Terjemahan Bakteri Oksidoreduktase.docx

JURNAL KIMIA BIOLOGIS VOL. 284, TIDAK. 26, hlm. 17835–17845, 26 Juni 2009 © 2009 oleh The American Society for Biokimia dan Biologi Molekuler, Inc. Dicetak di AS

Struktur Enzim Bakteri Oksidoreduktase DsbA

dalam Kompleks dengan Peptida Mengungkap Dasar untuk Spesifisitas Substrat di Siklus Katalis Enzim DsbA*D

S

Diterima untuk publikasi, 4 Maret 2009, dan dalam bentuk revisi, 22 April 2009 Diterbitkan, JBC Papers in Press, 22 April 2009, DOI

J. Paxman‡, Natalie A. Borg§1, James Horne‡, Philip E. Thompson‡, Yanni Chin‡, Pooja Sharma‡, Jamie S. Simpson‡, Jerome Wielens‡, Susannah Piek¶, Charlene M. Kahler¶2, Harry Sakellaris¶, Mary Pearce, Stephen P. Bottomley, Jamie Rossjohn§3, dan Martin J. Scanlon‡ 4 Dari ‡Kimia Obat dan Tindakan Obat-Obatan, Monash Institute of Pharmaceutical 10.1074 / jbc.M109.011502 Jason

Sciences, Monash University (Parkville Campus), 381 Royal Parade, Parkville, Victoria 3052, yang §Protein Kristalografi unit, Rese Australia lengkung Dewan Pusat Keunggulan dalam Genomik Mikroba Struktural dan Fungsional, Departemen Biokimia dan Biologi Molekuler, Sekolah Ilmu Biomedis, Universitas Monash, Clayton, Victoria 3800, ¶Sekolah Ilmu Biomedis, Biomolekul dan Kimia, Pusat

Medis QEII, Universitas Barat Australia, Crawley, Australia Barat 6009, dan Departemen Biokimia dan Biologi Molekuler, FakultasBiomedis Ilmu, Universitas Monash, Clayton, Victoria 3800, Australia Lipatan protein oksidatif dalam bakteri Gram-negatif yang menunjukkan bahwa spesifisitas substrat DsbA menghasilkan pembentukan ikatan disulfida antara pasangan dapat dimodifikasi melalui perubahan pada residu antarmuka iden-sistein pengikat. Ini adalah proses multistep di mana diuraikan dalam struktur kompleks. Enzim dithiol-disulfide oksidoreduktase, DsbA, memainkan peran sentral. Struktur DsbA terdiri dari domain semua heliks dari fungsi yang tidak diketahui dan domain thioredoxin, di mana situs aktif mensistribusi antar-jemput antara bentuk teroksidasi, terikat sub-strate, tereduksi dan bentuk terikat DsbB, di mana DsbB adalah protein membran yang mereoksidasi DsbA . Sebagian besar enzim DsbA berinteraksi dengan berbagai macam substrat tereduksi dan menunjukkan sedikit spesifisitas. Namun, sejumlah enzim DsbA kini telah diidentifikasi yang memiliki repertoar substrat yang sempit dan tampaknya berinteraksi secara khusus dengan sejumlah kecil substrat. Sifat sementara dari kompleks substrat DsbA telah menghambat pemahaman kita tentang faktor-faktor yang mengatur interaksi enzim DsbA dengan substratnya. Di sini kami melaporkan struktur kristal kompleks antara Escherichia coli DsbA dan peptida dengan urutan yang berasal dari substrat. Situs pengikatan diidentifikasi dalam kompleks DsbApeptida berbeda dari yang diamati untuk DsbB di kompleks DsbA-DsbB. Struktur mengungkapkan rincian interaksi DsbA-peptida dan menyarankan mekanisme dimana DsbA secara bersamaan dapat menunjukkan spesifisitas luas untuk substrat namun menunjukkan spesifisitas untuk DsbB. Mode pengikatan ini didukung oleh solusi data resonansi magnetik nuklir serta data fungsional,

Pembentukan ikatan disulfida adalah langkah penting dalam pelipatan yang tepat dan stabilitas banyak protein yang disekresikan. Pada bakteri Gram-negatif, pembentukan ikatan disulfida terjadi di periplasma dan dikatalisis oleh enzim dari keluarga Dsb. Keluarga Dsb mengandung beberapa anggota, yang menengahi berbagai aspek pembentukan ikatan disulfida dan isomerisasi (1). DsbA adalah enzim yang terutama bertanggung jawab untuk pembentukan ikatan disulfida dalam protein substrat yang baru disintesis (Gbr. 1). Dalam reaksi ini, DsbA teroksidasi bereaksi dengan protein substrat untuk menghasilkan zat antara disulfida campuran. Perantara reaksi kovena ini cepat diselesaikan untuk melepaskan substrat teroksidasi dan mengurangi DsbA. Reds DsbA pada gilirannya direoksidasi oleh protein membran dalam DsbB (2). Bakteri yang tidak memiliki tampilan DsbA fungsional menunjukkan gejala pleiotropik, karena lipatan sejumlah besar

protein yang mengandung ikatan disulfida terganggu. Banyak dari ini adalah protein yang dikeluarkan, seperti racun dan protein permukaan, yang berkontribusi terhadap virulensi bakteri (3). Misalnya, DsbA diperlukan untuk pembentukan sistem sekresi fungsional tipe III pada banyak bakteri, termasuk Pseudomonas aeruginosa (4, 5), Shigella flexneri (6), Salmonella enterica serovar Typhimurium (7), dan

*

Karya ini didukung dalam sebagian oleh Australian Research Council (ARC) Grant LP0455508 dan National Research and Medical Research Council (NHMRC) Grant 455860.

Yersinia pestis (8); dsbA Vibrio cholerae tidak dapat mengeluarkan toksin kolera (9); dsbA straindari E. coli menunjukkan penurunan tingkat aktivitas -laktamase (10) dan hipersensitif terhadap benzyl Theatomiccoordinates andstructurefactors (kode3DKSdisimpan) telahdi Bank Data Protein, Kolaborasi Penelitian untuk Bioinformatika Struktural, DS The Rutgers on-line University,

versi New of ini Brunswick, artikel (tersedia NJ (http://www.rcsb.org/). di http://www.jbc.org) mengandung

penisilin, dithiothreitol (11), dan beberapa kation divalen logam (12). Selain itu, DsbA telah terbukti diperlukan untuk kelangsungan hidupintraseluler S. flexneri (13) dan P. aeruginosa (4), tambahan buah ara. 1–4 dan Tabel 1 dan 2. 1 Didukung oleh NHMRC Career Development Award. 2 Didukung oleh Ada Bartholomew Trust. 3 Didukung oleh Persekutuan Federasi ARC. Kepada siapa korespondensi

dan DsbA diperlukan untuk virulensi S. enterica dalam model infeksi tikus (7). Masing-masing fenotipe ini telah dikaitkan dengan kurangnya pembentukan disulfida dalam substrat protein dapat diatasi. Tel .: 61-3-99029236; Faks: 61-3-99054699; E-mail: [email protected]. 4 Kepada siapa korespondensi dapat ditangani. Tel .: 61-3-99039540; Faks: 61-3-99039582; E-mail: [email protected].

