Vaccine

บทที่ 15 การสรางเสริมภูมิคุมกันโรคและภูมิคุมกันบําบัด (Vaccination and Immunotherpy) วัชระ กสิณฤกษ บทนํา เปนที่ยอมรับกันโดยทัว่ ไปแลววาวิธกี ารทีด่ มี ากวิธหี นึง่ ในการปองกันโรคก็คอื การใชวคั ซีน (vaccine) เพื่อกระตุนใหเกิดภูมคิ มุ กันตอโรคนัน้ ๆ ขึ้น ซึ่งเมื่อคนนั้นๆ ไดรบั เชือ้ โรคนัน้ อีกในภายหลัง ระบบภูมิคุมกันที่ถกู กระตุน ใหเกิดขึน้ แลวนัน้ จะเขาทําลายเชือ้ โรค ทําใหผทู ไ่ี ดรบั เชือ้ โรคไมเปนโรค ดังที่ไดเรียนกันมาแลววาเมือ่ รางกายไดรบั แอนติเจน แอนติเจนจะไปกระตุน ระบบภูมคิ มุ กัน ทั้งชนิด humoral mediated immunity และ cell-mediated immunity (รวมถึง cytotoxic T cell response หรือ CTL response) ขึ้น นอกจากนีแ้ อนติเจนดังกลาวยังกระตุน ใหเกิด immunological memory ขึ้น (รูปที่ 15-1) ซึ่ง immunological memory ทัง้ memory B lymphocytes และ memory T lymphocytes ทําใหเกิดการจดจําของระบบภูมคิ มุ กัน และเมือ่ รางกายไดรบั แอนติเจนชนิดเดิมอีกใน ครั้งตอๆ ไป การกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันจะเกิดไดมากและรวดเร็วกวาการกระตุน ในครัง้ แรก (รูปที1่ 5-2) ดังนั้นการใหวัคซีนจึงเปนการกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันใหเตรียมพรอมกอนทีร่ า งกายจะเจอเชือ้ โรคจริงใน โอกาสตอไป

รูปที่ 15-1 แสดง immune responses และ immunological memory 15-1

รูปที่ 15-2 แสดง primary และ secondary antibody response

การสรางเสริมภูมคิ มุ กันโรค (Immunization) การสรางเสริมภูมคิ มุ กันโรคหรือการกระตุน ใหรา งกายเกิดภูมติ า นทานโรค สามารถแบงออก เปน 2 ชนิดใหญๆ คือ passive immunization และ active immunization

Passive immunization หมายถึงการนําเอาภูมคิ มุ กันโรค (จากคนหรือสัตวอน่ื ) มาใหแกผรู บั โดยตรง เพื่อใหผรู บั เกิด ภูมิคุมกันโรคขึ้น วิธี passive immunization นี้เปนการนําเอาซีรมั ทีม่ แี อนติบอดีทจ่ี าเพาะต ํ อแอนติเจน ที่สนใจ (อาจเรียกวา แอนติซรี มั ; antiserum) มาฉีดใหแกผูรับ หรืออาจหมายถึงการนําเอา immune cells เชน lymphocytes จากผูที่มีภูมิคุมกันโรคแลวมาใหผูรับ เพื่อใหผูรับเกิดภูมิคุมกันโรคขึ้นมา โดยไมตอ งสรางเอง จะเห็นไดวา โดยวิธี passive immunization นี้ ไมไดมกี ารฉีดกระตุน ผูร บั ดวย แอนติเจนเลย แตเปนการนําเอาภูมคิ มุ กันทีม่ อี ยูแ ลวจากบุคคลอืน่ หรือจากสัตวอน่ื มาให เพื่อใหผูรับ มีภูมิคุมกันโรคขึ้น (รูปที่ 15-3) ภูมิคุมกันที่นามาให ํ ผรู บั ใน passive immunization ไดแก ซีรัม (บางที่ เรียกวา แอนติซรี มั ; antiserum) หรือ โกลบูลนิ เขมขน (concentrated immunoglobulin) จากคนปกติ

15-2

ที่ไดรับการกระตุนกอนแลวดวยแอนติเจนทีส่ นใจ หรือจากคนทีห่ ายจากโรคติดเชือ้ นอกจากนีย้ งั อาจ ใชซีรัมจากสัตวทไ่ี ดฉดี กระตุน กอนดวยแอนติเจนทีส่ นใจ (รูปที่ 15-3)

รูปที่ 15-3 แสดง ขัน้ ตอนการผลิตและการให passive immunization เพื่อปองกันโรคบาทะยัก นอกจากการใหแอนติบอดีแลว ปจจุบนั ยังมีการนําเอา lymphocytes จากคนที่มีภูมิคุมกันโรค (เรียกวา immune lymphocytes) หรือ macrophages มาใหผูรับเพื่อเสริมสรางภูมิคุมกันชนิด cellmediated immunity การนําเอาเซลลจากคนหนึ่งไปใหอีกคนหนึ่งเพื่อเสริมสรางภูมิคุมกันนี้อาจเรียก อีกอยางวา adoptive immunization วิธี adoptive immunization นี้ปจจุบันยังไมประสบผลสําเร็จ เทาทีค่ วร ทั้งนี้เพราะเซลลที่ใหเขาไปอาจมี histocompatibility antigen หรือ HLA แตกตางจากผูรับ ทําใหเกิดมีปฏิกริ ยิ าตอตานซึง่ กันและกัน การให passive immunization แบบ adoptive immunization นี้ยังอยูใ นระหวางการศึกษาวิจยั 15-3

