Vaccini

I VACCINI 

BASE RAZIONALE

UNA PRECEDENTE RISPOSTA IMMUNE VERSO UN MICRORGANISMO RENDE UN INDIVIDUO MENO SUSCETTIBILE O ANCHE RESISTENTE AD UNA INFEZIONE DA PARTE DELLO STESSO AGENTE INFETTIVO

I VACCINI 

DEFINIZIONE

MICRORGANISMI, VIRUS, MATERIALI DI ORIGINE MICROBICA (TOSSINE) RESI POCO O PER NULLA DANNOSI PER L’ORGANISMO, MA IN GRADO DI FUNZIONARE DA ANTIGENI

I VACCINI 

VACCINAZIONE INOCULAZIONE DI VACCINI PER INDURRE UNA RISPOSTA IMMUNITARIA SIMILE A QUELLA CHE SI OSSERVA NELL’INFEZIONE NATURALE, IN ASSENZA DI MALATTIA

CENNI STORICI E. JENNER (FINE ‘700) SCOPERTA DEL PRINCIPIO DELLA VACCINAZIONE (VAIOLO)  PASTEUR (FINE ‘800) ATTENUAZIONE DI MICRORGANISMI PATOGENI  WRIGHT USO DI VACCINI IN TERAPIA 

VACCINI TRADIZIONALI 

BATTERICI

- ANATOSSINE O TOSSOIDI - BATTERI 

VIRALI (CON ORGANISMI)

- INATTIVATI - ATTENUATI

VACCINI BATTERICI 1.

ANATOSSINE O TOSSOIDI

ESOTOSSINE BATTERICHE PRIVE DEL POTERE TOSSICO, MA CON INALTERATE PROPRIETA’ ANTIGENICHE (ES. V. ANTIDIFTERICO E ANTITETANICO)

VACCINI BATTERICI 1.

c)  

BATTERI PATOGENI UCCISI V. ANTITIFICO V. CONTRO Rickettsia prowazekii (TIFO PETECCHIALE)

VACCINI BATTERICI b)

VARIANTI APATOGEN VIVENTI



V. ANTITUBERCOLARE (B.C.G.: bacillo di Calmette e Guerin)



V. ANTITIFICO (CEPPO ATTENUATO Ty 21 DI Salmonella typhi)

VACCINI VIRALI 1.

VIRUS INATTIVATI

VIRUS CHE HANNO PERSO LA CAPACITA’ REPLICATIVA. NON HANNO POTERE INFETTANTE O PATOGENO, MA CONSERVANO IL POTERE ANTIGENICO  PUNTO CHIAVE: INATTIVAZIONE (ES. POLIOVIRUS, VIRUS DELL’EPATITE A, DELL’INFLUENZA, DELLA RABBIA…)

VACCINI VIRALI 1.

VIRUS ATTENUATI

PREPARAZIONI VIRALI CHE MANTENGONO INALTERATO IL LORO POTERE ANTIGENICO, DOTATE DI CAPACITA’ REPLICATIVA LIMITATA NELL’OSPITE SENZA INDURRE MANIFESTAZIONI PATOLOGICHE E CON CARATTERISTICHE ATTENUATE STABILI NEL TEMPO  PUNTO CHIAVE: CONTAMINAZIONE (ES. POLIOVIRUS, VIRUS DEL MORBILLO, DELLA PAROTITE, DELLA ROSOLIA, VARICELLAZOSTER…)

Live attenuated virus vaccines

Successful live attenuated vaccines are effective for 3 reasons: The attenuated viruses replicate to some extent in the host The attenuated viruses have a reduced capacity to spread from the site of replication The attenuated viruses cause mild or inapparent disease.

LIMITI DEI VACCINI TRADIZIONALI     





CRESCITA IN COLTURA DELI AGENTI INFETTIVI COSTI MISURE DI SICUREZZA INVOLONTARIA DIFFUSIONE DELLA MALATTIA POSSIBILE REVERSIONE DEL CEPPO ATTENUATO NON EFFICACI PER TUTTE LE MALATTIE (ES. AIDS) PROBLEMI DI CONSERVAZIONE

VACCINI DI NUOVA GENERAZIONE (TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE)   

 

VACCINI SUBUNITA’ V. PEPTIDICI V. ATTENUATI TRAMITE MANIPOLAZIONE GENETICA VETTORI VACCINICI VACCINI GENETICI

VACCINI SUBUNITA’ UTILIZZANO COMPONENTI DELL’ORGANISMO PATOGENO ANZICHE’ L’ORGANISMO INTERO   

  