DsbA. Dengan demikian, ada minat yang cukup besar dalam dasar struktural aktivitas DsbA dan selektivitas dan perannya dalam virulensi bakteri. 26 JUNI 2009 • VOLUME 284 • JUMLAH 26 JURNAL KIMIA BIOLOGI 17835

Struktur Kompleks DsbA-Peptida

Struktur DsbA dari E. coli (EcDsbA) dan V. cholerae (VcDsbA) telah diselesaikan baik dalam bentuk tereduksi maupun teroksidasi (14-18). Masing-masing berisithioredoxin (TRX)5 domain, lipatan struktural umum dari tiol-disulfida oksiduktuktase (19), dan domain heliks yang dimasukkan (14). Enzim DsbA mengandung satu pasang sistein redoks-aktif dalam CXXmotifC (Cys30-Pro3132 33 Tinjauan -Cys di EcDsbA) dan cis- residu prolin (Pro151di EcDsbA) yang berdekatan di tiga - lipatan dimensi tetapi jauh dalam urutan; keduanya merupakan fitur terlengkap dari lipatan TRX redoks-aktif (19). EcDsbA dan VcDsbA berbagi kesamaan urutan yang relatif rendah (40%), namun tetap mempertahankan fitur permukaan yang dilestarikan di sekitar situs aktif mereka, yang telah diusulkan untuk membentuk situs yang mengikat substrat (20). Ini termasuk patch hidrofobik dan alur hidrofobik, yang mengapit situs aktif enzim. Di dalam alur hidrofobik adalah cis-residuprolin yang merupakan fitur terlindung dari lipatan TRX dan dalam DsbA ditemukan dalam satu lingkaran di ujung heliks panjang, yang menghubungkan domain hikal dan TRX. Struktur EcDsbA telah ditentukan secara kompleks dengan DsbB (21), yang mengungkapkan bahwa loop periplasmik GAMBAR 1. Siklus katalitik DsbA. a, DsbA teroksidasi bereaksi dengan berbagai protein substrat untuk menghasilkan kompleks substrat DsbA-disulfida DsbB terikat dalam alur hidrofobik DsbA (21). Alur hidrofobik juga telah secara luas diasumsikan sebagai situs pengikatan substrat DsbA, campuran (b). Kompleks ini cepat diselesaikan dengan melepaskan meskipun sifat transien kompleks substrat DsbA telah menghambat substrat teroksidasi dan mengurangi DsbA (c). Reduksi DsbA bereaksi karakterisasi strukturnya. secara khusus denganterikat DsbB yangmembran untuk membentuk

Banyak enzim DsbA menampilkan spesifisitas substrat luas. Dalam E. coli, misalnya, telah diperkirakan bahwa DsbA dapat mengoksidasi ratusan protein substrat yang berbeda (22). Barubaru ini, sejumlah enzim DsbA telah dijelaskan yang menampilkan

kompleks dissida DsbA-DsbB (d), yang menghasilkan reoksidasi DsbA yang dan

pengurangan DsbB.

spesifisitas substrat yang lebih sempit, dan struktur beberapa ini telah serupa di sekitar situs aktif tetapi mengadopsi konformasi yang dilaporkan. Ini termasuk enzim DsbA berbeda dalam loop yang menghubungkan dua domain, yang berdekatan dengan situs aktif. Temuan ini menunjukkan bahwa ada perbedaan halus dalam proses yang memediasi pengenalan substrat oleh DsbA teroksidasi dan triphenylmethyl; cP, cis- proline; DTT, dithiothreitol; HPLC, kromatografi cair pengakuan DsbB dengan mengurangi DsbA. Pengamatan ini didukung tekanan tinggi; Hse, residu homoserine; rms, root mean square. oleh analisis N. meningitidis, yang mengekspresikan tiga enzim DsbA Terlepas dari perbedaan fungsionalnya, semua enzim DsbA yang dikodekan secara kromosom (29, 30). Dua dariini Neisserial yang dicirikan memiliki struktur tersier yang sama, dan perubahan enzim DsbA(NmDsbA1 dan NmDsbA2) berbagi 73% identitas urutan minimal telah diamati antara struktur yang dilaporkan dari bentuk (29) dan mempertahankan urutan situs aktif DsbA kanonik (Cys-Protereduksi dan teroksidasi dari protein. Namun, ada beberapa perbedaan His-Cys). Namun, komplemen dsbA E. coli dengan NmDsbA1 atau dalam urutan di sekitar situs aktif yang dapat berkontribusi pada NmDsbA2 menghasilkan transforman dengan fenotipe yang berbeda perbedaan yang diamati dalam aktivitas antara enzim DsbA (29), ini. menunjukkan bahwa enzim ini mampu membedakan antara Misalnya, di sebagian besar enzim DsbA, ada residu valin substrat spesifik (29, 30). Namun, NmDsbA1 dan NmDsbA2 mendahuluidilestarikan cis-proline(VcP). Dalam kedua SaDsbA ditunjukkan dan untuk melengkapi sensitivitas DTT dari dsbA E. coli, NmDsbA3, residu yang mendahului cis-proline adalah threonine menunjukkan bahwa meskipun mereka berbeda dalam spesifisitasnya (TcP). TcP motif juga ditemukan di Gram-negatif protein disulfida untuk mengoksidasi protein substrat (29), keduanya adalah isomerase (DsbC dan DsbG). Sebelumnya telah diperlihatkan bahwa oksidoreduktase fungsional, dan mampu direoksidasi oleh EcDsbB. mutasi dalam cis-loopproline DsbC dan DsbG dapat memengaruhi Rincian struktural tentang bagaimana DsbA mengenali spesifisitas substrat enzim-enzim ini (27), dan baru-baru ini, telah substratnya terbukti sulit diperoleh, karena reaksi kovalen berinteraksi ditunjukkan bahwa residu ini penting dalam menentukan fungsi dari antara DsbA dan substratnya yang relatif pendek. Meskipun protein banyak lipatan TRX. protein (28). Meskipun DsbL mempertahankan DsbA mutan telah diidentifikasi yang menstabilkan intermediet urutan VcP, struktur telah mengungkapkan bahwa SaDsbA dan DsbL disulfida campuran (31), ada yang ditonton tidak memiliki fitur permukaan hidrofobik di sekitar situs aktif mereka, sedangkan NmDsbA3 menyajikan permukaan hidro-fobik 5

Singkatan

yang

digunakan

adalah:

TRX,

thioredoxin;

Trt,

17.836 Journal of Biological Chemistry VOLUME 284 • NOMOR 26 • 26 Juni 2009

dari Neisseria meningitidis (NmDsbA3) (23) serta DsbA dari organisme Gram-po aureus (SaDsbA) (24) dan enzim DsbA kedua (DsbL) (25) yang ada dalam beber E. coli (25). Karakterisasi fungsi telah mengungkapkan bahwa SaDsbA dan NmD melengkapi sebagian dsbA E. coli (24, 26), menunjukkan bahwa keduanya memil lebih sempit daripada EcDsbA, sedangkan analisis biokimia mengungkapkan bah substrat untuk EcDsb (23). ) dan SaDsbA bukan (24). DsbL telah terbukti mengem motilitas kedsbA E. colidalam uji komplemen DsbA, tetapi analisis biokimia men tidak menunjukkan aktivitas seperti DsbA dalam tes oksidoreduktase standar, sep RNase dan pengurangan insulin (25 ).