ตัวอยางของแอนติบอดีทใ่ี ชใน passive immunization และการใชงานดังแสดงในตารางที่ 15-1 ตารางที่ 15-1 แสดงการให passive immunization เพื่อการปองกันโรคตางๆ โรค ที่มาของแอนติบอดี การใชงาน Measles Hepatitis A Hepatitis B Rubella Varicella Botulism Diphtheria Rabies Tetanus

Human Human Human Human Human Equine Equine Human and Equine Human and Equine

Post exposure Pre exposure; Post exposure Post exposure Post exposure Prophylaxis in immunosuppressed individuals Post exposure and treatment Post exposure Post exposure Post exposure and treatment

ขอดีของวิธี passive immunization 1. เปนการเสริมสรางภูมติ า นทานโรคเพือ่ ใหเกิดผลการปองกันโรคอยางทันทีทนั ใด เชนการให anti-rabies antibody แกคนที่ถูกสุนขั ทีเ่ ปนโรคพิษสุนขั บากัด 2. เปนการเสริมสรางภูมคิ มุ กันโรคแกบคุ คลทีไ่ มสามารถสรางแอนติบอดีไดเอง เชน ในผูป ว ย immunodeficiency diseases หรือในเด็กแรกคลอด

ขอดอยของวิธี passive immunization 1. วิธี passive immunization ภูมิคุมกันที่ไดรับจะอยูในรางกายไมนาน (short-lived immunity) 2. ผูรับอาจเกิดการแพอยางรุนแรงหลังไดรับแอนติซีรัม เชน เกิด acute anaphylaxis ซึ่งอาจ ทําใหผรู บั ซีรัมนัน้ เสียชีวติ ได หรือเกิดการแพชนิด serum sickness ในเวลาตอมา 3. ผูรับอาจติดเชือ้ จากซีรมั ทีใ่ ห เชน HIV หรือ Hepatitis virus เปนตน 4. ในกรณีของ adoptive immunization immune lymphocytes ที่ใหอาจเปนอันตรายกับ ผูร บั ได (graft versus host reaction) 5. แอนติบอดีท่ีใหสามารถกดการกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันของ active immunization (ดูความ หมายของ active immunization ในหัวขอตอไป) 15-4

Active immunization หมายถึงการฉีดแอนติเจน (หรือทีเ่ รียกวาวัคซีน; vaccine) เขาไปในรางกายเพือ่ กระตุน ใหรา งกายผูร บั สรางภูมคิ มุ กันโรคขึน้ เอง การใหวคั ซีนเปนการกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันและ immunological memory ใหเกิดขึ้น และเมือ่ รางกายไดรบั เชือ้ โรคจริงๆ ตัวเชือ้ โรคเองจะกระตุน memory T และ B lymphocytes และทําใหเกิดภูมคิ มุ กันโรคทีม่ าก และรวดเร็ว สุดทายทําใหเชือ้ โรคทีร่ บั เขามาถูก ทําลาย Active immunization สามารถแบงตามชนิดของแอนติเจนทีใ่ ชเปนวัคซีนไดเปน 3 กลุมใหญๆ (รูปที่ 15-4) คือ 1. Killed vaccine หรือ inactivated vaccine เปนวัคซีนที่ไดจากการนําตัวเชือ้ โรคมาฆาดวยความรอน หรือสารเคมี แลวนํามาใชเปนวัคซีน เมื่อใหวคั ซีนชนิดนีเ้ ขาไปในรางกาย killed vaccine จะทําหนาทีเ่ ปนแอนติเจนชนิด exogenous antigen ดังนั้นวัคซีนชนิดนีส้ ามารถกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันชนิด humoral mediated immunity คือ กระตุนการสรางแอนติบอดีได และสามารถกระตุน ภูมคิ มุ กันชนิด cell-mediated immunity ไดเฉพาะ ในสวนของ CD4+ lymphocytes คือสามารถกระตุน CD4+ lymphocytes ใหทํางานได แต killed vaccine ไมสามารถกระตุน CD8+ lymphocytes หรือ cytotoxic T cells (CTL) responses ได เนื่องจาก CTL responses เปนภูมิคุมกันที่มีบทบาทสําคัญในการกําจัดเชือ้ โรคจําพวก intracellular microorganism โดยเฉพาะไวรัส ดังนัน้ killed vaccine จึงใชไมไดผลในการปองกัน virus infection หลายชนิด นอกจากนี้ความรอนหรือสารเคมีทใ่ี ชในการฆาเชือ้ โรคเพือ่ เตรียมเปนวัคซีน อาจทําลาย antigenic determinant บางชนิดของตัวเชื้อ ทําใหเสียคุณสมบัตขิ องการเปน immunogen ในการ กระตุน ระบบภูมคิ มุ กัน killed vaccine ยังอาจจะไมปลอดภัย หากระบบการฆาเชือ้ โรคกอนนําไปใช เปนวัคซีนไมสมบูรณ 2. Sub-unit vaccine เปนวัคซีนทีไ่ ดจากการแยก (purified sub-unit vaccine) หรือสังเคราะหสว นประกอบบางชนิด ของเชื้อโรคโดยอาศัยวิธที าง molecular biology techniques (recombinant vaccine) แลวนํามา ใชเปนวัคซีน นอกจากนี้ sub-unit vaccine อาจเปน toxin ที่เชื้อโรคสราง แลวนํามาทําใหหมดฤทธิ์ ดวยสารเคมี เชน hydrogen peroxide หรือ formaldehyde เรียก toxin ที่หมดความเปนพิษนีว้ า toxoid แลวใชเปนวัคซีน เชนเดียวกับ killed vaccine วัคซีนชนิด sub-unit vaccine นี้จดั เปน exogenous antigen จะกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันชนิด humoral mediated immunity และ CD4+ lymphocytes แตไมสามารถกระตุน CTL response ได Sub-unit vaccine มักมีคุณสมบัติในการ 15-5

