Mycobacterium T

MYCO BACTE RIU M TUB ER CU LO SIS

HISTORIA 

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El hallazgo de tuberculosis evidente en los huesos de algunas momias egipcias indica que es una enfermedad antigua. 1484-1553 Francostorius llegó a algunas conclusiones sobre la naturaleza de la infección y su mecanismo de transmisión.

HISTORIA 

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1865 Willemin es cuando transmitió la enfermedad del hombre a los conejos. 1878 Baumgarten vió el bacilo en los tejidos infectados 1882 Roberto Koch es quien aisló el bacilo tuberculoso

HISTORIA POSTULADO DE KOCH 

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Encontró el bacilo asociado constantemente a la enfermedad Aislo en cultivo puro Reprodujo la enfemedad en conejos y cobayos con el cultivo Recuperó el bacilo en cultivo puro de los animales infectados

La tuberculosis 

Es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis y, excepcionalmente, por M. bovis, que se caracteriza por la formación de granulomas en los tejidos, Aunque se trata principalmente de una enfermedad pulmonar, también puede afectar a los restantes órganos. El curso de la enfermedad es crónico y puede conducir a la muerte si el paciente no recibe tratamiento.

Epidemiología Existen evidencias paleológicas de tb espinal en restos neolíticos precolombinos y egipcios. Si embargo, se convirtió recién en un problema grave en el momento en que el hacinamiento en los medios urbanos asociado con la Revolución Industrial generó circunstancias epidemiológicas que favorecieron su propagación. En los siglos XVII y XVIII la Tb fue responsable de una cuarta parte de todas las muertes en adultos que se produjeron en Europa.

Epidemiología la aparición del SIDA ha supuesto un resurgimiento excepcional de esta enfermedad en todo el mundo. Se estima que la mitad de la población mundial está infectada por M. tuberculosis, que hay 30 millones de enfermos en el mundo y que se producen al menos 10 millones de nuevos casos al año.

LOCALIZACION

TRANSMISIÓN  

Las M icob act erias 

Son microorganismos de forma bacilar, que se caracteriza por la propiedad ácido alcohol resistente, la lentitud con que se desarrolla en los medios de cultivo y la exigencia de que estos medios sean altamennte nutritivos para desarrollarse.

CLAS IFICACI ON D E MI CO BACT ERI AS Micobacterias de crecimiento lento Patógenos estrictos

M. tuberculosis, M. Bovis ,M africans, M.leprae.

Micobacterias no tuberculosas Potencialmente patógenas

     

fotocromógenas

M. kansaii,M marinum, M. simiae, M.   asiaticum

Escotocrógenas

M.Escrofulaceum, M.szulgai, M.xenopi.

No fotocromógenas

M. avium ,M.intracellulare, M. malmoense, M. haemophilus, M. ulcerans.    

Micobacterias de crecimiento rápido

M. fortuitum, M. Chelonei.

Micobacterias patógenas para animales

M. lepraemurium, M. microti, M. paratuberculosis, M. farcinogenes, M.

Ca rac terís tic as de la micob ac terias s apróf ita s 



Han sido identificadas más de 50 especies, algunas potencialmente patógenas para el hombre. Interfieren con la interpretación en la rx de tuberculina, ya que en las regiones tropicales o subtropicales donde son prevalentes pueden dar resultados falsamente positivos.

Ca rac terís tic as de la micob ac terias s apróf ita s 

Interfieren con la evaluación de la eficacia de los programas de vacunación BCG, ya que confiere cierto grado de protección frente a la tuberculosis, lo que dificulta la medición de los reales efectos beneficiosos de la vacuna en las regiones donde son especialmente prevalentes.

Ca rac terís tic as de la micob ac terias s apróf ita s 

Pueden aparecer ocacionalmente en la expectoración, en orina o en otras muestras orgánicas, determinando baciloscopía “falsamente positivas” que pueden inducir erroneamente al diagnóstico de tuberculosis.

Pr opi eda des Biológi ca s de Myco ba cter iu m tu berc ulo sis 

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Es un parásito estricto, por o cual su transmisión generalmente es directa, de persona a persona. No tiene tóxinas conocidas, ---capacidad de bacteriostasis por largos periódos en el interior de las células. Es aerobio, lo que determina que tenga una capacidad de metabolización y de crecimiento muy diferentes según la tención parcial del oxigeno del órgano o lesión en que anida.

