12.- Mycobacterium

PRÁCTICA # 12 “MYCOBACTERIUM” OBJETIVOS • • • •

Describir las técnicas y fundamentos implicados en los métodos baciloscópicos que detectan la presencia de micobacterias en las muestras. Diferenciar microscópicamente entre los bacilos ácido-alcohol resistentes y otros microorganismos Reportar adecuadamente el hallazgo de bacilos acido-alcohol resistentes (BAAR) en las extensiones preparadas a partir de muestras patológicas Describir las medidas de precaución bajo las cuales se deben efectuar el cultivo de las micobacterias patógenas y su identificación

INTRODUCCIÓN Características generales del género mycobacterium Género Mycobacterium Características generales Metabolismo Bacilos delgados Aerobios 1-4 micras por 0.3 – Catalasa positivos 0.6micras Extremos redondeados Nitrato positivos Grampositivos Niacina positivos Ácido alcohol resistentes Glucosa positivos No esporulados Arabinosa positivos No encapsulados Lactosa negativos Sacarosa negativos Sulfhídrico negativos Indol negativos Temperatura de crecimiento 37ºC Ph de crecimiento 7.4 a 7.8 Produce pigmento amarillo El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3 a 5µm de longitud o curvos en forma de maza, inmóviles, no esporulados, con abundantes gránulos citoplasmáticos, que poseen una resistencia mayor a la tinción por los colorantes comunes, pero una vez teñidos son resistentes a la decoloración con una mezcla de alcohol ácido. Desde el punto de vista de los requerimientos atmosféricos algunos son aerobios y otros microaerófilos. En cuanto a la velocidad de crecimiento algunas especies son de crecimiento rápido y otras lento. Se destaca en su estructura una gran riqueza en lípidos (20-60%). El contenido de bases de guanina más citosina en la molécula de ADN es de 62 a 70 moles %. El género comprende 50 especies, entre ellas patógenos primarios, oportunistas y saprofitas. Importancia Las Mycobacterias son agentes de enfermedades infecciosas que han acompañado al hombre a lo largo de su historia. Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae son los agentes etiológicos más frecuentes de las dos enfermedades más conocidas de este género. Poco tiempo después que Roberto Koch en 1882 descubriera M. tuberculosis, fueron identificadas otras Mycobacterias, constituyendo el grupo de las "Mycobacterias atípicas". El hallazgo de estas últimas estuvo vinculado por años a colonización transitoria o contaminación de la muestra clínica, pero es a partir de 1950 que se les ha asignado un rol en determinadas patologías; por ejemplo, actualmente M. avium complex y enfermedad pulmonar y diseminada en pacientes con SIDA. Clasificación y nomenclatura En 1950, Timpe y Runyon propusieron una clasificación útil de Mycobacterium en cuatro grupos que se basaba en la velocidad de crecimiento (rápido o lento, según sea superior o inferior a una semana), producción de pigmento en presencia o ausencia de luz (fotocromógeno, escotocromógeno y no cromógeno) y características coloniales.