กระตุน ระบบภูมคิ มุ กันไดไมดี (low immunogenicity) และกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันไดในระยะสัน้ ดังนัน้ การใชวคั ซีนชนิดนี้ จึงมักตองมีการกระตุน ซํ้า (booster) หลายครั้ง เพือ่ ใหการกระตุน ระบบภูมคิ มุ กัน เกิดไดดยี ง่ิ ขึน้

3. Live attenuated vaccine เปนวัคซีนที่ไดจากการนําเชื้อโรคมาเลี้ยงในสภาวะที่ทาให ํ เชือ้ โรคนั้นออนแอลง และไมทําให เกิดโรค (non-pathogenic) (รูปที่ 15-5 แสดงขัน้ ตอนการเตรียม live attenuated virus) วัคซีนชนิดนี้ เปนตัวเชื้อทีย่ งั มีชวี ติ สามารถกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันไดทกุ ระบบ ทัง้ humoral mediated immunity, CD4+ lymphocytes และ CTL responses แตวัคซีนชนิดนี้มขี อ ดอยคืออาจทําใหเกิดโรคกับผูร บั วัคซีนได โดยเฉพาะกับผูท ม่ี กี ารทํางานของระบบภูมคิ มุ กันบกพรอง live attenuated vaccine อาจ กลายพันธุก ลับสูส ภาพทีก่ อ โรคได (virulent form)

รูปที่ 15-4 แสดง Vaccines ชนิดตางๆ เพื่อใชใน active immunization

15-6

รูปที่ 15-5 แสดง การเตรียม live attenuated virus เพื่อใชเปนวัคซีน เมื่อพิจารณาถึง active immunization โดยรวม จะเห็นไดวา เปนการใหแอนติเจนของเชือ้ โรค ไปกระตุนระบบภูมคิ มุ กันในรางกาย ดังนัน้ การกระตุน ภูมติ า นทานโรคโดยวิธนี จ้ี งึ ตองใชเวลา และเมื่อ ภูมิตานทานโรคเกิดขึ้นแลวจะอยูไดนานกวา passive immunization ตัวอยาง active immunization ที่ใชอยูในปจจุบัน ดังแสดงในตารางที่ 15-2 และ 15-3

ขอดีของวิธี active immunization 1. เปนการกระตุนระบบภูมติ า นใหเกิดขึน้ ในผูร บั วัคซีนเอง ภูมติ า นทานโรคจึงอยูไ ดนาน 2. สามารถกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันใหเกิดขึน้ เฉพาะที่ (local immunity) ได โดยเลือกทางให (route) วัคซีนที่เหมาะสม

ขอดอยของวิธี active immunization 1. ผูไดรับวัคซีนโดยทั่วไปมักเกิดอาการขางเคียง เชนมีไข ครัน่ เนือ้ ครัน่ ตัว หรือปวดบริเวณที่ ฉีดวัคซีน บางชนิดอาจมีอาการจําเพาะ เชน วัคซีนหัดเยอรมัน ทําใหเกิดอาการปวดขอ หรือขออักเสบ เปนตน 2. วัคซีนบางชนิดอาจทําใหเกิดอาการแพไดในบางคน ซึ่งโดยทั่วไป มักเปนการแพสารทีป่ น เปอนในวัคซีน เชนแพโปรตีนของไขที่ใชเลี้ยงเชื้อไวรัสที่ใชทําวัคซีน 3. ผูที่มีภูมิคุมกันบกพรอง หากไดรบั วัคซีนชนิด live attenuated vaccine อาจเกิดโรคจาก การใหวคั ซีนได 4. ในสตรีทก่ี าลั ํ งตั้งครรภ ไมควรไดรับ live attenuated vaccine เพราะเชือ้ ทีเ่ ปนวัคซีนอาจ เปนอันตรายตอทารกในครรภได 15-7

ตารางที่ 15-2 แสดง active immunization ในการปองกันและรักษาโรคตางๆ โรค วัคซีนทีใ่ ช Bacterial diseases

Anthrax Tuberculosis Cholera Diphtheria Hemophilus Meningococcus Whooping cough Plague Pneumococcus Tetanus Typhoid

Purified proteins Modified live (BCG) Killed organisms Toxoid Capsular polysaccharide Capsullar polysaccharide Killed organism or purified proteins Killed organisms Capsular polysaccharide Toxoid Killed or modified live organism

Viral disease

Maesles Mumps Rubella Poliomyelitis Influenza Hepatitis B Rabies Yellow fever

Modified live organisms Modified live organisms Modified live organisms Killed or modified live organisms Killed organisms Recombinant antigen Killed organisms Modified live organisms

