Tp Gdh Bon

III. Résultats et interprétations 1. Fractionnement cellulaire A partir de l’homogénat on récupère 3 fractions, provenant de 2 centrifugations (à des vitesses différentes), dont on a mesuré les volumes. On obtient : Homogénat : 186 ml dont on prélève 30 ml pour effectuer les différents dosages. On a donc centrifugé 156 ml. Surnageant 1 : 139 ml obtenus à partir des 156 ml centrifugés. On a donc jeté avec le culot 1 un volume 156 – 139 = 17 ml On prélève 30 ml sur les 139 ml, on va donc centrifuger 109 ml de S1. Surnageant 2 : 79 ml obtenus à partir des 109 ml centrifugés. On en prélève 30 ml pour les dosages. Culot 2 : Au culot 2 de 25 ml, on rajoute 20 ml du tampon saccharose-Tris ce qui nous donne un volume final de 45 ml. 2. Dosage des protéines par la méthode du biuret a) Gamme étalon

Tubes

A

B

C

D

E

F

Ovalbumine 5 mg/ml

0

0,1

0 ,2

0 ,3

0,4

0,5

Quantité d’ovalbumine (mg)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Cholate de Na+ 4%

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

NaOH 10% (qsp 2,7 ml)

2,7

2,4

2,3

2,2

2,1

2

CuSO-4 (ml)

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

Volume total (ml)

3

3

3

3

3

3

Concentration corrigée en ovalbumine

0

0,17

0,33

0,5

0,67

0,83

(ml)

(ml)

(mg/ml) Do540nm lue

0,086

0,128

0,174

0,212

0,257

0,300

Do540nm corrigée

0

0,042

0 ,088

0,126

0,171

0,214

Dans chaque tube, on a fait varier la concentration en ovalbumine car on a dilué la concentration initiale dans 3ml de volume total. Le tube A ici, nous sert de blanc. Il nous permet donc de réajuster la DO540nm en éliminant l’absorbance des autres substances contenues dans les tubes. La courbe de cette gamme étalon est en annexe 1. Calcul de la pente de la gamme étalon : Pente=y2-y1/x2-x1=0,214-0,042/2,5-0,5= 0,086. On aura donc Absorbance= 0,086×quantité de protéine essai. Quantité de protéine= Abs/ 0,086 Exemple de calcul de la concentration corrigée pour le tube C : •

Concentration corrigée = Quantité d'ovalbumine(mg)volume total (ml)=13= 0,33 mg/ml

Exemple de calcul de la Do540nm corrigée pour le tube C: •

Do540nm corrigée = Do540nm lue tube - Do540nm lue du blanc= 0,174 - 0,086= 0,088

b) Essais Tubes(ml)

H0,05

H0,1

S10,0

S10,1

S20,0

S20,1

C20,0

Cholate de Na+ 4%

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

2,45

2,4

2,45

2,4

2,45

2,4

2,45

2,4

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

Volume totale (ml)

3

3

3

3

3

3

3

3

Do540nm lue

0,23 2 0,14 6

0,35 6 0,27

0,19 2 0,10 6

0,30 2 0,21 6

0,16 8 0,08 2

0,24 7 0,16 1

0,15 6 0,07

0,21 7 0,13 1

5

(ml) NaOH 10% (qsp 2,7 ml) CuSO-4 (ml)

Do540nm corrigée

5

C20,1

5

Quantité de protéine (mg) Concentration de protéine (mg/ml) Quantité de protéines totales dans les fractions initiales (mg)

1,7

3,14

1,23

2,51

0,95

1,87

0,81

1,52

34

31,4

24,6

25,1

19

18,7

16,2

15,2

6324

5840 ,4

3419 ,4

3488 ,9

1501

1477 ,3

405

380

N .B : Lors de notre TP nous avons effectué une erreur de manipulation et nous avons prélevé un volume de 0,05 ml pour C20, 02 et un volume de 0,1 ml pour C20, 04. Exemple de calculs des valeurs du tableau Essais pour H0, 05: • • • •

