3. Meccanismi Di Desensitizzazione E Tachifilassi

Meccanismi di desensitizzazione e tachifilassi • Sono quei meccanismi che rendono conto del fatto che lo effetto di un farmaco gradualmente diminuisce quando il farmaco è dato continuamente o in modo ripetuto. • Meccanismi di desensitizzazione si osservano già nei batteri: è questo il fenomeno della chemiotassi. Negli eucarioti tale meccanismo si attua non soltanto nei confronti di molecole esogene come i farmaci, ma anche per sostanze endogene o ormoni e in tal senso i meccanismi di desensitizzazione vanno visti come fenomeni adattativi, che sviluppatisi nel corso dell’evoluzione, hanno persistito in quanto sono di fondamentale importanza per proteggere l’organismo da una eccessiva stimolazione. • Sono meccanismi che si instaurano nell’arco da minuti a ore

• Tolleranza: • in seguito alla somministrazione prolungata di un farmaco, l’effetto diminuisce. • Occorre aumentare la dose per avere lo stesso effetto. • Una tolleranza può instaurarsi lentamente in seguito alla somministrazione cronica di un farmaco o può instaurarsi rapidamente (tolleranza acuta) in seguito a modificazioni rapide di conformazione del recettore tipiche del recettore ionotropo o per fenomeni di tachifilassi: esaurimento del mediatore

Fenomeni di tolleranza possono essere dovuti a Fenomeni cellulari: • cambiamenti di conformazione dei recettori (tolleranza rapida, esempio recettore nicotinico) • perdita dei recettori (tolleranza lenta, esempio delle catecolamine, degli oppiodi: morfina) • esaurimento del mediatore (tachifilassi propriamente detta, tolleranza rapida, esempio tolleranza alla tiramina) Fenomeni metabolici • cambiamenti a carico di enzimi del metabolismo (tolleranza lenta, esempio del fenobarbital) Adattamenti fisiologici :(tolleranza lenta, esempio le azioni di un farmaco che abbassa la pressione sono compensate in via riflessa da un aggiustamento pressorio)

Desensitizzazione del recettore nicotinico Blocco di fase I o da depolarizzazione. E’ dovuto alla perdita di eccitabilità elettrica che si verifica durante un periodo di protratta depolarizzazione ed è dovuto a inattivazione dei canali al sodio voltaggio dipendenti Blocco di fase II è dovuto al fenomeno della desensitizzazione recettoriale • Un blocco di fase I e II può essere ben osservato”in vitro” con la nicotina. • Un blocco di fase I e II può essere osservato “in vivo” con la succinilcolina agente depolarizzante che induce un blocco iniziale di fase I e poi II. La succinilcolina è un agente coadiuvante degli anestetici generali in quanto induce miorilassamento

Stato di Riposo

------------------------- Stato Attivo -----------------------/ Il recettore è attivabile / \ / \ / Stato Refrattario Il recettore non è attivabile • • •

Stato di riposo il canale è chiuso e l’affinita è alta Stato attivo il canale è aperto e l’affinità diminuisce Stato refrattario il canale è chiuso e l’affinità è alta

Quando l’agonista permane sul recettore per un lungo tempo, il recettore entra nel cosiddetto “stato refrattario”. Studi iniziali su membrane di Torpedine vescicolate che mantengono la integrità dei canali ionici e più di recente, studi in patch clamp che hanno permesso lo studio dei flussi ionici sono stati messi in relazione con studi di binding su membrane. Tali studi hanno messo in evidenza che il recettore nello stato di riposo e attivato ha una affinità per il recettore più bassa che nello stato refrattario (Kd nell’ordine del 50-100 uM contro una Kd di 1-3 nM nello stato refrattario). Questo rende conto di un forte legame del recettore con l’agonista pur non aprendosi il recettore. Man mano che l’agonista è lavato in studi “in vitro” o degradato lentamente “in vivo” è allontanato dal recettore il recettore torna nello stato di riposo e quindi attivabile.