15-8

ตารางที่ 15-3 ตารางการฉีดวัคซีนในเด็ก อายุ ชนิดของวัคซีน แรกเกิด วัคซีนปองกันวัณโรค (BCG) วัคซีนปองกันตับอักเสบ บี ครัง้ ที่ 1 1 เดือน วัคซีนปองกันตับอักเสบ บี ครัง้ ที่ 2 2 เดือน วัคซีนรวมปองกันคอตีบ ไอกรน บาดทะยัก (DTP) ครั้งที่ 1 วัคซีนปองกันโปลิโอ (OPV) ครัง้ ที่ 1 4 เดือน วัคซีนรวมปองกันคอตีบ ไอกรน บาดทะยัก (DTP) ครั้งที่ 2 วัคซีนปองกันโปลิโอ (OPV) ครัง้ ที่ 2 6 เดือน วัคซีนรวมปองกันคอตีบ ไอกรน บาดทะยัก (DTP) ครั้งที่ 3 วัคซีนปองกันโปลิโอ (OPV) ครัง้ ที่ 3 วัคซีนปองกันตับอักเสบ บี ครัง้ ที่ 3 9-12 เดือน วัคซีนปองกันหัด คางทูม หัดเยอรมัน (MMR) ครัง้ ที่ 1 18 เดือน วัคซีนรวมปองกันคอตีบ ไอกรน บาดทะยัก (DTP) ครั้งที่ 4 วัคซีนปองกันโปลิโอ (OPV) ครัง้ ที่ 4 วัคซีนปองกันโรคไขสมองอักเสบ (JEV) ครั้งที่ 1 และ 2 โดยใหหา งกัน 1-2 สัปดาห (เฉพาะในทองที่ที่มีโรคชุกชุม) 2 ปครึง่ วัคซีนปองกันโรคไขสมองอักเสบ (JEV) ครั้งที่ 3 (เฉพาะในทองทีท่ ม่ี โี รคชุกชุม) 4-6 ป วัคซีนรวมปองกันคอตีบ ไอกรน บาดทะยัก (DTP) ครั้งที่ 5 วัคซีนปองกันโปลิโอ (OPV) ครัง้ ที่ 5

15-9

ดังนั้นเมื่อพิจารณาถึงตรงนี้จะเห็นไดวาวัคซีนที่มีใชในปจจุบันยังไมใชวัคซีนที่ดีที่สุด ซึ่งวัคซีน ที่ดีที่สุดนี้ ควรจะเปนวัคซีนทีก่ ระตุน ระบบภูมคิ มุ กันไดทง้ั ชนิด humoral mediated immunity และ cell-mediated immunity ทั้งการกระตุน CD4+ lymphocytes และ CTL responses และตองไมใช ตัวเชื้อโรคที่ยังมีชีวิตเปนวัคซีน จากแนวคิดดังกลาวทําใหนกั วิจยั ทางวิทยาศาสตรการแพทยไดศกึ ษา อยางจริงจังเพื่อพัฒนาวัคซีนและวิธีการใหวัคซีนที่มีประสิทธิภาพมากกวาเดิม และโดยอาศัยความรู ทาง molecular biology และ immunology จนในที่สุดก็ไดพบวิธกี ารหรือเทคนิคใหมๆ ทีเ่ รียกวา DNA vaccination ที่นาจะเปนวิธกี ารทีจ่ ะบรรลุวตั ถุประสงคดงั กลาว

DNA vaccine หลักการของ DNA vaccination (ดูรปู ที่ 15-6 ประกอบ) DNA vaccination หรือ DNA immunization เปนเทคนิคทีอ่ าศัยหลักการคือ เมือ่ นํายีนที่ กําหนดการสรางโปรตีนใดๆ ทีส่ นใจไปเชือ่ มตอใน eukaryotic expression plasmid vector ซึ่งภาย ใตสภาวะที่เหมาะสม ยีนที่เชื่อมตอใน plasmid vector นั้นจะสรางเปน encoded protein ออกมา ซึ่ง ถาการแสดงออกของยีนดังกลาวเกิดขึน้ ในรางกายของสิง่ มีชวี ติ และถา encoded protein นั้นๆ มี คุณสมบัตเิ ปน antigenic protein ก็จะไปกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันของรางกายและทําใหรา งกายเกิด ภูมิคุมกันตอบสนองตอโปรตีนนัน้ ๆ ขึ้น โดยพบวาระบบภูมคิ มุ กันทีถ่ กู กระตุน ใหเกิดขึน้ โดยวิธนี ม้ี ที ง้ั humoral mediated immunity, cell-mediated immunity ทั้งกระตุน CD4+ lymphocytes และ CTL response