Do540nm corrigée= Do540nm lue H0,05 - Do540nm lue du blanc=0,2320,086=0,146 Quantité de protéine H0, 05 (mg)=Do540nm corrigée H0,05pente courbe gamme étalon=0,146/0,086=1,7 mg Concentration de protéine H0, 05= Quantité de protéine (mg)/Volume (ml) =1,7/0,05= 34 mg/ml Quantité de protéines totales dans la fraction initiale H0, 05 (mg)= Concentration de protéine H0, 05 × Volume homogénat= 34×186= 6324 mg

c) Dilution de nos fractions pour le dosage enzymatique : A partir de ces fractions, nous désirons obtenir des solutions à 10 mg/ml pour les fractions H, S1 et S2 et une solution à 5 mg/ml pour la fraction C2. Pour cela, il nous a fallu réaliser différentes dilutions, mais aussi choisir les fractions d’essai étant dans la gamme étalon. Nous avons choisi les fractions H0, 05, S10, 05, S20, 05 et C20, 1. •

• • •

Homogénat : On a pour H0, 05 une concentration de 34 mg/ml or nous voulons une concentration de 10 mg/ml dans un volume final de 5 ml. On a donc volume à prélever=5×1034=1,47 ml à prélever puis on complète à 5 ml avec du tampon Saccharose-Tris. Surnageant 1 : On a pour S10, 05=5×1024,6=2,03 ml à prélever. Surnageant 2 : On a pour S20, 05=5×1019= 2,63 ml à prélever. Culot 2 : On a pour C20, 1=5×515,2=1,64 ml à prélever.

3. Dosage enzymatique de l’α-cétoglutarate Ce deuxième dosage se fera donc dans le sens de la formation du glutamate, au cours de laquelle se produit une réaction de désamination oxydative de l' α-KG.

Glutamate + NAD+ + H2O  α-cétoglutarate + NADH + H+ +NH4+

Cette réaction a une constante d'équilibre K, telle que K = (Glutamate)(NAD)(H2O) / ( α-KG)(NADH)(NH4)(H+) = 1,8x10^13 Cette valeur est très importante, ce qui indique que la réaction sera totale permettant un dosage en point final. Ainsi, à léquilibre on a :

delta G = -RT Ln(K)

avec R= 8,314 et T= 37°C soit 310K d'ou: deltaG=-8,314x310xLn(1,8x10^13) = -78664J deltaG est inférieur à 0, la réaction est donc spontanée dans le sens de la formation du glutamate; or on veut doser l'activité enzymatique du GDH à travaers la formation de l' α-KG. C'est pourquoi on met un mélange de NAD+/Glutamate, en excès, afin que cette réaction se produise dans le sens de la formation de l' α-KG,

a) Gamme étalon : Tube

A

B

C

D

E

F

Concentration d’ α-KG 1mM (ml)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Quantité d’ α-KG (µmol)

0

1O

20

30

40

50

H2O qsp 1ml

1

0,9

0,8

0,7

0,8

0,9

Mélange de dosage (ml)

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

GDH (µl)

20

20

20

20

20

20

Volume total (ml)

2,7

2,7

2,7

2,7

2,7

2,7

Do340nm lue

1,008

0,865

0,737

0,605

0,454

0,268

Do340nm corrigée (Valeur absolue)

0

0,143

0,271

0,403

0,554

0,74

Le tube A ici nous sert de blanc. En effet, celui-ci correspond donc au tube ne contenant que de α-KG sans GDH la disparition de celui-ci n’a donc pas encore commencé. La courbe de cette gamme étalon est en annexe 2. L’absorbance mesurée est en réalité due au coenzyme réduit NADH qui possède une absorbance à 340 nm. Durant cette réaction, nous suivrons donc sa disparition corrélée à la disparition de l’α-cétoglutarate (la réaction est équimolaire). Exemple de Calcul pour la quantité α-KG pour le tube C : • Quantité d’ α-KG (µmol)= 0,2 ×101-3×(1×10-3)= 20 µmol Calcul de la pente de la gamme étalon :

Pente=y2-y1x2-x1=0,74-0,14350-10= 0,0149. On aura donc Absorbance= 0,0149×quantité de protéine essai. Quantité de protéine= Abs/ 0,0149 Exemple de calcul de la Do340nm corrigée pour le tube C: •

ІDo340nm corrigéeІ = ІDo340nm lue – Do340nm lue du tube AІ= І 0,7371,008І=І0,271І

b) Essais : On désire étudier la cinétique enzymatique de la GDH liée à la disparition d’αcétoglutarate. De ce fait, on réalise des mesures d’absorbance à différents temps d’incubation (0, 4, 8 et 12 minutes). Grâce à la pente de la courbe étalon, on peut déterminer les concentrations en α-cétoglutarate par lecture de l’absorbance présente dans chacun des tubes. Homogénat