VANTAGGI STABILI E SICURI PRIVI DI EFFETTI COLLATERALI INDESIDERABILI SVANTAGGI PURIFICAZIONE COSTOSA ALTERAZIONE DELLA CONFORMAZIONE NATIVA >ALTERAZIONE DELL’ANTIGENICITA’

New Methods • Recombinant DNA •Single gene (subunit) Hepatitis B vaccine

S-antigen mRNA cDNA

raised in yeast Express plasmid

S-antigen mRNA protein

PRODUZIONE DI VACCINO CONTRO EPATITE B IN LIEVITO -VACCINI ATTENUATI SONO VIRUS ALTERATI IN MODO CHE NON POSSANO PIU’ RIPRODURSI NELL’ORGANISMO IN CUI VENGONO INOCULATI -QUESTI VACCINI SONO POTENZIALMENTE PERICOLOSI : POSSONO ESSERE CONTAMINATI CON VIRUS INFETTIVI -TENTATIVI DI PRODURRE ANTIGENE DI SUPERFICIE DI VIRUS EPATITE B (HBsAg) IN E. Coli FALLIRONO -IL GENE CODIFICANTE HBsAg E’ STATO CLONATO IN UN VETTORE DI ESPRESSIONE DI LIEVITO. -LIEVITO TRASFORMATO CON QUESTO VETTORE PRODUCE ELEVATE QUANTITA’ DI HBsAg -UTILIZZANDO FERMENTATORI E’ POSSIBILE OTTENERE 50-100 mg DI PROTEINA PER LITRO DI COLTURA

PRODUZIONE DI VACCINO CONTRO EPATITE B IN LIEVITO

VACCINI SUBUNITA’: VIRUS DELL’HERPES SIMPLEX HSV: 

  

TRASMISSIONE DI MALATTIE PER VIA SESSUALE GRAVI INFEZIONI DELL’OCCHIO ENCEFALITE AGENTE ONCOGENO

VACCINI SUBUNITA’: VIRUS DELL’HERPES SIMPLEX 

VACCINO TRADIZIONALE:

V. CON VIRUS UCCISO O ATTENUATO > ESPOSIZIONE A RISCHIO DI TUMORE 

VACCINO DI NUOVA GENERAZIONE:

V. SUBUNITA’> PRIVO DI AZIONE ONCOGENA

CREAZIONE DI UN VACCINO SUBUNITA’ ANTI-HSV-1 IDENTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DEL VIRUS CHE SUSCITANO GLI ANTICORPI CAPACI DI REAGIRE CONTRO LA FORMA INTATTA DEL VIRUS STESSO

GLICOPROTEINA D (gD) DELL’INVOLUCRO DI HSV TIPO I (HSV-1)

CREAZIONE DI UN VACCINO SUBUNITA’ ANTI-HSV-1 (Difficile da purificare)

(Cellula ospite)

(Solubile)

CLONAZIONE DEL GENE gD MODIFICATO IN UN VETTOTE DI ESPRESSIONE EUCARIOTICO

TRASFEZIONE IN CELLULE DI OVAIO DEL CRICETO CINESE (CHO)

GLICOSILAZIONE E SECREZIONE NEL MEZZO ESTERNO DEL PRODOTTO

FORMA MODIFICATA DI gD

EFFICACE SIA CONTRO HSV-1 CHE HSV-2

TUBERCOLOSI: Mycobacterium tuberculosis VACCINO ATTUALMENTE IN USO IN ALCUNI PAESI: V. DI CALMETTE-GUERIN (BCG): CEPPO DI Mycobacterium bovis VIVO 

CONTESTAZIONI  CAUSA DI MALATTIE IN PZ IMMUNODEPRESSI (AIDS…)  IMPOSSIBILITA’ DI DISTINGUERE GLI INDIVIDUI REALMENTE AFFETTI DA TUBERCOLOSI DA QUELLI VACCINATI CON BCG

TENTATIVI DI CREAZIONE DI UN VACCINO PIU’ SICURO ED EFFICACE CONTRO LA TUBERCOLOSI (V. SUBUNITA’) COLTIVAZIONE DI M. tuberculosis IN MEZZO LIQUIDO ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DI 6 PROTEINE (EXTRACELLULARI) SECRETE UTILIZZO DI TALI PROTEINE (SINGOLARMENTE ED IN COMBINAZIONE) PER IMMUNIZZARE LE CAVIE AEROSOL (200 CELLULE VIVE DI M. tuberculosis)