Struktur dari Kompleks DsbA-Peptide

tidak secara detail menunjukkan struktur kompleks DsbA. butoxycarbonyl) -D (t-butoxy) -RESIN dilakukan pada Rink Herein kami melaporkan struktur DsbA-peptidekovalen Resindalam kondisi sintesis peptida fase padat standar. kompleks disempurnakan menjadi resolusi 1,9 Å. Hal ini sebelumnya telah Pembelahan dan deproteksi dilakukan dengan menggunakan 95% trifluoro- menemukan bahwa mengurangi peptida dan protein dioksidasi den asam asetat dari mana peptida itu pulih menggunakan kinetika mirip stand (32-34), menunjukkan bahwa peptida yangcocok ardurutan presipitasi eter, pelarutan dalam model air 50% dari protein tereduksi yang berkurang yang merupakan substrat asetonitril, dan pengeringan beku. Produk menjadi sasaran DsbA. Struktur kami mengungkapkan bahwa peptida berikatan denganDsbA pemurnian HPLC semipreparatif, memungkinkan isolasi pada permukaan yang dibentuk oleh residu pada antarmuka antara peptida dengan kemurnian tinggi (m/z 1604,5 MH). Kinetika domain -helikal dan TRX dan tidak dalamhidrofobik oksidasidari peptida SigA oleh EcDsbA ditentukan dalam alur yang merupakan situs pengikatan untuk DsbB. Tes fenotipik adalah salin fosfat-buffered (pH 7,2), menggunakan Foto Terapan- dilakukan dengan menggunakan protein chimeric yang mengandung -domain fisika SF.18MV alat penghenti aliran, termostat pada Neisserial enzimDsbA yang dicangkokkan ke dalam domain TRX 30 ° C. Oksidasi peptida diikuti oleh pemantauan EcDsbA yang memperkenalkan mutasi pada antarmuka domain dan perubahan fluoresensi intrinsik EcDsbA setelah reduksi pada cis-loopproline yang membentuk situs pengikatan peptida sambil mempertahanka

yang merupakan tempat pengikatan DsbB.

26 JUNI 2009 • VOLUME 284 • NOMOR 26 JURNAL KIMIA BIOLOGI 17837 panjang gelombang campuran mengandung 320 nm (EcDb

nm). di mana Oksidasi, reaksi SigA pep-ini mengungkapkan bahwa chimeras fungsi ditambahkan pada rentang konsentrasi (1-25 M). Enzim tase tetapi bahwa fenotipe yang diamati dalam pengujian tingkat awal reaksi oksidasi ditentukan dari dimodulasi oleh perubahan pada situs pengikatan peptida yang mengidentifikasi bagian linear dari data fluoresensi, dan ini digunakan dalam struktur kompleks kami. . Secara bersama-sama, ini untuk menentukan konstanta laju orde kedua yang jelas untuk data menunjukkan bahwa antarmuka terbentuk antara TRX dan reaksi seperti yang dijelaskan sebelumnya (34). - domain DsbA adalah penentu penting dari Sintesis Peptida - Sintesisspesifisitas asetilasi N-terminal pada reaksi antara DsbA teroksidasi dan suburutannya dari SigA, Ac-PIPFL-Hse (Trt) -Q (Trt) -K (t-membuat dan bahwa aktivitas DsbA dapat dimodulasi melalui modtoxycarbonyl) -D (t-butoxy) -RESIN, dilakukan pada Rink ifications dengan sifat permukaan ini dan perubahan cisResin di bawah fase solid standar kondisi sintesis peptida. loop prolin. Peptida dibelah dan dideproteksi dengan 95% trifluoro-

PROSEDUR EKSPERIMENTAL asam asetat pulih seperti dijelaskan di atas dan dimurnikan menggunakan HPLC semipreparatif, menghasilkan peptida dalam kemurnian ti dan Pemurnian Protein 1100 MH). Strategi untuk pembentukan teknik-teknik biologi kovalen digunakan secara menyeluruh. Penyandian gen diikuti sebagian besar metode yang dijelaskan oleh Couprie ing EcDsbA diklon ke vektor ekspresi pTrc99A et al. (37) Untuk sintesis bromopeptida, homoserine (35), yang digunakan untuk mengubah E. coliBL21 DE3 Urutan Codon Plus dirakit pada resin seperti di atas, sel-sel pelindung trityl (Stratagene). Kultur bakteri ditumbuhkan pada suhu 37 ° C sampai kelompok dihapus oleh lima siklus pengobatan dengan 1: 5: 94 Ation 600 dari mencapai isopropil 0.6, 1-thio- ketika ekspresi -D-galactopyrano dengan mM),dan tambahkan asam trifluoroacetic / triisopropylsilane / dichloromethane, dan alkohol yang terpapar brominasi oleh kultur perlakuan yang diperluas ditanam lebih lanjut. Ekstrak periplasmik diperoleh dengan resuspending pelet sel dalam 20 m M Tris, pH 8,0, dengan pembelahan akhir CBr4/ Ph3dan P dalam deproteksi tetrahydrofuran. dilakukan Setelah ekstensif menggunakan pencucian, 95% mengandung polimiksin B sulfat asam fluoroasetat. Produk brominasi efisien 2 jam pada 4 ° C. DsbA dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya, dikurangi diperoleh kembali setelah pembelahan asam trifluoroasetat oleh eter precipita- dengan Tris (2-carboxyethyl) phosphine-HCl pada rasio molar 1 tion, pelarutan dalam 50% larutan asetonitril, dan pengeringan beku. buffer-ditukar menjadi 10 mM HEPES (pH 7,8), 0,1 mM EDTA, Produk ini stabil untuk pemurnian HPLC semipreparatif, dan dipekatkan hingga 20 mg ml 1 untuk kristalisasi. Secara seragam memungkinkan isolasi peptida dalam kemurnian tinggi (m/z 1162 15N dan 13C /15N protein berlabel isotop diproduksi sesuai