รูปที่ 15-6 แสดงหลักการของวิธี DNA vaccination เพื่อปองกัน Influenza virus 15-10

กลไกการกระตุนระบบภูมิคุมกันโดย DNA vaccine กลไกการกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันโดยวิธี DNA vaccination ยังไมทราบแนชดั อยางไรก็ตาม เชื่อวานาจะมีกลไกดังนี้คือ เมื่อฉีด DNA ที่กําหนดการสรางโปรตีนทีส่ นใจและเชือ่ มตออยูใ น plasmid vector ที่เหมาะสมเขาสูรางกาย plasmid DNA จะเขาสูเซลลเปาหมายซึ่งอาจเปนเซลลกลามเนื้อ หรือเซลลใตผิวหนัง ทั้งนี้ขึ้นกับ route และวิธีการฉีด โดยอาศัย transcription และ translation mechanism ของเซลล ยีนทีแ่ ทรกอยูใ น plasmid vector จะถูกสรางเปน antigenic protein เมื่อ พิจารณาถึงตรงนี้จะเห็นวา antigenic protein ที่ถูกสรางขึ้นมานี้จะถูกสรางภายในเซลล ดังนั้นจึงถูก process และกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันคลายกับ endogenous antigen ทั่วๆ ไป กลาวคือ antigenic protein จะถูก process เปน peptide antigen ขนาดเล็กภายใน cytoplasm และสงไปจับกับ major histocompatibility complex (MHC) class I molecule จากนั้นจะถูกสงไปบนผิวเซลลเพื่อกระตุน CD8+ lymphocytes เกิดเปน cytotoxic T lymphocytes ซึ่งสามารถทําลาย infected cells ได (เรียกระบบภูมคิ มุ กันแบบนีว้ า CTL response) Antigenic protein สวนหนึง่ จะถูกปลอยออกนอกเซลล ซึง่ อาจเกิดจาก antigenic protein นั้นมีคณ ุ สมบัตเิ ปน secreted protein หรือเกิดจากการทีเ่ ซลลถกู ทําลาย ซึ่ง antigenic protein ที่ ออกมานอกเซลลเหลานี้จะถูก process และกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันเชนเดียวกัน exogenous antigen คือถูก uptake โดย antigen presenting cells จากนัน้ จะถูกตัดเปน peptide ทอนสัน้ ๆ แลวสงออก มาบนผิวเซลลรวมกับ MHC class II molecule และสงไปกระตุน CD4+ cells ใหหลั่ง lymphokines ออกมา ซึ่ง lymphokines เหลานี้สามารถกระตุน ใหเซลลตา งๆ ในระบบภูมิคุมกันเชน monocytes, macrophages, neutrophils, B lymphocytes, CD4+ lymphocytes, CD8+ lymphocytes และ NK cells ใหทํางานไดดยี ง่ิ ขึน้ การทํางานของเซลลเหลานีก้ อ ใหเกิดการทํางานของระบบภูมคิ มุ กันที่ เรียกวา cell-mediated immunity antigenic protein สวนหนึง่ สามารถกระตุน B lymphocytes และโดยความชวยเหลือของ lymphokines ที่ปลอยมาจาก activated CD4+ lymphocytes ทําให B lymphocytes ที่ถูกกระตุน แลวนีก้ ลายเปน plasma cells สรางแอนติบอดีออกมา แอนติบอดีทส่ี รางออกมานีส้ ามารถจับและ ทําลายเชื้อโรคได เกิดเปนการตอบสนองทาง humoral mediated immunity ขึ้น

15-11

Plasmid vector ที่ใชใน DNA vaccine ดังไดกลาวมาแลววาในงาน DNA vaccination จําเปนตองมีการเชือ่ มตอยีนทีส่ นใจเขากับ plasmid vector ที่เหมาะสมเพือ่ ควบคุมการแสดงออกของยีน โดยทัว่ ไป plasmid vector ที่ใชในงาน DNA immunization ควรประกอบดวยสวนตางๆ คือ 1. Transcriptional promoter ตองเปน promoter ที่สามารถทํางานไดใน eukaryotic cells ทําหนาทีค่ วบคุมให gene ที่สอดใสหลัง promoter นี้เกิดการ transcription 2. Enhancer element ทําหนาทีเ่ พิม่ กระบวนการ gene expression สวนนี้อาจจะมีหรือไมมี ก็ได 3. สวนของยีนทีก่ าหนดการสร ํ าง antigenic protein ที่สนใจ โดยแทรกเขาไปใน vector ใน ตําแหนงหลัง eukaryotic promoter 4. RNA-processing elements ไดแก polyadenylation signal และ intron element ทํา หนาทีช่ ว ยเพิม่ กระบวนการ transcription และทําให RNA ที่สรางออกมามีความคงตัวยิง่ ขึน้ นอกจากนี้ plasmid vector ยังตองประกอบดวย bacterium-specific genetic sequences 2 ชนิด ไดแก antibiotic selectable marker และ bacterium origin of replication โดยทัง้ 2 สวนนี้มี ประโยชนในการเตรียม DNA ใหไดปริมาณมากๆ ในแบคทีเรีย จากคุณสมบัตขิ อง plasmid DNA ดังกลาวนีท้ ําใหเมือ่ ฉีดเขาไปในรางกาย ยีนทีแ่ ทรกอยูใ น vector จะแสดงออกโดยสรางเปนโปรตีนโดย อาศัย transcription และ translation mechanisms ปกติของรางกาย

การประยุกตใช DNA vaccine จากหลักการของวิธี DNA vaccination ดังกลาวทําใหนกั วิทยาศาสตรเชือ่ วาวิธนี น้ี า จะ สามารถนํามาแทนวัคซีนทีม่ ใี ชกนั ในปจจุบนั จึงไดมกี ารศึกษากันอยางกวางขวางในสัตวทดลองชนิด ตาง ๆ ในโรคตาง ๆ มากมาย เชน Hepatitis B, Hepatitis C, Influenza, Malaria, Tuberculosis, Leishmaniasis, AIDS หรือแมแตมะเร็ง และพบวา DNA vaccine ใชไดผลดีมาก นอกจากการนํา วิธี DNA vaccination มาใชในแงของการปองกันโรคแลว ยังไดมีการนําวิธี DNA vaccination นี้มา ประยุกตใชในการผลิตแอนติบอดีตอ โปรตีนทีส่ นใจเพือ่ ใชงานอีกดวย