LE COMBINAZIONI DI PROTEINE PURIFICATE ASSICURANO LO STESSO LIVELLO DI PROTEZIONE FORNITO DAL V. BCG

IMMUNOGENI PROTETTIVI USATI, O POTENZIALMENTE UTILIZZABILI, IN V. SUBUNITA’   

 

Ag DI SUPERFICIE DELL’EPATITE B gp 120 DI HIV EMOAGGLUTININA DEL VIRUS DELL’INFLUENZA Ag G DELLA RABBIA GLICOPROTEINA D DI HSV

VACCINI PEPTIDICI COSTITUITI DA BREVI PEPTIDI SIMULANTI EPITOPI (DETERMINANTI ANTIGENICI) CHE HANNO AZIONE IMMUNOGENA LIMITAZIONI:  PER ESSERE EFFICACE, UN EPITOPO DEVE ESSERE COSTITUITO DA UN BREVE TRATTO DI AA CONTIGUI… NON SEMPRE E’ COSI’ IN NATURA 

IL PEPTIDE DEVE ESSERE CAPACE DI ASSUMERE LA STESSA CONFORMAZIONE CHE HA L’EPITOPO DELLA PARTICELLA INTATTA



UN SOLO EPITOPO PUO’ NON ESSERE SUFFICIENTEMENTE IMMUNOGENO

N.B. NECESSITANO DI UNA PROTEINA CARRIER!

VACCINI ATTENUATI TRAMITE MANIPOLAZIONE GENETICA (BATTERICI O VIRALI) COSTITUITI DA:  ORGANISMI NON PATOGENI MANIPOLATI IN MODO CHE TRASPORTINO ED ESPRIMANO DETERMINANTI ANTIGENICI DERIVANTI DALL’AGENTE PATOGENO BERSAGLIO  CEPPI MANIPOLATI DI ORGANISMI PATOGENI I CUI GENI DELLA VIRULENZA SONO STATI MODIFICATI O DELETI I DETERMINANTI ANTIGENICI CHE CONTANO SI PRESENTANO AL SISTEMA IMMUNITARIO CON UNA CONFORMAZIONE ASSAI SIMILE A QUELLA CHE AVREBBE L’ANTIGENE DELL’ORGANISMO PATOGENO

COLERA: Vibrio cholera V. ANTICOLERA ATTUALE: V. cholera INATTIVATO CON IL FENOLO

MODERATA PROTEZIONE CHE PERMANE DA 3 A 6 MESI

ENTEROTOSSINA COLERICA PEPTIDE A1 

1 SUBUNITA’ A PEPTIDE A2



5 SUBUNITA’ B IDENTICHE CREAZIONE DI ALTRI TIPI DI VACCINI

CREAZIONE DI UN CEPPO DI V. cholera CON DELEZIONE DEL PEPTIDE A1 : VACCINO

SELEZIONE TETRACICLINA!! • 90% PROTEZIONE MA EFFETTI COLLATERALI

LE SPECIE DI Salmonella CEPPI DI Salmonella: FEBBRI INTESTINALI, MORTE INFANTILI, FEBBRE TIFOIDE, INTOSSICAZIONE ALIMENTARE ATTENUAZIONE DI VARI CEPPI DI Salmonella

DOPPIA DELEZIONE

GENI aro BIOSINTESI DI COMPOSTI AROMATICI

GENI pur METABOLISMO PURINICO

CEPPI ATTENUATI DI Salmonella: INFEZIONI DI BASSO LIVELLO. VIRULENZA DI 106 VOLTE O PIU’.

VACCINI ORALI EFFICACI

VETTORI VACCINICI VIRUS VACCINO UTILIZZATO COME VETTORE VACCINICO VIRUS VACCINO  POXVIRUS, VAIOLO, DNA DOPPIO FILAMENTO, REPLICAZIONE CITOPLASMATICA (INDIPENDENTE DALLA CELLULA OSPITE). INFETTA UOMO E MOLTI ALTRI VERTEBRATI E INVERTEBRATI.  BEN CARATTERIZZATO A LIVELLO MOLECOLARE  STABILE, SOLITAMENTE BENIGNO

VETTORI VACCINICI VIRUS VACCINO

IDONEO A SERVIRE DA VETTORE VACCINICO MA….  GENOMA MOLTO GRANDE, PRIVO DI SITI DI RESTRIZIONE UNICI  IMPOSSIBILE INSERIRE DIRETTAMENTE NEL GENOMA VIRALE ALTRO DNA 

RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN VIVO!