Morfología, estructura y composición La morfología característica suele ser bacilar, ligeramente curvada, siendo la observable en frotis provenientes de cultivo más regular que la que se observa en frotis de materiales patológicos. Como todas las células procariotas, las Mycobacterias poseen un citoplasma, la membrana celular y un espacio periplásmico que lo separa de una gruesa y compleja pared celular. Fisiología y metabolismo El metabolismo de las Mycobacterias es muy variable, encontrándose las Mycobacterias de crecimiento rápido que crecen en menos de tres días en medios simples, así como Mycobacterias que crecen lentamente y necesitan medios más ricos, hasta M. leprae que aún no ha podido ser cultivada en medios sin células. Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos, dependiendo de su uso. Los medios sólidos pueden ser en base de agar o en base de huevos (Lowenstein-Jensen), siendo este último el más usado. Entre 3 a 5 semanas se observa el desarrollo de colonias para las Mycobacterias de crecimiento lento (por Ej.: M. tuberculosis). Desde el punto de vista de los requerimientos atmosféricos M. tuberculosis y la mayoría de las micobacterias, son aerobios estrictos, excepto M. Bovis que es microaerófilo. El crecimiento es favorecido con una atmósfera de 5-10% de CO2. La temperatura óptima de crecimiento es variable; M. tuberculosis lo hace a 37ºC con un rango entre 30 y 42ºC. Resistencia a los agentes físicos y químicos Las Mycobacterias son altamente resistentes a la desecación y permanecen viables en el esputo desecado de 6 a 8 meses cuando están protegidas de la luz solar directa. Son, en general, más resistentes a los agentes desinfectantes que otras formas vegetativas, pero son destruidos por procedimientos de pasteurización. Clasificación y Tipos antigénicos: Con excepción de M. leprae, las micobacterias son clasificadas en 2 amplias categorías: a.- Complejo M. tuberculosis: M. tuberculosis, M. bovis, M. microtii, M. africanum. b.- Micobacterias no tuberculosas: especies habitualmente saprofitas pero potencialmente patógenas para el hombre. M. avium intracellulare, M.kansasii, M. marinum, M. fortuitum y otras. Estas últimas se describen según características de velocidad de crecimiento y pigmentación con y sin exposición a la luz.1 Inmunoprofilaxis BCG es una vacuna con microorganismos vivos atenuados en forma irreversible, derivada de una cepa de M. bovis (Bacilo de Calmette y Guerin, en honor a sus creadores). Esta cepa entra en los macrófagos y se replica brevemente antes de ser destruida, y debería desencadenar el mismo tipo de respuesta inmune que M. tuberculosis, asumiendo que los antígenos más importantes están expresados.2 M. tuberculosis, se multiplica en promedio cada 20 a 22 horas, muy lentamente, por lo que se requieren 4 a 6 semanas para obtener crecimiento bacteriano. Crecen en medios especiales, a temperatura de 37°C y en un rango de pH de 7 a 7.2. El ácido alcohol resistencia está dado por la constitución química de la pared bacteriana. Esta pared rígida está compuesta por ácidos micólicos, ceras complejas y glicolípidos. Los ácidos micólicos contienen largas cadenas laterales que se unen a la molécula de ácido murámico del peptidoglicano, a través de puentes de fosfodiésteres y a los arabino galactanos por uniones de glicolípidos. Otro componente importante son los dimicolatos de trehalosa (llamados cord factor) y los sulfolípídos, los cuales juegan un rol en la virulencia. Otro constituyente único es el lipoarabino-manano (L.A.M.) que puede contribuir al daño del hospedero. Diferencias en la estructura de ellos, pueden estar relacionados con la capacidad de estimular la producción de citoquinas en cultivos de células mononucleares.

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http://www.med.uchile.cl/apuntes/archivos/2007/medicina/capitulo11_6mycobacterium.pdf http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2024.pdf

Características de M. Tuberculosis Naturaleza de la envoltura de M. Tuberculosis La envoltura bacteriana provee protección y soporte a las bacterias y también poseen mecanismos que permiten el intercambio de sustancias entre la bacteria y el medio ambiente. Hay una marcada similitud tanto química como estructural entre las envolturas de la mayoría de las bacterias. M. tuberculosis y otras Mycobacterias son biológicamente similares a las bacterias Gram+ (aunque frente a la tinción de Gram las Mycobacterias son débilmente Gram+ o no se tiñen); pero tienen aspectos distintos. En especial, se debe destacar que, aunque ambos poseen péptidoglicano, las moléculas unidas o asociadas a este polímero son, en las Mycobacterias, fundamentalmente de naturaleza lipídica en vez de proteínas y lipopolisacáridos, como en otras bacterias. La envoltura consiste en dos partes principales: la membrana plasmática y, alrededor de ella, la pared celular. La primera le otorga a la célula protección osmótica y transporte de iones y moléculas, en tanto que la segunda le brinda soporte mecánico y protección.