Pr op ied ades B iológic as de M. t ubercu los is 

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

Es de multiplicación lenta, factor que condiciona su tendencia a la cronicidad. Tiene una virulencia variable, que podría explicar algunas de sus características epidemiológicas. Tiene numerosos antígenos, capaces de despertar una gran variedad de respuestas inmunológicas en el huésped, algunas de las cuales determina el característico daño tisular que es capaz de producir.

Mor folog ia   

   

Forma bacilar Longitud de 2-4 micras y diametro 0.2-0.5 m Pared celular-lípidos (>60%) glicolípidos y proteínas Presencia de ac. Micólicos típicos No esporulados , no móviles Aerobios Replicación por división binaria cada 18 a 20 horas.

Colora ción Zieh l N eels en 

Las pared celular micobacteriana, tienen un alto contenido lipídico, la cual tienen la capacidad de combinarse con el colorante carbolfuscina resistiendo la decolorción con alcohol ácido.

Reactivos:   

Fucsina fenicada (CARBOLFUCSINA) Acohol ácido (HCL + ETANOL) Azul de metileno

Colora ción Zieh l N eels en Procedimiento: 

    

Cubrir el frotis con fucsina ácida y calentar la lámina hasta obs desprendimiento de vapores por tres veces.(tiempo min 5 minutos) Lavar con agua corriente Decolorar con alcohol ácido x 2 min. Cubrir con azul de metileno durante 1 min. Lavar con agua y dejar secar al aire Observar la microscopío 100x

Colora ción Zieh l N eels en  

 



Sensibilidad 50 a 80 % Es necesario 5000 a10000 bacilos / ml de esputo Necesita de personal entrenado Control de calidad: suspenciones 1 ml de SSF con una turidez de No1 Mac Farland de Nocardia asteroides (C-) y M. Tuberculosis H37Ra ATCC25177 (C+) Puede utilizarse E. Coli y ; M. Kansasi

BACI LO SCO PIA- I nfor me de re sulta dos Se recomienda la sgte escala semicuantitativa:

NEGATIVA POSITIVO 1+ POSITIVO 2+ POSITIVO 3+

No se observan BAAR en 100campos Menos de 1 BAAR / campo en 100 campos observados. De 1 a 10 BAAR / campo en 50 campos observados. Más de 10 BAAR / campoEN 20 campos observados.

TI NCI ON D E KI NY OUN 

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No utiliza el calor para favorecer la captación de la fucsina fenicada. Tinción fria, técnica igual que ZN

TI NCI ON CO N FLU OROCR OMOS 

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Se basa en el mismo principio de coloración de ZN, se observa fluorescencia amarilla naranja cuando se observa en campo oscuro Es una técnica rápida,recomendable para laboratorios que tienen grandes cantidades de muestras El los casos en que la morfología de los bacilos encontrados por es esta tecnica es cuestionable se debe repetir con ZN para disminuir falsos positivos.

CU LTIVO DE MYCO BCTER IU M. TUB ER CU LOSI S

IMPO RTANC IA D EL CU LTIVO 

La importancia radica en aislar a M. Tuberculosis a partir de muestras paucibacilares o de escasa cantidad de bacilos en pcte con sospecha de tuberculosis y radiografía anormal. a fin de identificar la cepa y realizar las pruebas de sensibilidad a los medicamentos antituberculosos.

As pect os g en er ales e in dica cion es d el cu lt iv o 

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En el dx diferencial de tubeculosis pulmonar de sintomáticos respitorios con dos baciloscopías negativas y cuadro clínico –radiológico sospechoso. Dx de TBC infantil baciloscopías negativa DX de tuberculosis extrapulmonar. Para estudios de sensibilidad En pacientes HIV positivas/SIDA

As pect os g en er ales e in dica cion es d el cu lt iv o 

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Pacientes multitratados con persistencia de baciloscopía positiva. En muentras paucibacilares de BK (1-9 BAAR en más de 100 campos observados) Para estudios epidemiológicos de resistencia primaria y secundaria a M. tuberculosis

Recole cció n d e m uestra 

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Expectoración (esputo) : proveniente del arbol bronquial, recogida después de un esfuerzo de tos.Se solicitan tres muestras debido a que la elimación del bacilo es variable. Orina: Se solicita la totalidad de la primera micción de la mañana. Se sugiere cultivar por lo menos tres muestras seriadas.