INTEGRAZIONE NEL VIRUS VACCINICO DI UN ANTIGENE VIRALE CHE EVOCA LA RISPOSTA IMMUNITARIA 1.

COSTRUZIONE DI UN PLASMIDE RECANTE IL GENE DI UN ANTIGENE (HBcAg) TRASFEZIONE DI FIBROBLASTI DI EMBRIONI DI POLLO (TK NEGATIVE) PRECEDENTEMENTE INFETTATE CON IL VIRUS VACCINO WT (TK POSITIVO)

2. INTEGRAZIONE DEL GENE DELL’ANTIGENE NEL DNA DEL VIRUS VACCINO

TK

TK TK

DOPPIO CROSSING-OVER HBcAg

 

Cellule ospiti: TKVirus ricombinato: TK-

I SELEZIONE : Bromodeossiuridina (MORTE DI CELLULE TK+) II SELEZIONE: Sonda di ibridazione a DNA per l’antigene

Construction of a recombinant vaccinia virus expressing the influenza virus HA gene

  





ALCUNI ANTIGENI INSERITI NEL GENOMA DEL VIRUS VACCINO PROTEINA G DEL VIRUS DELLA RABBIA Ag DI SUPERFICIE DELL’EPATITE B PROTEINE NP E HA DEL VIRUS INFLUENZALE PROTEINE N E G DEL VIRUS DELLA STOMATITE GLICOPROTEINE DEL VIRUS DELL’HERPES SIMPLEX

ESEMPI DI VIRUS VACCINI RICOMBINANTI EFFICAI 

VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-GENE DELLA PROTEINA G DI TIPO 1 DI HSV: PREVENZIONE DELL’INFEZIONE ERPETICA NEI TOPI



VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-Ag DI SUPERFICIE DEL VIRUS DELLA RABBIA: NEUTRALIZZAZIONE DEGLI ANTICORPI NELLE VOLPI (IN EUROPA I PRINCIPALI PORTATORI DELLA RABBIA)

VACCINI VIRALI RICOMBINANTI VIVI  -

-

-

VANTAGGI ESPRESSIONE DEGLI ANTIGENI AUTENTICI IN MODO CHE ASSOMOGLIA MOLTO DA VICINO ALL’INFEZIONE NATURALE ATTIVAZIONE DI CELLULE B (RISPOSTA UMORALE) E DI CELLULE T (RISPOSTA CELLULO-MEDIATA) RIDUZIONE ULTERIORE DELLA VIRULENZA DOVUTA ALL’INSERIMENTO DI GENI DEGLI ANTIGENI IN UNO O PIU’ SITI DEL GENOMA VIRALE

VACCINI VIRALI RICOMBINANTI VIVI SVANTAGGI IL LORO IMPIEGO IN INDIVIDUI IMMUNODEPRESSI (ES. AIDS…) PUO’ CAUSARE GRAVE INFEZIONE VIRALE. 

BATTERI COME SISTEMI DI INSERIMENTO DEGLI ANTIGENI STRATEGIA: COLLOCAZIONE DI UN Ag NEUTRALIZZANTE DI UN BATTERIO PATOGENO SULLA SUPERFICIE DI UN BATTERIO NON PATOGENO VIVO. ESEMPIO: ESPRESSIONE SUI FLAGELLI DI UN ORGANISMO NON PATOGENO DI UNO SPECIFICO EPITOPO DERIVANTE DA UN BATTERIO PATOGENO PER REALIZZARE UNA IMMUNOGENICITA’ PROTETTIVA.

COSTRUZIONE DI UN VACCINO ANTI-COLERA 

INSERIMENTO DI UN OLIGONUCLEOTIDE SINTETICO (EPITOPO DEALLA SUBUNITA’ B DELLA TOSSINA COLERICA) IN UNA PORZIONE DEL GENE DELLA FLAGELLINA DI Salmonella.



INTRODUZIONE DEL COSTRUTTO IN UN CEPPO DI Salmonella FLAGELLINANEGATIVO.