Pared celular La pared celular está constituida por tres capas. Con tinciones convencionales su apariencia es: - capa interna, moderadamente electrón-densa, compuesta por el peptidoglicano cuya estructura es similar a la de otras bacterias; - capa media, más ancha que la anterior y electrón-transparente, compuesta por polisacárido, el arabinogalactano, cuyos extremos distales están esterificados con ácidos grasos de alto peso molecular, los ácidos micólicos, de tamaño y estructura única para las Mycobacterias (70-90 átomos de Carbono). - capa externa de grosor variable, electrón-opaca, de la cual no puede conocerse con las técnicas actuales, su exacta composición, aunque se le atribuye una estructura glucolípida. Además de los componentes anteriores existen proteínas asociadas a la pared, algunas con función enzimática (necesarias para la construcción y reconstrucción de los polímeros de la pared durante el proceso de división celular y crecimiento), otros recientemente descubiertos con función de porina. Membrana citoplasmática La membrana plasmática de las Mycobacterias aparece en cortes ultrafinos como una membrana biológica trilaminar clásica, es decir, dos capas electrón-densas separadas por una capa transparente. Sin embargo, tiene como característico la presencia de moléculas de lipopolisacáridos, lipoarabinomananos (LAM), lipomonanos y fosfatidilinositol-manósidos. Factores de virulencia

Un aspecto característico de M. tuberculosis que contribuye a su virulencia es su habilidad para crecer dentro de monocitos y macrófagos. Aún no está aclarado exactamente como M. tuberculosis entra en el macrófago. Existen dos posibilidades no totalmente aclaradas: • mediante el proceso habitual de fagocitosis mediado por la opsonización por C3b o C3b. • la bacteria estimula su propia fagocitosis a través de invasinas. Por otra parte, se sabe actualmente que un factor de virulencia que podría contribuir a la supervivencia de M. tuberculosis en los macrófagos, es su habilidad para prevenir la acidificación del fagosoma. Habitualmente la ingestión de una bacteria por fagocitosis es seguida de la acidificación del fagosoma, mediada por ATPasas de la membrana fagosomal, la que bombea protones hacia el interior de esta estructura, reduciendo el pH en él. Dicha acidificación no sólo inhibe el desarrollo bacteriano sino que, además, es un paso importante en la fusión lisosoma-fagosoma, y en la activación de los factores bactericidas liberados durante la fusión. Destrucción tisular Muchos patógenos bacterianos causan daño en los tejidos del huésped por desencadenar una respuesta inflamatoria local o sistémica. Esta hipótesis es una posible explicación del daño pulmonar causado por M. tuberculosis y hay gran interés en detectar qué antígenos son los responsables del desencadenamiento de esta respuesta destructiva del hospedero. Se sabe poco acerca de los antígenos más importantes responsables de esta respuesta, pero los implicados en la actualidad son: • ácidos micólicos de la pared celular (factor cuerda). Son tóxicos cuando son inyectados a animales y pueden desencadenar una respuesta inflamatoria; • muramil dipéptido, estimula el sistema inmune y dispara la producción de citoquinas; compuestos de la pared no identificados y productos tóxicos liberados por los lisosomas que estimulan la producción de factor de necrosis tumoral alfa (NFT). Patogenicidad Los núcleos goticulares conteniendo muy pocos bacilos, dispersos en el aire, provenientes de un sujeto enfermo con tuberculosis pulmonar abierta, son lo suficientemente pequeños para no quedar atrapados en el aparato mucociliar bronquial y así alcanzar el espacio terminal aéreo donde comienza la multiplicación. El foco inicial es casi siempre de localización subpleural generalmente ubicado en la zona media de los pulmones donde el mayor flujo aéreo favorece el establecimiento de los bacilos inhalados. Excepcionalmente se encuentra el foco inicial en otras áreas (por Ej.: piel, intestino, orofaringe, genitales). En el pulmón las bacterias son ingeridas por los macrófagos alveolares, los cuales pueden tener un bajo grado de actividad antimicobacteriana como para eliminar pequeñas cantidades de bacilos. Sin embargo, la multiplicación bacteriana no puede ser impedida y, eventualmente, destruye los macrófagos. Hacia el foco son atraídos desde el torrente sanguíneo linfocitos y monocitos, diferenciándose los últimos en macrófagos que ingieren las bacterias liberadas de las células degeneradas y lentamente se desarrolla una o más áreas de neumonitis. Los macrófagos infectados son llevados por vía linfática a ganglios linfáticos regionales (hiliares, mediastinales y, a veces, supraclaviculares o retroperitoneales), pero en el huésped no inmune no son retenidos allí y se puede diseminar por vía hemática a diferentes tejidos, hecho condicionado por el tipo de flujo sanguíneo. Preferentemente se ubicarán en: ganglios linfáticos, riñones, epífisis de huesos largos, espacio subaracnoideo, pero el sitio más importante serán las áreas apicales pulmonares. Los bacilos tuberculosos que continúan multiplicándose lesionan los órganos donde están localizados, provocando licuefacción de los tejidos, donde crecen extracelularmente, llegando a ser millones. En estas condiciones es fácil que, dado el gran número de bacilos, aparezcan mutantes resistentes a los agentes antituberculosos. Un 5% aproximadamente de los infectados desarrolla la enfermedad durante el primer año y otro 5% lo hará más tarde como resultado de reactivaciones de los bacilos persistentes dentro de viejos focos de infección; Estas reactivaciones tardías se producen habitualmente en las zonas altas del pulmón, pero puede ocurrir en cualquier parte del cuerpo. Prueba de la tuberculina El diagnóstico inmunológico se basa en la prueba de tuberculina o Mantoux, que muestra la existencia de respuesta inmunitaria celular o hipersensibilidad retardada (se positiviza entre la semana 2 y 12 tras la infección). Su positividad