Risposte di desensitizzazione del recettore nicotinico sono mediate dal “binding site” della acetilcolina (subunità alfa 1 e alfa 2) ma possono essere modulate nel senso di una accellerazione dello stato di desensitizzazione del recettore nicotinico da: •

da antagonisti non competitivi della acetilcolina: antagonisti non competitivi del recettore nicotinico legano dentro il canale come la istrionicotossina o ad un sito allosterico a bassa affinità posto alla interfaccia del recettore con la membrana. Questi ultimi sono: -Gli anestetici locali -La fenciclidina: la “polvere degli angeli” -La clorpromazina bloccante dei recettori D2 dopaminergici, farmaco antipsicotico

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da mediatori intracellulari: proteino chinasi cAMP dipendenti:Kinasi cAMP dipendenti, fosforilando il recettore sulle subunità gamma e delta ne accellerano lo stato di desensitizzazione

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dal potenziale elettrico della membrana: la iperpolarizzazione accellera lo stato di desensitizzazione

Kinasi cAMP dipendenti fosforilano il recettore nicotinico accellerandone lo stato di desensitizzazione. La protein chinasi C e la tirosino chinasi fosforilano il recettore, non è però certo se accelerano lo stato di desensitizzazione del recettore.

• Proteino chinasi si sono rivelate importanti nei processi di desensitizzazione rapida: • Le proteino chinasi A che è cAMP dipendente che fosforila il recettore su residui di serina e le GRK (famiglia di chinasi che fosforilano i recettori legati a proteine G). La prima GRK identificata è stata βARK: β adrenoceptor kinase) che è cAMP indipendente e fosforila il recettore su residui di serina e treonina • I siti fosforilati sono stati identificati con studi di recettori mutanti transfettati in fibroblasti di Hamster cinese

Fenomeni di fosforilazione tipicamente rendono conto della desensitizzazione del recettore beta per le catecolamine. Oggi sappiamo che una varietà di altri recettori accoppiati alle proteine G desensitizzano con lo stesso meccanismo Due meccanismi di desensitizzazione sono stati evidenziati: • Una fase di disaccoppiamento: - fenomeno rapido che si instaura nell’arco di minuti (richiede quindi brevi esposizioni all’agonista) - dipende da fenomeni di fosforilazione del recettore - può accompagnarsi a sequestro dei recettori che vengono internalizzati ma non distrutti: sono solo transientemente rimossi dalla superficie cellulare - non si misura una diminuizione del numero dei recettori -si può misurare una riduzione di affinità • Una fase di “down regulation”: - fenomeno lento che si instaura da minuti a ore (richiede esposizioni all’agonista di almeno un’ora) -- si ha un processo di endocitosi dei recettori che vengono poi distrutti - si registra una progressiva diminuizione del numero di recettori

• La fosforilazione da parte di βARK procede solo se è presente una proteina intracellulare, l’arrestina, che svolge un ruolo nel disaccoppiamento del recettore dalla proteina Gs: • La fosforilazione da parte di βARK induce una modificazione conformazionale del recettore che si lega ad “arrestin like protein” e non più a Gs • L’arrestina è stata inizialmente identificata nella retina dove legandosi al recettore alla luce (rodopsina) impedisce un corretto legame con transducina impedendone così il funzionamento che consiste nella attivazione di fosfodiesterasi che idrolizzano il cGMP

• Il recettore internalizza legato a proteine come “arrestin -like protein” che ne impedisce il legame con la proteina Gs. • Altre proteine involte nel fenomeno della desensitizzazione e internalizzazione del recettore sono la clatrina, la caveolina

• Il recettore β internalizzato colocalizza con i recettori della transferrina che sono un marker delle membrane degli endosomi i quali hanno la funzione: • di sequestrare le proteine recettoriali e riciclarle sulla membrana • oppure dirigerle verso i lisosomi dove verranno distrutti • Gli endosomi sono così una struttura che permette il sequestro il riciclo o la “down regulation”