COSTRUZIONE DI UN VACCINO ANTI-COLERA IMMUNIZZAZIONE DI TOPI (MEDIANTE INIEZIONE INTRAPERITONEALE) CON BATTERI RECANTI “FLAGELLI INGEGNERIZZATI” E INATTIVATI CON FORMALINA PRODUZIONE DI ELEVATI LIVELLI DI ANTICORPI DIRETTI CONTRO LA MOLECOLA DELLA TOSSINA COLERICA INTATTA!

VACCINI GENETICI 

 



IMMUNIZZAZIONE GENETICA TRASFERIMENTO DI UN GENE CODIFICANTE UN ANTIGENE ALL’INTERNO DI UN ORGANISMO OSPITE CHE NON ESPRIME TALE ANTIGENE IN CIRCOSTANZE NORMALI. ANTIGENE: DNA O RNA VACCINI AD RNA: POCHI ESEMPI (BREVE ESPRESSIONE) VACCINI A DNA: SEMPRE PIU’ NUMEROSI

VACCINI A DNA COSTITUITI GENERALMENTE DA VETTORI PLASMIDICI (DERIVATI DA BATTERI) CHE CONTENGONO GENI ETEROLOGHI (TRANSGENI) INSERITI SOTTO IL CONTROLLO DI UN PROMOTORE EUCARIOTICO, DETERMINANDO ESPRESSIONE PROTEICA IN CELLULE DI MAMMIFERO

STIMOLANO EFFICACEMENTE UNA RISPOSTA IMMUNE:  

UMORALE CELLULARE

IMMUNITA’ UMORALE: PRODUZIONE DI ANTICORPI ANTIGENO-SPECIFICI DA PARTE DI CELLULE B ATTIVATE NEUTRALIZZAZIONE DELL’AGENTE PATOGENO (Sufficiente da sola per la profilassi di alcune malattie, Es. EPATITE B) 

IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (CMI): INDUZIONE DI LINFOCITI T CITOTOSSICI (CTLs) DISTRUZIONE DI CELLULE INFETTE (COINVOLGIMENTO DI MOLECOLE CODIFICATE DAI GENI DEL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA’). (MHC) (Essenziale per la protezione contro malattie causate da patogeni intracellulari, Es. TUBERCOLOSI) 

Plasmid construct expression gene cassette promoters: - CMVIE or CMV intron A - RSV LTR - SV40 early

poly (a)-signals: - BGH -SV40

resistance gene ori E. coli origin of replication - ColE1 - no mammalian origin

bacterial resistance gene: - kanamycin - none

DNA Vaccines

Inoculation technology 

needle inoculation  

i.m. i.d.



gene gun



air food uptake



Types of Injection for DNA Vaccines 

Gene Gun (bombardment)~ Propels DNA-coated gold particles directly into the cytoplasm of cells in target tissue by means of electrical discharge or helium pulse



Injection by a needle~ “plasmid DNA immunization has been accomplished using epidermal, mucosal, intramuscular, and intravenous routes of administration”



“Striated muscle initially was considered to be the only tissue capable of efficiently taking up and expressing free plasmid DNA in an aqueous solution.”

Intra-muscular DNA vaccine muscle

gene per l’antigene

a

b patogeno

materiale genetico

plasmide modificato

La preparazione di un Vaccino a DNA solitamente si attua isolando uno o più geni dell’agente patogeno e integrandoli in plasmidi (a), piccoli anelli circolari di DNA. I plasmidi vengono rilasciati in piccoli gruppi di cellule, spesso per iniezione nelle cellule muscolari (b) o per trasferimento attraverso la pelle utilizzando una pistola genica (gene gun) (c). I geni codificano per gli Ag del patogeno. Gli Ag prodotti sono in grado di stimolare

c muscolo

pelle

Mechanism of immunisation T-cell selection and stimulation

plasmid

cytotoxic T-cell response CD8+ T CELL cross priming MHC I

transfection

myocyte

Th I

APC processing transcription integration ?

processing/ presentation

selection of T-helper cells

translation MHC II

Th II

CD4+ T Cell

secretion

B-cell stimulation and selection

antibody-dependent immune responses • neutralisation • ADCC • C-lysis

Features of DNA vaccination 

Antigenicity of expressed viral antigens similar to that observed during natural infection



Efficient elicitation of CD8+ CTLs (MHC I presentation)



Expression of multiple combined antigens possible by mixing multiple expression plasmids



Simplicity of vector construction



Simplicity of vector production and transport

Possible applications of DNA vaccines 

Virus 



Bacteria 



Malaria, Leishmania major, Schistosoma jap., Toxoplasma gondii, ...