15-12

ขอดีของ DNA vaccine จากการศึกษาทีผ่ า นมาพบวาวิธี DNA vaccination มีขอดีหลายประการเมื่อเทียบกับวัคซีนที่ ใชอยูใ นปจจุบนั คือ 1. DNA vaccine สามารถกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันทัง้ ชนิด humoral mediated immunity และ cell-mediated immunity ทั้งการกระตุน CD4+ lymphocytes และ CTL response 2. การเตรียม DNA ทําไดงายและ DNA ที่เตรียมไดมีความคงตัวสูง 3. สามารถเตรียมเปน recombinant vaccine โดยการแทรกยีนทีก่ าหนดการสร ํ างโปรตีนของ เชื้อโรคหลายชนิดเขาไปใน vector อันเดียวกัน ทําใหการฉีดวัคซีนเพียงครัง้ เดียวไดผลกับโรคหลาย ชนิด

ขอดอยของ DNA vaccine อยางไรก็ตามปญหาทีย่ งั เปนทีก่ งั วลกันอยูใ นปจจุบนั ในการนํา DNA vaccine ไปใชคอื ความ ปลอดภัย มีคําถามตางๆ มากมายตอการนํา DNA vaccine ไปใช เชน 1. DNA ที่ใหเขาไป อาจไปแทรกอยูใ นโครโมโซมของผูร บั ทําใหเกิดการเปลีย่ นแปลงของ พันธุกรรมและมีผลตอการเกิดมะเร็ง 2. Viral promoter และ mammalian หรือ viral terminator และ polyadenylation signals ที่ใชควบคุม gene expression ใน vector จะมีผลตอยีนในโครโมโซมของผูร บั หรือไม 3. Antibiotic resistant genes ที่ใชใน vector จะมีผลอยางไรกับผูรับ 4. Plasmid DNA กระตุน ใหรา งกายสราง anti-DNA antibodies หรือไม 5. สารเคมีตางๆ ทีใ่ ชเตรียม DNA เปนพิษตอผูร บั หรือไม คําถามตางๆ เหลานีก้ าลั ํ งอยูใ นระหวางการศึกษาอยางเรงรีบ เพื่อหวังวา DNA vaccination นาจะเปนหนทางหนึ่งที่จะนํามาใชตอ สูก บั โรครายตางๆ ในอนาคต

Adjuvants Adjuvants คือสารใดๆ ที่เมือ่ ผสมกับแอนติเจนแลว ทําใหคณ ุ สมบัตใิ นการกระตุน ระบบ ภูมิคุมกันของแอนติเจนนั้นๆ ดีขน้ึ โดยทั่วไป การฉีดโปรตีนแอนติเจนชนิดสารนํา้ (soluble protein antigen) เขาสูรา งกายมักกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันไดไมคอ ยดี แตถานําโปรตีนแอนติเจนนัน้ มาผสมกับ adjuvant กอนแลวจึงฉีดเขาสูรางกายจะทําใหการกระตุน ภูมคิ มุ กันเกิดขึน้ ไดดยี ง่ิ ขึน้ กลไกการชวยกระตุน ระบบภูมคิ มุ กันของ adjuvant แบงไดเปน 2 กลไก คือ 15-13

1. Adjuvant เปลี่ยนสภาพของแอนติเจนจากที่เปน soluble form ไปเปน particulate form ซึ่งแอนติเจนชนิด particulate form จะถูกจับและ process โดย antigen presenting cells ไดดกี วา แอนติเจนชนิด soluble form 2. Adjuvant บางชนิดมี bacteria หรือ bacterial product ผสมอยู ซึง่ มีคณ ุ สมบัตไิ ปกระตุน เซลล macrophages ใหกลายเปน activated macrophages และหลั่ง cytokines ออกมาหลายชนิด cytokines เหลานีส้ ามารถกระตุน ให lymphocytes ทํางาน นอกจากนี้ activated macrophages ยังมี ความสามารถในการเปน antigen presenting cells ทีด่ ี Adjuvants ที่นิยมใชในปจจุบนั และกลไกการกระตุน ระบบภูมคิ มุ กัน ดังแสดงในตารางที่ 15-4 ตารางที่ 15-4 แสดง adjuvants ที่ใชทั่วไป และการใชงาน ชนิดของ adjuvant สวนประกอบ กลไกการออกฤทธ Incomplete Freund’s adjuvant Complete Freund’s adjuvant Freund’s adjuvant with MDP

Alum (Aluminum hydroxide) Alum plus Bordetella pertussis Immune stimulatory complxes (ISCOMs)

Oil-in water emulsion

Delayed release of antigen; enhanced uptake by macrophages Oil-in water emulsion with Delayed release of antigen; enhanced uptake dead mycobacteria by macrophages; induction of co-stimulators in macrophages Oil-in water emulsion with Similar to complete Freund’s adjuvant muramyldipeptide (MDP), a constituent of mycobacterium Aluminum hydroxide gel Delayed release of antigen; enhanced uptake by macrophages Aluminum hydroxide gel Delayed release of antigen; enhanced uptake with killed B. pertussis by macrophages; induction of co-stimulators Matrix of Quil A Delivers antigen to cytosol; allows induction of containing viral protein cytotoxic T cells