MH) dan hasil yang baik (20 mg). Metode yang mengandung homoserine dengan metode Marleyet al. (36) dan dimurnikan seperti dijelaskan peptida (m/z 1100 MH) adalah komponen minor dari atas. Sampel untuk NMR mengandung 13C /15EcDsbAN yang seragam reaksi pembelahan. Bromopeptida ditemukan stabil (300 M dalam 20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 10% Homogenitas protein yang dimu DSDS- 2O). untuk penyimpanan dan tidak mudah terhidrolisis di bawah kondisi berair dari pembentukan kompleks dengan protein. PAGE (pewarnaan massa ion Kristalisasi — Kristaldari EcDsbA tereduksi ditanam pada spektrometri pada kromatografi cair Platform Micromass II Platform II dengan menggunakan teknik drop drop. Kristal tumbuh dalam sistem spektrometri massa 3 phy / quadrupole (Manchester, Inggris). hari dari volume yang sama dari larutan protein dan reservoir. Konsentrasi protein ditentukan oleh spektroskopi UV-terlihat yang mengandung 0,2 M ammonium asetat, 20% (b / v) polometri fotometri menggunakan koefisien pemusnahan molar pada 280 nm etilena glikol 4000, dan 0,1 M natrium sitrat (pH 5,8). Menangis- 23.045 cm 1 M 1. tals direndam semalam pada suhu 4 ° C dalam larutan yang mengandung 0,2 M Kinetika Oksidasi Disulfida-Disulfida oksidase aktivitas ammonium asetat, 28% (b / v) polietilena glikol 4000, 10% diukur dengan mengikuti perubahan dalam fluoresinsinsinsik(v / v) gliserol, dan 0,1 M natrium sitrat (pH 5,8) ditambahkan cens EcDsbA pada oksidasi peptida yang berasal dari dengan 3,5 mM bromopeptide, 3,5 mM Tris (2-carboxyethyl) fase-urutan dewasa S. flexneri autotransporter protein phine-HCl, dan 0,1 mMEDTA. Kristal yang direndam kemudian dipindahkan ke SigA. Sintesis dari sekuens N-terminal asetilasi, AcGfered menjadi larutan krioprotektan yang mengandung 0,2 M ammo- N (Trt) -N (Trt) -N (Trt) -C (Trt) -PIPFLC (Trt) -Q ( Trt) -K (tnium asetat, 28% (b / v) polietilen glikol 4000, 10% (v / v)

StrukturKompleks DsbA-Peptida

gliserol, dan 0,1 M natrium sitrat (pH 5,8) dan flash-beku — Tes PhenotypicTesaktivitas oksidoreduktase dilakukan sebelum pengumpulan data, dilakukan untuk setiap konstruk ekspresi dengan menguji DTT Structure Determination and Refinement—Data merupakan kolektivitas dari sel yang ditransformasi (43). Bakteri ditumbuhkan dalam LB yang terlindungi pada Advanced Photo Source. (Argonne National Laboto midlog fase ketika kepadatan sel ditentukan spektrologi , Argonne, IL) pada beamline IMCA-CAT-17-ID-B pada 100 fotometrik, dan kultur distandarisasi menjadi con- K dan diproses dan diskalakan menggunakan HKL suite. Sentrasi 2 108 sel / ml. Pengenceran serial 10 kali lipat adalah kristal milik kelompok ruang angkasa konsisten dengan 4 17838 JURNAL KIM VOLUME 284 • NOMOR 26 • 26 JUNI 2009

P2molekul / asimetris 12121, dan unit sel unit dimen- (lihat disiapkan, dan alikuot (5 l) dari setiap konsentrasi disimpan) ke piring LB-agar dengan dan tanpa DTT (15 mM). Tabel 1). Struktur Dsb

Setelah pengeringan, pelat diinkubasi pada 37 ° C selama 18 jam. air pasang ditentukan dengan penggantian molekuler menggunakansebelumn uji Motilitasdilakukan pada dasarnya seperti yang dijelaskan (44) struktur ditentukan dari DsbA tereduksi (Data Protein pada LB-agar lunak (0,4%). Bakteri ditanam dalam LB ke midlog Kode aksesi bank 1a2l ) sebagai model pencarian. Model adalah fase ketika kepadatan sel ditentukan spektrofotometri yang dibangun secara manual menggunakan program O dan disempurnakan menjadi 1,9 metrik, dan kultur distandarisasi menjadi konsentrasi menggunakan suite program CCP4 (38). Masing-masing empat dari 2 108 sel / ml. Sampel (5 l) adalahdrop-inokulasi molekul DsbAyang dibuat secara independen, dan tidak ada NCS pada agar lunak dan diinkubasi pada suhu 37 ° C semalaman untuk memungkinkan pengekangan digunakan selama penyempurnaan. Kualitas mengerumuni. model Pada akhirnya ditentukan model 93,6% oleh pemantauan residu adalahRditemukan bekerjadanRdalam membebaskannilai Conscore— Skema konservasi sederhana (45) digunakan untuk menghitung konservasi asam amino diDsbA yang dikonfirmasi daerah yang Ramachandran, dengan . Substrat yang digunakan dalam analisis ini terdaftar di kenyal 6,4%di wilayah yang diizinkan. Statistik untuk struktur akhir adalah mental Tabel. Lima residu di kedua sisi residu sistein dirangkum dalam Tabel 1. di substrat diketahui EcDsbA diselidiki.Konservatif — Spektroskopi NMRNMREksperimenyang dilakukan pada substitusi didefinisikan sebagai milik salah satu dariberikut yang spektrometer 600-MHz Varian Unitydilengkapi dengantunggal tujuh kelompok: 1) hidrofobik (alanin, valin, leusin, dan gradien sumbu tiga sumbu) resonansi cryoprobe. Standard triple resococusin ), 2) hidrofobik aromatik (triptofan, tirosin, dan eksperimen nance digunakan untuk mengkonfirmasidipublikasikan fenilalanin yang), 3)dasar (arginin, histidin, dan lisin), 4) tugaspenugasan untuk EcDsbA (16) ). Data diproses menggunakan asam (asam glutamat dan asam aspartat), 5) netral polar (serin, NMRPipe (39) dan dianalisis menggunakan program SPARKY. Metionin, treonin, sistein, asparagin, dan glutamin), 6) Bahan kimia rata-rata tertimbang secara keseluruhan perubahan pergeseran (rata-rata) a glisin, dan 7) prolin. 45 sekuens yang mengandung sistein dari dihitung untuk semua residu, menggunakan persamaan (40), protein yang telah terbukti menjadi substrat EcDsbA dianalisis untuk menentukan tingkat konservasi dalam residu rata-rata H 2 0,154

N

mengelilingi sistein. di mana proton dan Hdan nitrogen Nmenunjukkan resonansi, perubahan masing-masing, dalam kimia pada shift untuk tambahan amida.