Rec ole cción d e muestra 

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Secreciones: Las muestras se extraen con hisopos estériles, enviandose dentro de un tubo estéril y con el otro se realiza un frotis para coloración ZN Biopsias:La obtención lo realiza el médico.Se extrae fragmentos de tejido a estudiar se deposita en un vial estéril sin conservadores. Conservar en refrigeración.

Pr oces amien to de la mu es tra Las muestras obtenidas asépticamente, puede

cultivarse presindiendo de la descontaminación: -Muestras obtenidas por punción: LCR, pleural, peritoneal, articular. Se centrifuga y se siembra el sedimento. - Materiales de biopsia pleural, hepátiva y ganglionar: se fraccionará con instrumento quirurgico esteril en una mortero de porcelana estéril se agrega una suspención de agua estéril y se siembra en el medio de cultivo.

Pr oces amie nto de la mu es tra 

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

Las muestras contaminadas: esputo,orina, contenido gástrico, entre otras, deben ser descontaminadas antes del cultivo. Se deberán centrifugar al volumen total a 3000 ó 3500 RPM durante 20 a 30 min. Eliminar el sobrenadante, descontaminar y sembrar.

Pr oces amien to de la mu es tra 



La descontaminación se realiza con hidróxido de sodio (NaOH) al 4%, soluc acuosa estéril. Objetivo: eliminar la flora asociada a M. Tuberculosis, cuyos gérmenes se multiplican más rápido que el bacilo. También para homgenizar la muestra especialmente el esputo a fin de liberar al bacilo del mucus, material celular y tejidos.

Medi os de c ult ivo 

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Medios a base de huevos: Se obtiene medios ricos en lípidos por la que la micob tiene especial preferencia. Están constituidos por: -soluciones reguladoras a base de fosfatos, -cationes en muy bajas concentraciones -una fuente de carbono (glicerol) -otra fuente de nitrogeno (asparagina)Lowestein Jeinsen -o una fuente de ambos elementos (piruvato) medio de Stonebrink

Medi os de c ult ivo 





Medios semisintéticos de aislamiento y subcultivo El medio basal está constituido por elementos inorgánicos, glicerol o glucosa, aminoácido (digerido anzimático de caseína) y asparagina. Acidos grasos de cadena larga (ac. Oléico por ejemplo) Seroalbumina previene que el ac. Oléico alcance concentraciones tóxicas.

Medi os de c ult ivo        

Medios a base de huevo : Lowestein Jensen Stonebrink Ogawa Kudoh Medios semisintéticos: 7H10 7H9 7H11

Low es tein J en sen 

Solución de sales: -fosfato monopotásico

-sulfato de magnesio

-citrato de magnesio asparagina  

-L-

-glicerina bidestilada Suspensión de huevos enteros Solución acuosa de verde de malaquita al 2%

Medi o og awa 

Solución de sales: monopotásico sodio agua destilada

 

-fosfato -glutamato de -glicerol

-glicerina bidestilada Suspensión de huevos enteros

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CU LTIVO EN M EDI O OGA WA ACID IF ICA DO 

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Colocar en un tubo 1 ml de muestra de esputo o todo el sedimento obtenido por centrifugación. Agregar 4 ml de solución estéril de NaOH al 4%. Dejar a 37C x 20 min en estufa o BM Neutralizar Homogenizar la muestra con un pipeta e inocular 0.1 ml en 2 tubos de medio de ogawa, bañando toda la superficie del medio.

CU LTIVO EN M EDI O OGA WA ACID IF ICA DO 

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 

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Colocar los tubos en bandejas de fondo inclinado e incubar en estufa a 37C Después de 48h revisar los tubos y ajustar las tapas. Verificar si algún tubo está contaminado: Alcalinizado (color blanco amarillento) o acidificado(color azul oscuro) por mala neutralización de la muestra. El desarrollo de colonias antes de las 48h es indicativo de contaminación, aveces el medio se licua por acción de gérmenes proteolíticos.