15-14

ภูมิคุมกันบําบัด (Immunotherapy) ภูมิคุมกันบําบัด เปนการนําเอาวิธกี ารทางภูมคิ มุ กันมาใชรกั ษาโรคตางๆ เชน โรคภูมคิ มุ กัน บกพรอง (immunodeficiency diseases) โรคติดเชือ้ ชนิดตางๆ (infectious diseases) โรคภูมติ า นทานตนเอง (autoimmune diseases) และโรคมะเร็ง (cancer) โดยการนําสารตางๆ มากระตุนการ ทํางานของระบบภูมิคุมกัน วิธีภูมิคุมกันบําบัด อาจแบงไดเปน 2 ประเภทใหญๆ คือ nonspecific immunotherapy และ antigen-specific immunotherapy

Nonspecific immunotherapy เปนภูมิคุมกันบําบัด เพือ่ หวังผลการกระตุน ภูมคิ มุ กันทัว่ ไปของผูป ว ย

โดยการใหสารตางๆ

ไดแก

1. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) BCG เปน live attenuated strain ของเชื้อ Mycobacterium bovis การให BCG มีผล กระตุนเซลล macropahges ใหหลั่ง interleukin 1 (IL-1) ซึ่งสาร IL-1 นี้สามารถกระตุน การทํางาน ของ T lymphocytes ได จากการศึกษาในสัตวทดลองพบวา BCG สามารถใชรักษามะเร็งที่มีสาเหตุ จากสารเคมีและเชื้อไวรัสบางชนิดได BCG สามารถกระตุน natural killer cell (NK cells) ซึ่งมี คุณสมบัตใิ นการทําลายเซลลมะเร็งได BCG ใชไดผลดีมากในการรักษาโรคมะเร็ง melanoma และ bladder cancer อยางไรก็ตามการฉีด BCG มักทําใหเกิดแผลและอาจเกิด hypersensitivity reaction ในบางคน

2. Muramyl dipeptide (MDP) การใช BCG ในภูมิคุมกันบําบัด บางครัง้ ทําใหเกิดอาการขางเคียงทีร่ นุ แรง จึงมีความ พยายามแยกสวนของ BCG แลวนํามาใชในงานภูมิคุมกันบําบัดแทนการใช BCG เพื่อลดอาการ ขางเคียง Muramyl dipeptide (MDP) เปน substituted monosaccharide (N-acetyl-muramylL-alanyl-D-isoglutamine) ที่สกัดจาก cell wall ของ mycobacterium และนํามาใชแทน BCG MDP นี้มีคุณสมบัติเปน immunoadjuvant ที่แรงมาก และมีผลกระตุนการทํางานของ macrophages และ antigen presenting cells

15-15

3. Corynebacterium parvum C. parvum เปนแบคทีเรียชนิดกรัมลบ ใชรักษาโรคโดยใหกนิ หรือฉีดในหรือรอบๆ กอน มะเร็ง C. parvum สามารถยับยัง้ การเจริญของกอนมะเร็ง และยับยั้งการแพรกระจายของเซลลมะเร็ง ได พบวา C. parvum ออกฤทธิโ์ ดยการกระตุน macrophages มีการทดลองใช C. parvum รักษา โรคมะเร็งในคนหลายชนิด เชน malignant melanoma, lung cancer และ breast cancer โดยใชรวม กับการรักษาดวยยารักษามะเร็งอืน่

4. Thymic hormones Epithelium ของตอมไธมัสสามารถสรางสารหลายชนิด ซึง่ ออกฤทธิค์ ลายฮอรโมน และมี บทบาทในการควบคุมพัฒนาการของ T cells สารดังกลาวไดแก thymosin, facteur thymique serique (FTS) และ thymoprotein สารดังกลาวถูกนํามาใชรกั ษาผูป ว ยทีม่ คี วามผิดปกติของ T lymphocytes เชน Nezelof’s syndrome, Wiskott-Aldrich syndrome, ataxia-telangiectaxia และ immunodeficiency ที่มี enzyme deficiency โดยใหในรูป thymus extract

5. Levamisole ยาตัวนีเ้ ปนอนุพนั ธของ tetramisole ใชเปนยารักษาพยาธิในสัตว พบวา levamisole ชวยเพิม่ ความตานทานตอเซลลมะเร็ง สวนในคนพบวายาตัวนีช้ ว ยแกไขและเพิม่ delayed skin hypersensitivity ตอแอนติเจนชนิดตางๆ ในผูท ม่ี กี ารตอบสนองตํ่าหรือผูป ว ยโรคมะเร็ง levamisole ยังชวยใหผปู ว ยทีต่ ดิ เชือ้ ตางๆ เชน herpes labialis, herpes genitalis, หูด และ chronic staphylococcal infection และผูป ว ย gastric cancer ระยะที่ III มีอาการดีขึ้น แต levamisole มัก ทําใหผูปวยเกิดอาการขางเคียงได เชน เกิดคลืน่ ไส ครัน่ เนือ้ ครัน่ ตัว มีผื่น และทําใหเม็ดเลือดขาวลดตํา่ (granulocytopenia) อาการดังกลาวจะหายไปเมื่อหยุดยา