HASIL Disulfide Oxidase Activity—Disulfide oxidase activity adalah reaksi dari peptida yang mengandung homoserine (Ac-PIPFLditentukan secara in vitro dengan mengukur laju oksidasi Hse-QKD-NH untuk apo- dan 2) (1 peptida-kompleks mM). Ditugaskan EcDsbA 1H resonansi dalam model substrat peptida. Domain sekresi S. flexneri protein autotransporterSigA mengandung sepasangsistein tunggal. suplemen Ta m residu(569CPIPFLC575), yang dioksidasi untuk membentuk disul-perubahan dalam pergeseran kimia telah dipetakan pada kristal. fide dalam protein matang. Urutan di sekitar dua sistem kompleks untuk mengidentifikasi lokasi pengikatan peptida. teines digunakan sebagai (model substrat peptida model Ac-NNNCPIPFLCQKD-NHa. Oksidasi 2) disintesis dan dari peptida dengan K DsbAC dsbA EcDsbA (yang identik dengan urutan S. flexneriDsbA) adalah gen yang dibuat mengandung domain EcDsbA TRX dipantau oleh fluoresensi yang terhenti. Dalam perjalanan dan -domain NmDsbA1 atau NmDsbA2. Ini dicapai uji, oksidasi dari substrat peptida menghasilkan bersamaan melalui tiga cara sambungan tumpang tindih PCR ekstensi (41). Setiap pengurangan enzim DsbA. Fluoresensi intrinsik domain itu diamplifikasi pada putaran pertama PCR dengan bentuk utama berkurangnya EcDsbA secara signifikan lebih tinggi daripada yang memiliki 6-bp overhang dari urutan yang saling melengkapi EcDsbA teroksidasi (46), yang memungkinkan kemajuan dari fragmen yang berdekatan dengan tempat anneal.putaran kedua yang

Reaksiharus diikuti dengan memantau peningkatan fluores- PCR memungkinkan tumpang tindih 12-bp menjadi anil untuk membentuk chesi (Gbr. 2). Analisis laju awal menunjukkan bahwameric templatdsbA genyang kemudian diamplifikasi.ekspresi Reaksiadalah urutan pertama sehubungan dengan peptida dan EcDsbA dan plasmid dibangun oleh kloning gen yang sesuai ke dilanjutkan dengan konstan tingkat urutan kedua dari k 1,4 106 ekspresi plasmid pTrc99A (35). M 1 s 1. Hal ini mirip dengan konstanta laju turunan yang memiliki Komplementasi dari dsbA E. coli-The E. coli strain JCB telah dilaporkan sebelumnya untuk reaksi enzim DsbA yang baik yang disediakan oleh JC Bardwell (Harvard Medical dengan peptida dan protein substrat (32-34 ) dan menunjukkan bahwa School) (10), dan transformasi dari E. coli strainJCB571 adalah peptida SigA secara efisien dioksidasi oleh EcDsbA. dilakukan secara kimia (42). Transforman dipilih padaLB Penentuan StrukturKompleks DsbA-Peptida—Dalam agar yang mengandung antibiotik yang sesuai dan dikonfirmasikan oleh kolega untuk mengkarakterisasi pengikatan substrat ke DsbA, PCR kristal yang digunakan. struktur kompleks kovalen antara DsbA dan SigA

. Struktur kompleks DsbA-Peptida.

GAMBAR 3. Analisis kristal DsbA-peptida. a, analisis oleh SDS-PAGE (lane ii) mengungkapkan bahwa sekitar setengah dari EcDsbA dalam krist kompleks kovalen dengan peptida. Kompleks peptida-DsbA (jalur iii) jelas diselesaikan dari EcDsbA gratis (jalur iv) di bawah kondisi yang digunakan

gel. (Penanda berat molekul ditunjukkan pada jalur i.) B, pita diagram EcDsbA (Protein Data Bank, kode 3DKS, rantai C). Masing-masing dari empat m

asimetris mengadopsi lipatan DsbA khas yang terdiri dari thioredoxin (biru) dan -helikal (magentadomain) dan titik penyisipan (oranye). Atom belerang situs aktif ditunjukkan dalam representasi CPK kuning. TABEL 1 Pengumpulan data dan statistik perbaikan Nilai dalam tanda kurung adalah untuk shell resolusi tertinggi.

Kompleks DsbA-peptida Pengumpulan data Grup ruang Dimensi sel GAMBAR 2. Oksidasi peptida SigA oleh DsbA. Aktivitas oksidase ditentukan dengan memant

SigA peptida. Kinetika reaksi oksidasi ditentukan dengan menggunakan fluoresensi berhenti-aliran dengan memantau peningkatan fluoresensi sete

EcDsbA (1 M) dalam pengujian. Kurva progres untuk oksidasi substrat peptida ditunjukkan pada peningkatan konsentrasi peptida (0, 2, 5, dan 10 M). Laj dengan meningkatnya konsentrasi peptida.

peptida ditentukan. Kompleks kovalen distabilkan dengan mengganti disulfida antarmolekul dengan ikatan tioeter isosterik yang lebih stabil (3

mencegah pelepasan produk. Untuk P212121 membentuk kompleks, peptida sembilan residu yang meliputi SigA a, b, c (Å) 85,4, 87,9, 112,6 residu P

Asp578disintesis dengan residu homoserine (Hse) di tempat sistein asli (Ac-P1IPFL-Hse- QKD dengan 9brom -NH2). Untuk hidroksil dari hom menghasilkan analog homobromasalahine,,,

30 (derajat) Resolusi (Å) RI/ gabung (I) Kelengkapan (%) Redundansi 90.0, 90.0, 90.0 1.9 0.109 (0.793) 22.1 (2.5) 99.8 (99.7) ) 7.1 (6.6) yang direaksikan dengan Cys d

membentukkovalen Perbaikan kompleksantara peptida dan EcDsbA. Ikatan isioeter terik lebih stabil daripada disulfida yang sesuai, dan karen terkait dengan isioeter pada dasarnya terikat secara ireversibel ke EcDsbA. Peptida disintesis dengan terminal N asetat dan terminal C tengah pengenalan muatan pada termini peptida, yang tidak akan ada dalam

Resolusi(Å) yang . Jumlah pantulan RNo. kerjadari /Ratom bebas Protein Ligand / ion Air B-faktor Protein Ligand / ion 1.9 66227 21 24,48 37,41 protein. Kristal dengan kualitas difraksi kompleks terbentuk dengan merendam homobromasalahine-SigA-peptida ke dalampraair penyimpanganrms panjang(Å) 28,84 0,009 ikatanmembentuk

kristal pengurangan EcDsbA. Analisis kristal dengan sudut Bond (derajat) 1,02 SDS-PAGE mengungkapkan bahwa peptida telah membentuk kompleks dengan 50% DsbA dalam kristal, sebagaimana d intensitas masing-masing band pada gel SDS-poliakrilamida (Gbr. 3a)struktur kompleks diselesaikan dengan molekul pengganti Rbebas Keteran (Tabel halus struktur-Setiap 1). hingga resolusi 1,9 empat Å (REcDsbA bekerja 21,7%, molekul dalam unit asimetris mengadopsi lipatan DsbA yang khas (Gbr. diposisikan ujung aktif situs helix C301 PHCwithin 33mengurutkan TRX domain EcDsbA dari protein. Domain TRX berisi domain yang disisi dihubungkan melalui loop antara untai 3 dari domain TRX dan helix 2 di domain heliks (sisa 62-66 ) dan melalui loop pada akhir helix panj 144) (14). Empat molekul EcDsbA dalam unit asimetris sangat mirip 26 JUNI 2009 • VOLUME 284 • JUMLAH 26 JURNAL DARI KIMIA BIOLOGI 17839

ditumpangkan di atas atom backbone untuk residu 2–184 dengan deviasi akar rata-rata kuadrat (rms) 0,5 Å. Mereka juga mirip dengan stru yang dilaporkan sebelumnya (Protein Data Bank kode 1A2L) dan teroksidasi (kode Bank Data Protein) 1FVK) EcDsbA dan menempa backbone untuk residu 2–184 dengan deviasi rms keseluruhan 0,5 Å. Dari empat molekul EcDsbA dalam unit asimetris, dua (rantai C dan terkait dengan peptida SigA (rantai E dan F, masing-masing), sedangkan dua molekul DsbA lainnya (rantai A dan B) hadir di bentuk b Kompleks kovalen dibentuk melalui ikatan thioether antara C dalam homoserine dari peptida SigA dan S dalam Cys 30 dari EcDsbA.