Tumor 



Borreliosis, Tetanus, Tuberculosis, M. pulmonis, Salmonella typhi, ...

Parasite 



HIV/SIV, Influenza, HBV, HCV, HSV, HCMV, Dengue, Rota, Rabies, LCMV...

B-cell lymphoma/ Non-Hodgkin lymphoma, colorectal carcinoma, breast cancer (CEA+), Melanoma, ...

Allergy, auto-immune disease, immune tolerance 

Hausstaubmilben, TCR-autoimmune encephalomyelitis, rheumatoid arthritis, Systemic Lupus Erythematodes (TGF-ß/IL-2), Plasmodium yoelii-tolerance

Amount of DNA used as a vaccine (complete dosage)

100µg plasmid DNA i.m. 10 mg plasmid DNA i.m./i.d./gene gun

10-50 mg plasmid DNA i.m./i.d./gene gun

Clinical trials  

preventive

  

therapeutic





HIV-1 (env,rev,gag,pol, nef) HSV-1 (gD,gB,ICP-27) Malaria parasite (CSP) Influenza A virus (HA,M1,NP) HBV (HBsAG) tumour vaccines (tumour-specific antigens) HIV-1(env, tat, nef, multi-epitope)

Pro and cons of DNA vaccines 

 



 

Synthesis in vivo of a selected antigen or designer gene product No risk of infection Use of immunogen from yet uncultured pathogens Induction of cellular and humoral immune responses Cheap and easy production Easy transport and storage

• Risk of cancer (insertional mutagenesis) ?

• Risk of induction of tolerance ? • Risk of induction of auto-immune disease ?

• Prophylactic use e.g. in children affords particular safety features

Special safety considerations 

tumor induction

due to chromosomal integration tolerance  due to long-term presentation of antigen adverse reactions and immunopathology  due to co-administration of cytokine and/or immun stimulatory genes auto-immune reactions  correlated with the induction of anti-DNA antibodies biologic activity (apart from immunogenicity)  of the expressed antigen 









Chromosomal integration: Can it take place in vivo? 

No, following i.m. naked DNA inoculation 



up to 8 months after inoculation, no integration has been detected in muscle tissue

Yes, following other routes and methods of administration 

publication describing evidence of integration 17 days after inoculation in spleen cells

Chromosomal integration: The variables 









formulation  naked, lipids, etc. type of sequences  homology to chromosomal DNA sequences route of administration  i.m., i.d., s.c., etc. type of tissue  rate of proliferation? quality of the DNA  amount of linear or nicked plasmid ? Degree of supercoiledness?

Chromosomal integration: Where should we look? 

in every tissue 



in gonads 



extensive biodistribution of naked DNA observed in mice

major concern of germ line gene transfer

in various tissue depending on formulation 

formulation may target DNA to different cell types or tissues

Chromosomal integration: What sensitivity of detection should we aim for?



PCR 



sensitivity is limited 



most sensitive due to rapid biodistribution of DNA

at which time point after inoculation  

5 days or 15 days integration assay, if DNA is detected in a given tissue by PCR

Chromosomal integration: Should we look for it in all cases? 

yes  



not in all cases after i.m. inoculation 





because consequences could be detrimental preventive vaccines will be used in healthy adults or children

FDA: if expression construct is changed (insert), but plasmid backbone identical: not necessary for early trials EU: ?

yes, in all cases  

if route of administration is changed if method of delivery is changed

Production process, risks, consequences 

E.coli fermentation



antibiotics



anaphylaxis



extraction and primary recovery



endotoxin



toxachia



chromatography



bovine ribonuclease



infection with nvCJD or viral zoonoses



product



antibiotic resistance genes



gene transfer to pathogenic bacteria with subsequent reduction in the efficacy of antibiotic therapy

Quality and safety evaluations



 

  

pre-clinical safety evaluation:  animal models translation of authentic gene product absence of replication competent viruses (vector-derived) absence of any other viruses etc. titre, dosage absence of DNA or protein contaminants, pyrogens etc.

Toxicity studies



organ and tissue distribution of transgene, persistence, expression over time



exclusion of germ line transmission and environmental risk



physiological consequences of gene expression



include functional end point in vivo

Biological Monitoring



absence of germ line transfer



spread into other tissues



antibodies against vector, antigen or genetically modified cell