6. Cytokine therapy มีการนําสาร cytokines หลายชนิดมาใชในงานภูมิคุมกันบําบัด เชน interferon, tumor necrosis factor (TNF), IL-2 หรือ IL-4 โดยอาศัยหลักการวาสาร cytokines เหลานีม้ คี ณ ุ สมบัตใิ น การกระตุนการทํางานของเซลลเม็ดเลือดขาวชนิดตางๆ Cytokine therapy มีหลายชนิด เชน การให interferon เพื่อรักษาการติดเชือ้ ไวรัส และรักษาโรคมะเร็งอีกหลายชนิด เชน osteosarcoma, Hodgkin’s disease, multiple myeloma, cervical cancer, basal cell caracinoma, breast cancer non-Hodgkin’s disease และ neuroblastoma และพบวาการรักษามะเร็งจะใหผลดียิ่งขึ้น เมื่อให interferon รวมกับ TNF การให interleukin 2 ในผูปวยมะเร็งเชื่อวา IL-2 จะกระตุน specific tumor-reactive T cells ได โดยพบวา IL-2 สามารถรักษาผูป ว ย melanoma ไดผลประมาณ 25-40% 15-16

7. LAK therapy NK cells และ T lymphocytes บางชนิด เมื่อกระตุนดวย IL-2 เปนเวลา 4 วัน จะกลาย เปนเซลลทม่ี คี วามสามารถในการทําลายเซลลมะเร็งไดสูงมาก เรียกวา lymphokine-activated killer cells หรือ LAK cells ดังนัน้ จึงมีการนํา LAK cells มาใชในการรักษามะเร็งบางชนิด โดยนําเซลล ของผูป ว ยเองมากระตุน ดวย IL-2 นอกรางกาย จากนัน้ นําเซลลทถ่ี กู กระตุน ใหเปน LAK cells แลวนี้ ฉีดกลับเขาไปในรางกายอีกครั้ง เพื่อทําลายเซลลมะเร็งในรางกายผูป ว ยเอง (รูปที่ 15-7)

รูปที่ 15-7 แสดง LAK therapy

Antigen-specific immunotherapy เปนวิธีภูมิคุมกันบําบัดทีจ่ ําเพาะตอแอนติเจนทีส่ นใจ มีหลายวิธี ไดแก

1. Specific active immunotherapy เปนวิธีการแยกแอนติเจนจากเซลลมะเร็ง แลวนํามาใชเปนวัคซีนเพือ่ ฉีดใหผปู ว ยโรค มะเร็ง เพื่อกระตุน ใหเกิด humoral immune response และ cell-mediated immune response ตอ เซลลมะเร็ง แอนติเจนทีใ่ ชนอ้ี าจไดมาจากการนําเอาเซลลมะเร็งมาแตก แลวเอาไปฉีด (lysed whole tumor cells) หรือแยกเอาเฉพาะแอนติเจนจําเพาะจากเซลลมะเร็ง เชนการแยกเอา gangliosides 15-17

จาก melanomas หรือ mucins จาก carcinomas เปนตน หรือนําเซลลมะเร็งมายอยดวยเอนไซม neuraminidase เพื่อหวังผลในการเพิ่ม immunogenicity ของเซลลมะเร็ง แลวใหกลับเขาในผูป ว ย

2. Magic bullet therapy เปนวิธีที่นํายารักษามะเร็ง หรือสารพิษ หรือสารกัมมันตรังสีมาติดฉลากเขากับแอนติบอดี ที่จําเพาะตอเซลลมะเร็งแลวใหแกผูปวย แอนติบอดีนจ้ี ะไปจับกับเซลลมะเร็งทําใหสารพิษ หรือยา หรือสารรังสี ไปมีผลกับเซลลมะเร็งโดยตรง (รูปที่ 15-8)

รูปที่ 15-8 แสดง การใชแอนติบอดีรว มในการรักษามะเร็งแบบ magic bullet therapy

3. DNA vaccine วิธีนค้ี ลายกับวิธี specific active immunotherapy แตแทนที่จะฉีดแอนติเจนของเซลล มะเร็งเขาไป กลับนํายีนทีก่ าหนดการสร ํ างโปรตีนทีจ่ าเพาะกั ํ บเซลลมะเร็งมาตอกับ plasmid vector ที่ เหมาะสม (เชนเดียวกับทีใ่ ชในงาน DNA vaccination ที่กลาวมาแลว) แลวฉีดเขาในผูป ว ยมะเร็ง โดย ยีนที่ใหเขาไปจะไปสรางเปน tumor antigen ในผูปวย และกระตุนระบบภูมิคุมกันในที่สุด 15-18

เอกสารอานประกอบ 1. Abbas AK, Lichtman AH, Peter JS. Cellular and Molecular Immunology. 2nd ed. London: W.B. Saunders, 1994. 2. Janeway CA, Travers P, Walport M, Capra JD. Immunobiology. 4th ed. New York: Garland Publishing, 1999. 3. Kasinrerk W, Tokrasinwit N, Piluk Y. Production of mouse anti-CD4 antibodies by DNAbased immunization. Asian Pacific J Allerg Immun 1996; 14:99-105. 4. Kasinrerk W, Tokrasinwit N, Changtumroung K. Production of anti-CD4 antibodies in rabbits by DNA Immunization. Asia Pacific J. Mol Biol Biotech 1997; 5:123-129. 5. Kasinrerk W, Tokrasinwit N. Inhibition of PHA-induced cell proliferation by polyclonal CD4 antibodies generated by DNA immunization. Immunol letters 1999; 67: 237-242. 6. Male D, Champion B, Cook A, Owen M. Advanced Immunology. London: Grower Medical Publishing, 1991. 7. Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology. 2nd ed. London: Grower Medical Publishing, 1989. 8. Tizard IR. Immunology : An Introduction. 4th ed. London: Saunders College Publishing. 1995.

15-19