mengungkapkan bahwa pengikatan peptida ke molekul EcDsbA pertama memblokir situs pengikatan yang setara pada EcDsbA yang berdek jawab atas pengamat-

Struktur kompleks DsbA-Peptida GAMBAR 4. Situs pengikat substrat DsbA. a, comparison of the peptide conformation in the two models of the EcDsbA-peptide complex (Protein Data Bank chains E and F are shown in orange and green stick representation, respectively, and the residues are labeled in orange. The EcDsbA molecule

covalently attached (chain C) is shown in a schematic diagram. b, omit (2Fwith o the Fcpeptide ) electron are density shown map in a blue (contoured stick re

) for the peptide (chain E). EcDsbA residues in contact c, polar interactions observed in the complex are shown as black dotted lines between the intera atoms are shown as red spheres. The EcDsbA-peptide complex (chains C and E) is shown in the same orientation as above, and EcDsbA residues

the peptide forms an antiparallel interaction with residues in the cis-proline loop of EcDsbA. Polar interactions are shown as black dotted lines betwe

orange) and EcDsbA (in blue).

vation that only half of the EcDsbA molecules in the crystal were present as a complex. The peptides in each of the two EcDsbA-peptide com similar and had an rms deviation of 0.21 Å over eight C atoms (Fig. 4a). The side chains of the glutamine at position 7 and lysine at positio both peptide complexes, as determined by the lack The of aspartate prominent at position electron 9 density was disordered in the 2Fo and F (Fig. 4b). DsbA-Peptide Interaction—Analysis of the structure of the covalent EcDsbA-SigA-peptide complex revealed that the pep- tide was bound at TRX and -helical domains of DsbA, with contacts being made to both domains. Details of the DsbA-peptide complex are presented in Fig. 4. T thioether bond displayed an architecture similar to that of a right-handed disulfide bond (47) with dihe- dral angles C and Hse147°/154° -C Hs the by C30C -C two C30Hseintermolecular -C -C C30Hse-S -C C30Hse-C of complexes Hse76°/81°, , C C of the asymmetric unit, respectively. This is a conformation similar to

17840 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 284 • NUMBER 26 •JUNE 26, 2009

that of the mixed disulfide that is observed in a TRX-substrate com- plex (48), indicating that the thioether provides a suitable isos- teric r disulfide. In addition to the covalent link- age between the peptide and EcDsbA, substrate binding was sta- bilized by hydrogen bonding and van der (Fig. 4, c and d), and the binding interface was almost identical in each com- plex. Hse6 and Lys8 from SigA formed hydrogen bonds with V the cis-proline loop of EcDsbA, respectively, such that the loop and substrate peptide were arranged in an antiparallel fashion, and a water-m bond was formed between the amide proton of Hse6 and the car- bonyl oxygen of Val150 (Fig. 4d). In addition to the hydrogen-bonding in EcDsbA packed against Ile2 of the peptide, whereas Pro31, His32, and Gln35 of DsbA made contacts to Phe4 of SigA. Hse6 of the peptide contact and Gln7 and Lys8 made contacts with Phe63, Arg148, and Gly149. The binding interface in the DsbA-peptide complex has a total buried surfa 795 Å2in the two structures, respec- tively, and a surface complementarity of 74% as calculated in CCP4 (49). There were very slight differen interactions in the two DsbA-substrate complexes present in the asymmetric unit of the unit cell as a result of small changes in the orientatio of Ile2 and the mobility of Lys8 (Fig. 4a). In addition, there were slight differences in the side chain orientations of Phe29 and Met64 in th EcDsbA that were covalently attached to the peptide. Notwithstanding these small differences, the 10 residues of EcDsbA that contac complex could be superimposed over their C atoms with an rms devia- tion of 0.12 Å, and the H-bonding interactions were conserved in t indicating that the mode of interaction is sim- ilar. In both cases, residues around the active site (29FCPH32) together with those in the loop co and -helical domains (Phe63and Met64) and residues in the loop preceding the cis-Pro151(Arg148,Gly149,andVal150)formed 95%ofthebin Characterization of DsbA-Peptide Binding—Given that only two of the EcDsbA molecules out of the four present in the asymmetric unit wer the peptide, there was concern that the mode of peptide binding was a crystallo- graphic artifact. In order to address this concern, the binding

The Structure of a DsbA-Peptide Complex

FIGURE 5.Analysis of EcDsbA-SigA peptide interaction by NMR spectroscopy.a, EcDsbA residues for which chemical shift perturbations are observed u

the peptide are colored in magenta on the crystal structure of the EcDsbA-peptide complex (Protein Data Bank code 3DKS, chain C; the peptide 3DKS, ch

stick format). His32, which is not observed in either HSQC spectrum is colored in cyan. A continuous surface is formed by residues that form the EcDsb the crystal. b,

15

N HSQC spectrum of EcDsbA in the absence (magenta) and presence (cyan) of SigA peptide. The expansion demon- strates p

observed for some residues (eg Phe29 and Cys33), whereas other residues (eg Gly6 and Asp86) are unaffected.

FIGURE 6. Comparison of the complexes of substrate-DsbA and DsbB-DsbA (Protein Data Bank code 2HI7). a, surface view of the interaction bet

SigA peptide. The surface of EcDsbA is shown with the SigA peptide in an orange stick representation. The position of His32 on the surfac

magenta. b, structure of the DsbA-DsbB complex. The surface of EcDsbA is shown with the bound Cys 104 loop in a green stick representation, and the

highlighted. c, superposition of the two complexes reveals that His32 in the complex with SigA peptide (magenta) adopts a different rotameric state compared in the complex with DsbB.