• Il fenomeno della “down regulation” del recettore beta è stato ben descritto “in vitro” su colture cellulari esposte per 8 hr ad un agonista. • Il numero di recettori è ridotto al 10% e possono essere necessari alcuni giorni perché il numero torni normale. • “In vivo” una down regulation del beta recettore è descritto in seguito a trattamento cronico con farmaci antidepressivi inibitori del reuptake delle catecolamine

• Desensitizzazione omologa: GRK (βARK) Il recettore si desensitizza in seguito all’interazione con l’agonista di quel recettore (ex: recettore β adrenergico si desensitizza alla isoprenalina) • Desensitizzazione eterologa: proteino chinasi A e la chinasi C Il recettore si desensitizza in seguito all’interazione di altri agonisti non correlati strutturalmente e che agiscono tramite altri recettori. Altri agonisti che attivano recettori che determinano una attivazione di Gs stimolatorie (ex. recettore muscarinico) sulla produzione di cAMP e conseguente attivazione della chinasi A possono desensitizzare il recettore β)

La proteina βARK • è stata clonata dal gruppo di Leflowitz • ha analogie con la famiglia delle proteino chinasi C • derivano da un comune gene ancestrale? • È maggiormente presente a livello del cervello, milza, cuore, dove sono presenti anche i più alti livelli di catecolamine Le osservazioni che βARK: • media una desensitizzazione omologa quando sperimentalmente sono utilizzate alte concentrazioni di un β agonista e un alto numero di recettori è occupato • che è presente in maggior quantità in distretti dove la trasmissione catecolaminergica è altamente attiva hanno portato a speculare sui ruoli fisiologici di βARK e oggi sappiamo anche di altre GRK • βARK sarebbe involta nei processi di desensitizzazione omologa alla sinapsi per limitare l’eccessiva stimolazione del recettore beta conseguente ad un aumentata trasmissione noradrenergica ( ex: in presenza di farmaci inibitori del reuptake delle catecolamine come gli antidepressivi triciclici). • Prospettiva farmacologica è quella di poter modulare una desensitizzazione recettoriale con farmaci che vanno ad interagire con proteino chinasi involte nella desensitizzazione recettoriale.

Meccanismi di endocitosi e “down regulation” sono stati ben descritti per il recettore tirosino chinasico e per il recettore intranucleare agli ormoni steroidei. La desensitizzazione del recettore tirosino chinasico (insulina e fattori di crescita) studiata con EGF involge: • 1) una riduzione di affinità per il ligando • 2) una inibizione della attività tirosino chinasica • 3) una internalizzazione e “down regulation” • 4) il recettore può essere desensitizzato eterologamente ad opera della proteino kinasi C La desensitizzazione del recettore intracellulare per gli ormoni steroidei involge: • una riduzione della trascrizione di DNA e quindi sintesi del recettore e in un secondo momento ad • aumento della sua distruzione

Fenomeni di “up regulation” • Supersensitività da denervazione alla giunzione neuromuscolare: in seguito a denervazione di fibre motorie i recettori nicotinici si estendono anche nella zona extragiunzionale. Questo rende conto del fenomeno definito come “ipersensibilità da denervazione” agli agenti colinergici • Alla base di tale fenomeno esiste una: • Diminuizione delle concentrazioni di Ca++ intracellulare • Diminuita attività di chinasi Ca++calmodulina dipendenti inibitorie sulla espressione genica di alcune subunità del recettore nicotinico • La up regulation si accompagna anche a modificazioni della composizione delle subunità del recettore

Fenomeni di up regulation sono alla base delle discinesie che si verificano nella malattia di Parkinson. Nella malattia in seguito alla massiva degenerazione dei neuroni dopaminergici si sviluppa una supersensitività del recettore dopaminergico che è responsabile di una risposta esagerata alla L-DOPA. Tali discinesie scompaiono infatti riducendo la dose di L-DOPA