LEC TURA E INF ORME 

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Las lecturas se realizarán durante la incubación a los 7, 30 y 60 días Las colonias no típicas se hace frotis y coloración ZN , si es BAAR se envia el cultivo para su tipicación.

LEC TUR A E INF ORME 

El desarrollo de M. Tuberculosis geneneralmente aparece luego de 2 a 3 semanas. Las colonias típicas son de color crema, secas, rugosas de aspecto de coliflor y de borde irregular

LEC TUR A E INF ORME -

No se observan colonias

No...

Número total de colonias si < de 20

+

De 20 a 100 colonias

++

Colonias separadas más de 100

+++

Colonias confluentes (desarrollo en toda la superficie del medio) Cultivo contaminado

c

TI PIFI CAC IO N DE MIC OBAC TER IAS 

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La preclasificación según Runyon, en la que se investiga velocidad de desarrollo y la producción de pigmentos. Se completa con las pruebas bioquímicas.

Cla si fica ci ón de mic oba cte rias s egún RUNY ON        

CEPAS DE DESARROLLO LENTO (días o más)

I-Fotocromogenas Pigmentan por estímulo de la luz

II-scotocromogenas Pigmentan sin necesidad del estimulo de la luz

III No cromógenas No pigmentan  espontáneamente ni por estímulo de la luz    

CEPAS DE DESARROLLO RAPIDO (7 días o menos)

IV-Crecimiento rápido Pueden pigmentar o no

M. kansassi M. marinum M. simiae M.escrofulaceu m M. gordonae M. tuberculosis M. bovis M.avium M. xenopi M.fortuitum M.phlei M. vaccae

PR UEB AS BI OQUÍMI CAS 

Se fundamenta en la capacidad que tienen algunas especies de micobacerias de transformar un producto en otro diferente mediante la acción de enzimas.

Pruebas bioquímicas Especie M. tuberculosi s

Niaci Reducción de  na nitratos

Hidrolisis  Tween 80

Catalasa  68ºC

TH C

Ureasa

Crecimiento  en PZA

+

+

+/-

-

+

+/-

-

M. bovis²

-

-

-

-

-

+

+

bovis BCG²

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+

+/-

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+

+

M. africanun

-

-

-

-

v

+

-

M.avium complex¹

-

-

-

+

+

-

+

M.

PR UEB A D E LA NI ACI NA 

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Permite identificar a las especies que carecen de la enzima que transfoma la niacina en niacina ribonucleótide, acumulandose por tanto en el medio (positivas). Esta niacina es un producto metabólico que forman las bacterias. Reactivos . -Bromuro de cianógeno 4-10% -solución alcohólica de bencidina o anilina al 4%

PR UEB A D E LA NI ACI NA 



En un cultivo abundante se agrega 1ml agua dest ,se deja en reposo minimo 15 min, luego se extrae el líquido con una pipeta a otro tubo donde se le agrega 0.5 ml de cada rvo. Reacción positiva: aparece de inmediato una coloración violácea (bencidina) o amarilla(anilina)

PR UEB A D E NITR ATO RED UCCI ON 

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Permite identificar a especies que contienen la enzima nitroreductasa. Se realiza en cultivos que tengan menos de 1 mes Reactivos:-sol.acuosa 0.01M de nitrato sodio 0.085% -reactivo de Griess

PR UEB A D E NITR ATO RED UCCI ON 

En un tubo se mezcla 4 gotas de agua dest con 10 mg de masa bacilar,se agrega 10 ml de solucion de nitrato de sodio y se incuba 2 horas a 37C. Luego se agrega el reactivo de Gries 0.2 ml de A y B se agitar y leer inmediatamente.

PR UEB A D E NITR ATO RED UCCI ON    



Lectura: reacción positiva: coloración roja Reacción dudosa: coloración rosada Reacción negativa: sin coloración o rosa pálido. Realizar dos controles uno en un tubo con el sustrato solamente (negativo) y otro con cultivo joven de M. Tuberculosis (positivo)

PR UEBA DE HI DRÓL IS IS D E TW EEN 80 

Permite diferenciar a micobacterias que hidrolizan el Tween80 mediante la enzima lipasa en ácido oléico y sorbitol polioxietilado sorbitan.