location of the SigA peptide was determined by measuring chemical shift perturbations in 1H-15N HSQC NMR experi- ments on uniformly 15 in the absence and presence of the peptide (Fig. 5). The chemical shifts of reso- nances in HSQC spectra are exquisitely sensitive to changes i of the amide groups, and measurement of chemical shift perturbation is widely used as a means to identify the location of ligand binding. A homo- serine in place of cysteine was employed to prevent formation of a covalent complex and to allow identification of residues whos perturbed in the context of a noncova- lent complex between the peptide and EcDsbA. Analysis of the spectra revealed that many of th perturba- tions were observed for residues that formed a continuous sur- face at the interface between the -helical and TRX domains (Fig. 5a the perturbed chemical shifts in the NMR spectra was consistent with the mode of binding observed in the x-ray structure and suggests represents a relevant model of the biological complex. In contrast, many of JUNE 26, 2009•VOLUME 284 • NUMBER 26 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 17841

the residues in the hydrophobic groove that is the binding site for the periplasmic loop of DsbB were observed in the 15N HSQC spec- trum of not signif- icantly perturbed upon the addition of the peptide. This suggests that the SigA peptide binds in a location that is distinct fro observed in the crystal structure of the DsbA-DsbB complex (21). An interesting feature of NMR data was that no peak was observed spectrum for His32 either in the presence or absence of peptide, which is consistent with this re- sidue undergoing conformational exc previously been suggested to be important in substrate recognition and catalysis in DsbA enzymes (50). Comparison of DsbA-Substrate and DsbA-DsbB Complex—Com- parison of our structure with the EcDsbA-EcDsbB complex structur conformation of EcDsbA was similar in both cases (Fig. 6). The two EcDsbA molecules (Protein Data Bank codes 3DKSD and 2HI7A) sup rms deviation of 0.59 Å over 179 C atoms. Both the SigA peptide and the periplasmic loop of EcDsbB interacted with 148RGV150 in the

EcDsbA; how- ever, the side chains of residues 99PFA101 from the DsbB loop were buried in the hydrophobic groove, where they inte

, Gln164, Thr168, Met171, and Phe174 of EcDsbA (Fig. 6b). Thus, although the general mode of interaction with DsbA is maintained, Dsb additional interactions within the hydrophobic groove on the surface of DsbA. These result in the higher buried surface area observed i complex (1340 Å2) (21), which may also account for the greater specificity of the DsbA Despite their general similarity, there were some differences observed between the DsbA molecules in the DsbA-substrate and DsbA-Ds notable difference was the ori- entation of the side chain of His32 (Fig. 6c). In the complex with peptide (Protein Data Bank code 3DKS chain gauche conformation ( 1 82°), where its side chain lay across the face of the hydrophobic groove and blocked access to the peptide substra Pro

163

with DsbB (Protein Data Bank code 2HI7), His32 adopted a trans conformation ( 1 177°), which allowed access to the hydrophobic gro where its side chain made van der Waals interactions with Ala102-Thr103 in the DsbB loop. In the original crystal

The Structure of a DsbA-Peptide Complex

FIGURE 7. Phenotypic analysis of chimeric DsbA. a, primary structure of EcDsbA, NmDsbA1, and NmDsbA2. Residues comprising the thioredoxin dom

underlined. Residues that make contacts to the peptide substrate in the crystal structure of the complex are highlighted (*). b–e, phenotypic assa

(JCB571) complemented with different DsbA proteins. b, JCB571 alone (lane 3), JCB571 complemented with EcDsbA in pTrc99A as a positive

JCB571 complemented with EcTDNmDsbA1 (lane 1) or EcTDNmDsbA2 (lane 2) were able to grow on LB agar without DTT, indicating that each o

viable. c, the same cell lines were tested for growth on LB agar containing 15 mM DTT and 1 mM isopropyl 1-thio- -D-galactopyranoside to induce DsbA expre

cell lines that had been complemented with the DsbA proteins grew, whereas JCB571 did not, indicating that each construct expressed an active DsbA.

(zone 2) nor JCB571 complemented with EcTDNmDsbA1 (zone 3) was motile. In contrast, the positive control (JCB571 complemented with EcD motile. e, both the positive control strain (zone 1) and JCB571 complemented with EcTDNmDsbA2 (zone 3) were motile, whereas JCB571 (zone 2) was not.

TABLE 2 Phenotypic analysis of DsbA chimeras AlldsbAgenes were cloned into the low copy vector pHSG576 and assessed for their ability to restore E. coli dsbA JCB571 resistance to DTT and motility. dsbA DTT resistance Motility JCB570 (wild type) Yes Yes JCB571 (dsbA ) No No JCB571 transformed with EcDsbA Yes Yes EcTDNMDsbA1 Yes No EcTDNMDsbA1 (QLRGV) Yes Yes EcTDNMDsbA2 Yes Yes EcTDNMDsbA1 (QLRGV) Yes Yes

structure of oxidized EcDsbA (14), there were two molecules in the asymmetric unit. These two molecules of oxidized EcDsbA differed in the

His32 side chain (in the struc- ture 160 and of oxidized 72°, respectively). EcDsbA, Protein His32 has Data been Bank shown code to 1F the oxidized form of EcDsbA (50), and it has been suggested previously that movement of this residue may be required to allow substrate a site (50). Functional Analysis of DsbA—To determine the role of the substrate-binding residues of DsbA in defining specificity, we constructed chimeri comprising the TRX domain of EcDsbA and the -domain of either NmDsbA1 or NmDsbA2. These are referred to as EcTDNmDsbA1 and EcT respectively. Alignment of the sequences of EcDsbA, NmDsbA1, and NmDsbA2 (Fig. 7a) revealed that within the chimeric DsbA enzymes, th in EcDsbA is replaced by DGT and SGT in EcTDNmDsbA1 and EcTDNmDsbA2 , respectively. In addition, residues Phe 63-Met64 of EcDsbA WQ and WG in

17842 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 284 • NUMBER 26 •JUNE 26, 2009

EcTDNmDsbA1 and EcTD- NmDsbA2 , respectively. In con- trast, the residues that form the hydrophobic groove in EcDsbA are retained in t In order to test the effect of these mutations, phenotypic analysis was performed using the dsbA E. coli strain JCB571 complement EcTDNmDsbA1 , or EcTDNmDsbA2 . First, the sensi- tivity to DTT of each of the transfor- mants was determined. Strains of dsbA E. coli are sensitive to DTT and are unable to grow on LB agar containing DTT (Fig. 7, b and c). Transformation of JCB571 with either of the ch EcDsbA restored resist- ance to DTT. This suggested that each construct was capable of expressing a functional DsbA enzyme and that the ex able to be reoxidized in the periplasm. DsbA is also required for the cor- rect folding and stability of a com- ponent of the flagellar motor of E. coli(FlgI) (51). In the absence o component of the flagellar motor is not formed, which renders dsbA E. coli, such as JCB571, nonmo- tile. The phenotypic assays revealed tha with either EcDsbA or EcTDNmDsbA2 were motile, whereas those transformed with EcTDNmDsbA1 were not (Fig. 7, d and e). T observations with the intact Neis- serial DsbA enzymes, wherein NmDsbA1 restored motility to dsbA E. coli, whereas NmDsbA2 did not (29 the five residues immediately preceding the cis-proline in EcTDNmDsbA1 (QIDGT) were replaced with the corre- sponding sequence from E the resulting chi- meric protein was capable of both conferring resistance to DTT and restoring motility in JCB571 (Table 2). Similarly residues preceding the cis-proline in EcTDNmDsbA2 (QISGT) with the corresponding sequence from EcDsbA (QLRGV), the resulting ch capable of both conferring resistance to DTT and restoring motility in JCB571. Despite the relatively high conservation within the sequences NmDsbA2, our analysis indicates that changes introduced by constructing the chimeric proteins are sufficient to alter the substrate specifici destroy the oxidoreductase activity of the proteins or, appar- ently their ability to be reoxidized by DsbB. These data suggest that neither th the -domain is solely responsible for conferring substrate specificity and are consist- ent with the structural details, which reveal that bindi surface that encompasses the interface formed between the two domains. Further, they suggest that substrate recognition by oxidized DsbA i respects from the interaction of reduced DsbA with DsbB

