reductor de la muestra 2.1. Al ser entregadas tres muestras problema por grupo (un monosacárido, un disacárido y un jugo), es necesario determinar si se trata o no de un azúcar reductor y/o si es necesario realizar un proceso de hidrólisis previo a los análisis cuantitativos de Benedict. Por ello, realice el test de Nelson aplicado en la práctica anterior (práctica No. 3). 2.2. Test de Nelson. En tres tubos de ensayo por separado, adicione 0,5 mL de muestra problema, agregue 0,5 mL de reactivo de Nelson. Coloque los tubos en un baño maría por 20 minutos. La formación de un precipitado de Cu2O color pardo indica que el azúcar redujo el Cu2+ presente en el reactivo de Nelson a Cu+ probándose así el efecto reductor del azúcar. Si este test da negativo repetir el ensayo después de la hidrólisis ácida. 2.3. Hidrólisis Ácida: Tomar 1,0 mL de la muestra problema, acidificar con 0,5 mL de HCl concentrado. Colocar el tubo en baño de agua hirviente por media hora. Tome 0,5 mL de la muestra ya hidrolizada y neutralice en frío (gota a gota) con NaOH. 2.4. Continúe con el procedimiento únicamente para las muestras que hayan presentado poder reductor en el test de Nelson (con o sin hidrólisis). Para las muestras que fue necesario hidrolizar, realice las posteriores pruebas con la muestra ya hidrolizada y neutralizada según numeral 2.3. 3. Determinación cuantitativa (peso promedio) de azúcares reductores 3.1. Tome 7 tubos para centrífuga, márquelos según la tabla y péselos. A continuación, realice el siguiente set de tubos: Tubo mL Glucosa 0,05 M Muestra prob. 1 Muestra Prob. 2 Muestra Prob. 3 R. Benedict

1

2

3

4

0,25

0,5

1,0

1,25

X1

X2

X3

0,5 0,5 2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

0,5 2,5

Homogenice y caliente durante 30 minutos en baño maría a ebullición. Deje enfriar y centrifugue durante 10 minutos. Decante el líquido. Seque los tubos con sus precipitados en una estufa a 80-100°C. Una vez secos, déjelos enfriar y péselos.

3.2.

Calcule las concentraciones en mg ó µg de glucosa de los 4 primeros tubos. Posteriormente utilizando los pesos de los precipitados obtenidos [Cu(OH)2 ], grafique producto obtenido vs. Concentración (mg o µg) de glucosa. Determine la concentración de las muestras problema.

RESULTADOS Analice y discuta los resultados obtenidos incluyendo las correspondientes observaciones cualitativas así como la o las reacciones químicas correspondientes. Presente sus resultados de la forma más clara posible apoyándose en el uso de tablas, gráficos, etc.

NO OLVIDE ENTREGAR COPIA DE LA HOJA DE RESULTADOS AL PROFESOR. BIBLIOGRAFÍA La presente práctica fue diseñada tomando como pauta base: CANO, H. 2008. Manual de Laboratorio de Bioquímica. Universidad Industrial de Santander, Facultad de Ciencias, Escuela de Química, Bucaramanga, Colombia. MIGUEZ, J.B.1997. Prácticas de bioquímica. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Facultad de Ciencias, escuela de Química, Tunja, Colombia. Textos de apoyo: LEHNINGER, A., NELSON; D.; COX, M. 2004. Lehninger Principles of Biochemistry. Macmillan Higher Education, 4a ed. VOET, D., VOET, J. 2002. Biochemistry. Wiley & Sons. 2ª ed. Canada. BOHINSKI, R.C. 1991. Bioquímica. Addison-Wesley-Longman, 5ª ed. México D.F. México.

Visión del programa: “El programa de química de la UPTC para el año 2019 se proyecta en el ámbito nacional como uno de los líderes en la gestión y desarrollo de procesos de investigación, apropiación, adaptación e innovación de ciencia y tecnología en química”.

UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA PROGRAMA DE QUÍMICA LABORATORIO BIOQUÍMICA II HOJA DE RESULTADOS

4. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE CARBOHIDRATOS

Nombres:___________________________________________________________________ Sección/grupo: ________________

Grupo de muestras_______ Muestra problema 1: Monosacárido_______ disacárido o jugo_______ Muestra problema 2: Monosacárido_______ disacárido o jugo_______ Muestra problema 3: Monosacárido_______ disacárido o jugo_______

1. Determinaciones espectrofotométricas Azúcares totales (Fenol-H2SO4) A492nm Concentración 1 2 3 4 5 6 X1 X2 X3

En el informe En el informe En el informe

2. Determinación cuantitativa por el método de Benedict Muestra Peso final de la muestra (g)

1

2

3. Observaciones adicionales:

3

4

X1

X2

X3