indica infección, pero no siempre enfermedad. La AAP y los CDC desaconsejan el empleo sistemático del Mantoux en niños sin factores de riesgo Técnica La lectura registra en milímetros (mm) la induración mediante palpación, medida en eje transversal al eje mayor del antebrazo, y debe realizarse a las 48-72 horas de la inyección. Puede haber falsos positivos y negativos Interpretación de la prueba de tuberculina - Induración > 5 mm. Positiva en niños en contacto con TBC activa, niños con sospecha clínica o radiológica de TBC, niños inmunodeprimidos/VIH y niños seroconversores de Mantoux - Induración > 10 mm. Positiva en cualquier otro caso, incluidos niños inmigrantes, adoptados en el extranjero y cribado de niños sanos (la AAP considera Mantoux positivo ≥ 15 mm en niños sanos ≥ 4 años) La vacuna BCG puede determinar cierta reactividad durante 3-5 años, a veces más. En caso de vacuna BCG reciente (< 3 años) se considera Mantoux positivo a una induración > 15 mm. En situaciones de riesgo de desarrollar TBC debe obviarse el antecedente de la BCG El niño enfermo presenta en más del 90% de los casos un Mantoux positivo. No obstante, en ciertas ocasiones (anergia) y hasta en el 50% de la tuberculosis miliar y meníngea, la prueba puede ser inicialmente negativa Falsos positivos - Infección no tuberculosa (micobacterias atípicas y vacunación BCG previa) - Otras: transfusión de sangre de donantes reactores positivos previa, hematoma local, infección del punto de inyección, sensibilidad a los componentes de la tuberculina, etc Falsos negativos - Infecciones sistémicas recientes: bacterianas (TBC reciente -fase anérgica-, grave o diseminada, fiebre tifoidea, brucelosis, tosferina, lepra), víricas (VIH, sarampión, parotiditis, varicela, gripe), fúngicas - Vacunaciones con virus vivos en 1-2 meses previos: sarampión, parotiditis y varicela - Enfermedades graves, personas inmunocomprometidas. Insuficiencia renal crónica, desnutrición protéica grave, linfomas, leucemias, sarcoidosis - Corticoterapia y tratamientos inmunosupresores - Edades extremas (menores de 3 meses) - En relación con la técnica de la prueba: tuberculina empleada, método de administración (no intradérmica), lectura inadecuada (importante medir induración y no eritema) Tratamiento en la enfermedad tuberculosa FASE Inicial: 2 meses

DE ELECCIÓN Isoniacida (INH), 10-15 mg/kg/día14 (máximo 300 mg) Rifampicina, 10-20 mg/kg/día (máximo 600 mg) Pirazinamida, 20-40 mg/kg/día (máximo 2 g) (los tres fármacos en una dosis diaria matinal)