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Reactivos:tween 80, rojo neutro y solución reguladora de fosfato Ph 7

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Tween 80, nombre comercial del detergente monoeleato de polioxietilen sorbitan

PR UEBA D E HI DR ÓL IS IS D E TW EEN 80 

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Se suspende en el sustrato colonias de cultivo joven en medio sólido. Incubar a 37C, sin contacto con la luz, no más de 2 semanas. Leer a los 5 y alos 10 días Es positivo si hay un cambio de color de ambar a rosa salmón, el color puede intensificarse a rosado más intenso y hasta rojo neutro. Informar positivo a los 5 días o positivo a los 10 días.

PR UEBA D E L A C ATAL ASA 68C 

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La catalasa es una enzima producida en cantidades variables, descompone el H2O2 en agua y oxígeno libre. La semicuantificación y la suceptibilidad al calentamiento son útiles para identificar a las micobacterias.

PR UEBA D E LA CA TALA SA 68C 

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Reactivos:- agua oxigenada 110 vol (H2O2 al 30%) -Solución reguladora de fosfáto pH 7 -Tween 80 Distribuir la sol reguladora 0.5 ml en tubos y agregar una asadita cargada de colonias tomadas de un cultivo joven. Colocar el tubo en baño de agua termoregulado a 68C x 20 min. Agregar al tubo o.5 ml de mezcla de sol. Tween y agua oxigenada.

PR UEBA D E LA CA TALA SA 68C 

Lectura: observar formación de burbujas en a superficie. Obs 20 min antes de informar resultados negativo.

OTRA S TECNI CA S DIAGNO STI CA S D E TUB ER CU LOSI S

OTRAS TE CN ICAS DIAGNO STICAS D E TUB ERCULO SIS 

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Métodos de cultivo radiométrico (BACTEC) Métodos químicos Detección de anticuerpos Determinación de antígenos bacterianos Métodos de recombinación de los ác nucleicos.

Técn ica d e cu lt iv o rad iomét rica ( ba ct ec) 

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Tiene alta sensibilidad y especificidad que los método tradicionales Permite el dx de tuberculosis en menos de 1 sem en el 95% de los casos también util para realizar sensibilidad de la cepa y obtener resultados en pocos días Ayuda en la diferenciación de otras especies de micobacterias.

Técn ica d e cu lt iv o rad iomét rica ( ba ct ec) 

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Medio de cultivo Middlebrook enriquecido. Medio rico en ac. Palmítico con carbono 14 (isótopo radioactivo) Las micobacterias vivas metabolizan los ac. graso con C14,libran el isotopo en forma de CO2 marcado con C14 al medio ambiente , de donde es aspirado y llevado a una cámara ionizante y transformado en una corriente eléctrica proporcional a la cantidad de bacilos.

Técn ica s Q uímica s *de ter min ación de co nst it uye nt es mi cobact eri an os:  

Acidos micólicos en LCR. Acido esteárico en secreciones. Actualmente se utiliza HPLC,la cual detecta cantidades infimas de sust quimicas, capaz de aumentar la señal a 1 millon de veces. medición en pocas horas. .

Técn ica s Q uímica s *D et ermi nació n de der iva do s de l me ta bo lismo de la enf er med ad tube rculosa :

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Medición de la actividad de la enzima adenosina deaminasa (ADA) Enzima proveniente del metabolimo de las purinas que se encuentra en exudados proveniente de pleuresia, pericarditis, peritonitis y meningitis tuberculosas.

Técn ica s in mu noló gica s *Métodos s erológi cos 

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Identificar Acs dirigidos contra antígenos específicos de la micobacterias (ELISA) Detección directa de Ags micobacterianos en suero o secreciones

Técn ica s in mu noló gica s *Métodos d e rec omb in ación genét ica de acidos nu cleico s-clona ción- hib ri da ción  Detección de secuencias especiales de ADN o ARN micobacteriano en expectoración u otras muestras orgánicas. 

Se busca nuevos marcadores de la aciv. Tuberculosa. Es prometedor la medición de interluquina 2 en cual se encuentra elevado en granulomatosis y otra enf que activan los linfocitos T