Surn agea nt 1

Fractions

HO0

HO4

HO8

HO12

S10

S14

S18

Do340nm lue

1,068

0,963

0,901

0,86 6

1,074

1,002 0,942

Do340nm corrigée (Valeur absolue)

0

0,045

0,107

0,14 2

0

0,006 0,066

Quantité de α-KG

0

3,02

7,18

9,53

0

0,4

4,43

C24

C28

consomme dans tube d’incubation (µmol) Surnageant 2

Culot 2

Fractions

S20

S24

S28

S212

C20

Do340nm lue

1,051

1,074

1,025

1,01 8

1,083

0,937 0,880

Do340nm corrigée (Valeur absolue)

0

0

0

0

0

0,071 0,128

Quantité de α-KG

0

0

0

0

0

4,77

8,6

Consommé dans tube d’incubation (µmol)

Exemple de calcul de la Do340nm corrigée : Pour la fraction HO0 : ІDo340nm corrigée HO0 І = ІDo340nm lue HO0 – Do340nm lue du tube AІ= І 1,0681,008І=І0І. On considère que la Do340nm corrigée HO0 est de 0 car la Do340nm lue du tube A correspond à 100% d’α-KG, et donc qu’il n’existe pas de DO dans l’absolu au dessus. Exemple de Calcul pour Quantité de α-KG consomme dans tube d’incubation (µmol) : •

• Pour la fraction de HO1 : Quantité de α-KG consommé dans tube d’incubation (µmol)= Abs HO1/ 0,0149=0,0450,0149=3,02 µmol c) Vitesse initiale et Activité totale : Grâce à la quantité d’α-KG, nous pouvons donc tracer la courbe de la quantité d’α-KG = f(t). Les courbes correspondant à [quantité d’α-KG] = f(t) se trouvent en

annexe 3. A partir des tangentes à l’origine de ces courbes, on peut déterminer les vitesses initiales de ces réactions. Etant donné que les réactifs autres que α-cétoglutarate sont en excès, ces vitesses correspondront aux vitesses maximales. Cela reflète l’activité enzymatique de notre réaction. Nous obtenons les vitesses suivantes : ViH = 0,7 µmol/min ViS1 = 0,5 µmol/min ViS2 = 0 µmol/min ViC2 = 1,15 µmol/min Grâce à ces vitesses initiales nous pouvons donc calculer les différents paramètres de notre réaction. d) Tableau récapitulatif des différents paramètres cinétiques :

Fraction s

Volum es des

Quantit é

fractio ns

de protéin es

Concen trations protéiq ues

Activit é

Activité

Taux

spécifiqu e

de

totale (µmol

(nmol/mi

purificati on

Rendem ent (%)

(ml)

(mg)

(mg/ml)

/min)

n/ mg)

Homogé nat

186

6324

34

0,7

0,117

1

100

S1 post

139

3419,4

24,6

0,5

0,1462

1,25

54,1

79

1501

19

0

0

0

23,7

25

380

15,2

1,15

3,03

25,9

6

nucléair e (600g) S2 post mitocho ndrial (9000g) C2 mitocho ndrial (9000g)

L’activité spécifique la plus forte dans la culot mitochondrial, on pouvons donc dire que la GDH est situé dans la mitochondrie. Exemple de calcul de l’Activité spécifique (nmol/min/mg) : • Pour S1 :

Activité spécifique=Activité totale de S1Quantité de protéines de S1=0,53419,4=14,62 nmol/min/mg

Exemple de calcul du taux de purification : • Pour S1 : Taux de purification S1=Activité spécifique de S1Activité spécifique de l'homogénat=0,14620,117=1,25

Exemple de calcul pour le rendement : • Pour S1 : Rendement S1=Quantité de protéine de S1Quantité de protéine de l'homogénat×100=3419,46324×100=54,07% e) Calcul du coefficient d'extinction molaire du NADH: D'après la Loi de Beer Lambert, on a: A=e.L.C avec A l'absorbance du tube A qui n'a pas d' α-KG e le coefficient d'extinction molaire C la concentration du NADH dans le tu be L la longueur de la cuve On a donc: A=1,008 L= 1 cm C= Concentration initiale X Volume /Volume totale

C= 0,34x1,5x10^-3 / 2,7 = 0,19 mM D'ou: e= A/ (L.C) = 1,008/(1x0,19x10^-3) = 5305,3 M-1.cm-1

IV Conclusion