Continuación: 4 meses

INH: 10-15 mg/kg/día (máximo 300 mg) Rifampicina:10-20 mg/kg/día (máximo 600 mg) (en una dosis diaria matinal)

Latente

Isoniacida, 5-10 mg/kg/día, 9

ALTERNATIVAS En el TDO intermitente en pacientes con difícil cumplimiento, se pueden dar 2-3 veces a la semana desde la 2ª semana a los 2 meses: INH, 20-30 mg/kg/día (máximo 900 mg); rifampicina, 10-20 mg/kg/día; pirazinamida, 50 mg/kg/día Añadir un 4º fármaco si: - Procedencia de un país con elevada resistencia (> 4%) a la INH (o habitar en zonas con resistencia primaria) - Sospecha de caso índice resistente a la INH - Meningitis tuberculosa o enfermedad muy grave - Infección VIH Cuarto fármaco a añadir: - Etambutol, 10-15 mg/kg/día15 (máximo 2,5 g) - Amikacina, 15-30 mg/kg/día (máximo 1 g) - Estreptomicina, 20-40 mg/kg/día IM (máximo 1 g) - En la meningitis tuberculosa la fase de continuación será de 7-10 meses - En la infección por VIH: 7 meses - En los casos de resistencia a INH o rifampicina: 10-16 meses (conviene consultar a expertos) - Si existen lesiones cavitadas inicialmente y después de 2 meses el esputo permanece positivo: 7 meses - TDO. 2-3 días a la semana, 36 dosis, 18 semanas Isoniacida 5-10 mg/kg/día, 6 meses, diariamente

meses, una dosis diaria (máximo 300 mg)

Isoniacida 15 mg/kg/día, 9 meses, 2-3 veces por semana en TDO En caso de resistencia a la INH > 4%, o sospecha de ésta16: rifampicina 10 mg/kg/día, 6 meses, una vez al día, o en TDO 15 mg/kg/día, 3 veces por semana

Tinción de Zielh Nielsen La tinción diferencial de ácido-alcohol resistencia fue desarrollada por Paul Ehrlich en 1882. Actualmente se utiliza una modificación de la técnica de Ehrlich que recibe el nombre de tinción de Ziehl-Neelsen. Esta tinción sirve para teñir bacterias del género Mycobacterium, el resto de las bacterias se tiñen de azul por el colorante de contraste. M. tuberculosis, causante de la tuberculosis y M leprae, causante de la lepra o enfermedad de Hansen, se identifican mediante esta tinción. Las micobacterias son ácido-alcohol resistentes porque poseen en sus cubiertas lípidos de ácidos grasos complejos que forman en su pared celular un material de tipo céreo resistente a la decoloración Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos: 1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo. 2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el interior de la célula. 3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las células excepto de las micobacterias, que la retienen debido a su superficie cerea. 4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún teñidas de rojo, vs las células restantes del espécimen. MATERIAL 1 campo de algodón Batas desechables Respiradores Guantes 1 pipeta 5ml Mechero 3 portaobjetos 1 puente de tinción Algodón 1 frasco de vidrio Palillos largos para hisopo 1 pizeta Pipetas pasteur con bulbo 1 varilla REACTIVOS Agua destilada Fascina básica Alcohol ácido (alcohol clorhídrico) al 3% Azul de metileno Aceite de inmersión Etanol EQUIPO Microscopio PROCEDIMIENTO

1. 2.

Hacer un frotis de la muestra de esputo. Disolver la bacteria con agua. O directamente del medio LowenstenJensen La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.

3.

4. 5.

6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba. Dejar el frotis sobre el puente de tinción. Aplicar fucsina básica. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período. Calentar con un mechero (en este caso se uso torunda con alcohol, para que no sea muy brusco el calor proporcionado) hasta la emisión de vapores (3-5 minutos). Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina básica penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua. Decolorar con alcohol-ácido. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua.. Aplicar azul de metileno (1 minuto). Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto. Enjuagar con agua Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos a que sequen al aire. Ahora colóquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 10 x 100

RESULTADOS TINCIÓN

En el esputo de un paciente

En cepa de mycobacterium Tuberculosis

OBSERVACIONES Los bacilos observados eran muy pequeños y de color rojo BAAR (ácido alcohol resistentes). En el frotis se podían observar algunos otros tipos de microorganismos de color azul (por el azul de metileno). No móviles, aerobios, no esporula, no capsulados La mayoría de los bacilos se encontraban cerca o junto a los macrófagos del paciente

IMAGEN

Se observaron bacilos pequeños de tipo BAAR Se observo el efecto cordón, pleomórfico ya que se nos quemo un poco el frotis Se observaron ramificaciones y filamentos

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

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Se realizó la tinción de Tinción de Ziehl-Neelsen para mycobacterium tuberculosis tanto del esputo de un paciente enfermo como directamente de un cultivo procedente de un medio de Lowensten-Jensen.



Al observar la preparación al microscopio con aceite de inmersión estos bacilos que son ácido alcohol resistentes se observaron teñidos de rojo mientras que el resto de bacterias presentes en la muestra aparecen teñidas de azul (cocos, otros bacilos, etc.) ya que no son bacilos BAAR ya que el alcohol ácido elimina la fucsina de todas las células excepto de las micobacterias, que la retienen debido a su superficie cérea y las que no se tiñen de azul al haber sido previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún teñidas de rojo, vs las células restantes del espécimen.

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M. Tuberculosis es un BAAR ya que su pared celular contiene ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les dan la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con los colorantes utilizados y el calentamiento que se realizo (con los vapores) fue para que el colorante atravesara la pared que contiene ceras.



Se observo en la baciloscopía del paciente que contenía muy pocos bacilos de tuberculosis y estos eran demasiado pequeños a comparación de los de la cepa en la cual se encontraron bacilos un poco más grandes posiblemente por el desarrollo de estos mismos y ya que se nos quemaron un poco los de la cepa logramos observar claramente el factor cordon o factor serpentina (el desarrollo de la bacteria en forma de cordones)., que corresponde al micósido (glucolípido) 6,6´- dimicoliltrehalosa y que, además de ser el responsable de la disposición micobacteriana en paralelo y cadenas (in vitro), es altamente tóxico para los leucocitos ya que les inhibe la acción de la succinato deshidrogenasa, provoca el hinchamiento de sus mitocondrias y separa a los ribosomas del retículo endoplásmico rugoso.

CONCLUSIONES En esta práctica se comprueba la alta patogenicidad que tiene esta bacteria llamada M. tuberculosis ya que el realizar la tinción se tuvo sumo cuidado y precaución utilizando batas desechables y respiradores, ya que por sus características toxicológicas es muy contagioso y las consecuencias son mortales ya que actúa sobre los leucocitos que estos son una de nuestras principales defensas. En la tinción se comprobó su resistencia ácido-alcohol, observándose bacilos pequeños de color rojo, cierta resistencia se debe a la capa lipídica que soporta las condiciones ácido-alcohólicas. Se debe tomar en cuenta que esta tipo de tinciones se puede aplicar en otros microorganismos con esta capacidad y que antes de realizarla se debe de hacer un estudio e investigación previa al origen de la muestra y del paciente desde luego. Haciendo así una prueba segura de previa identificación, el medio en donde se desarrollan mas específicamente esta bacteria es el Lowensten-Jensen, donde se corroborara el diagnostico de tuberculosis o no, aun así se realizan mas pruebas ya que el diagnostico de tuberculosis es de suma importancia para toda la comunidad clínica ya que es una enfermedad moral y sin cura, especialmente altamente contagiosa. REFERENCIAS Cabello Romero Raúl, Microbiología y parasitología humana Editorial panamericana, 2ªEd. , México 2006. p.386 http://www.infodoctor.org/gipi/guia_abe/pdf/tuberculosis_v1_2007.pdf http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.ht http://www.med.uchile.cl/apuntes/archivos/2007/medicina/capitulo11_6mycobacterium.pdf http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2024.pdf