The Structure of a DsbA-Peptide Complex

TABLE 3 Sequence conservation in DsbA substrates Forty-five sequences of confirmed substrates of DsbA were compared to assess sequence conservation aroun Analysis of the sequences revealed that there was no conservation beyond the cysteine residue itself, as determined using Conscore. Conservative mutations

Hydrophobic, small (AVLI) 17 9 13 8 13 0 15 15 11 5 7 Hydrophobic, aromatic (FYW) 2 8 3 7 3 0 3 4 4 5 2 Acidic (DE) 6 5 6 5 7 0 5 4 2 7 9 Basic (RHK) 7 4 5 6 1 0 5

(SMTCNQ) 10 15 9 14 18 45 14 9 13 18 15 Glycine 2 3 6 4 2 0 2 1 5 1 2 Proline 1 1 3 1 1 0 1 6 4 1 5 Percentage of conserved mutations 40.5 36.6 36.1 35.0 42.9 100.0 35.7 3

in substrate specificity can be achieved without apparent loss of ences in the manner in which reduced and oxidized EcDsbA recognition of DsbB. bind their respective substrates. Thus, EcDsbB bound within

DISCUSSION the hydrophobic groove of reduced EcDsbA, whereas the SigA peptide substrate did not. Comparison of the primary structure We have resolution of proteins that have been identified as substrate proteins for EcDsbA in complex with a nine-residue peptide derived from EcDsbA (Table 3) reveals that there is no conserved sequence of the autotransporter protein SigA of S. flexneri. This structure revealed that th outside the hydrophobic groove of EcDsbA and contacted residues at the interface between the TRX and -domains. The complex was stabilize hydrogen bonds between substrate and residues in the cis-proline loop of the TRX domain, such that the two peptide chains were arranged in a fashion. The mode of binding observed in the peptide-DsbA complex dis- played some similarity to that of a trapped substrate-thiore- doxin co Data Bank entry 2IWT) (48). In both cases, the complex was stabilized by backbone-to-backbone hydrogen bonds between the substrate and r proline loop of the TRX domain, and the loop and peptide were arranged in an antiparallel fashion. The heavy atoms of the res- idues of the ac (XCXX(C/S)) and the residues in the loop immediately preceding the conserved cis-proline residue for the two complexes (R148GVP in EcDsbA thi- oredoxin) superimposed with an rms deviation value of 0.52 Å. Furthermore, the buried surface areas observed for the DsbA-substrate com 795 Å2) were similar to that in the thioredoxin-substrate complex (760 Å2) (48). The pres- ence of mostly main-chain interactions as well as th

interacting surface in the EcDsbA-SigA complex is consistent with the broad substrate specificity observed with most DsbA enzymes and the of potential DsbA substrates (31). Cal- orimetric studies have previously demonstrated that the interac- tions between DsbA and its substrate p relatively weak (37), which suggested that small changes in the active site of the enzyme may be sufficient to alter substrate specificity. This is previous mutational data, whereby it was demonstrated that a V150G mutation in EcDsbA was defective in complex for- mation with substrate similar mode of binding has JUNE 26, 2009•VOLUME 284 • NUMBER 26 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 17843 hydrophobic residues in the substrate p pre- sumably be required for favorable interaction within the hydro- phobic groove. In fact, for those proteins that have been con- firmed EcDsbA, there is no sequence conservation in the residues flanking the cysteine (Table 3). As a consequence of the different location of binding, the SigA peptide did not contact the conserved cis-Pro151 within the hydrophobic groove been demonstrated that the mutation P151T in EcDsbA results in the accumulation of DsbA-substrate complexes (31) in the periplasm of E. that the P151T mutant is able to both recognize and form a mixed disulfide with a range of substrate proteins, but is defective in the step of th where the complex is resolved with the release of oxidized substrate and reduced DsbA (Fig. 1). The structure and activity of EcDsbA in wh was mutated to alanine has previously been reported (57). The activity of EcDsbA P151A, as determined from its ability to oxidize alkaline pho based assay, was significantly lower than that of wild type EcDsbA. However, EcDsbB-mediated reoxidation of EcDsbAP151A was not tio active In the site structure residues of EcDsbA30CPHCP151A33 , the conforma- was unchanged, whereas the positions of residues in the cis significantly perturbed. These findings suggest that the resi- dues in the loops surrounding the active site may be of greater importance in su and binding by DsbA than the hydrophobic groove that is the bind Structures have recently been reported for SaDsbA (24) and NmDsbA3 (23), both of which are oxidoreductase enzymes that, in contrast to limited substrate reper- toire as well asE. coliDsbL,whichisthoughttohavespecificityfor now been observed for a number of TRX the enzyme arylsulfate sulfotransferase (25). Comparison of each enzymes,includingthioredoxin(48,52,53),glutaredoxin(54),gluof these structures with that of EcDsbA reveals significant differ- tathione transferase (55) as well as the mixed disulfide complex of ences around the regions identified as the peptide binding surface DsbC-DsbD (56). This mode of interaction is emerging as a genin the current study. Notably, SaDsbA and NmDsbA3 have a sim- eral feature of substrate recognition in TRX domain-substrate ilar TcP sequence in the cis-proline loop. In the case of SaDsbA, complexes (48). mutation of this sequence to VcP, which is more common in However, comparison of the current structure and that of the Gram-negative DsbA enzymes, enhanced the oxidoreductase EcDsbA-EcDsbB complex, suggests that there are subtle differactivity as measured in an insulin reduction assay (24). Thus, it

The Structure of a DsbA-Peptide Complex

appearsthatthesequenceofthecis-prolineloopmaybeimportant in dictating the substrate binding of DsbA, as has previously been demonstrate domain proteins (27, 28). Although DsbL retains the VcP sequence in the cis-proline loop, it lacks the hydrophobic surface features that surro in EcDsbA and VcDsbA, which supports the notion that these are important for substrate binding and specificity. Although the structures of EcDsbA are very similar through- out the catalytic cycle, differences have been observed in the relative orientation helical domains in several structures of DsbA (17, 18). These are present both for different DsbA molecules in the same crystal structu structures solved by different groups, and between the different forms of DsbA. This has led to the suggestion that dynamics may play a ro activity of DsbA (20). Analysis of the dynamics in reduced and oxidized forms of VcDsbA has revealed the presence of interdomain motio form of the protein (18), which result in an opening of the hydrophobic groove. Redox-dependent conformational changes have previ- ously to result in the opening of a cavity in the TRX domain-containing protein ResA (58), which contributes to substrate specificity. In the conformations of the different redox states are similar, but changes in the dynamics appear to allow the reduced form of DsbA to ac conformation, which may facilitate the interaction with the DsbB loop and enable the formation of a mixed disulfide between Cys104 of EcD EcDsbA. The structure of the EcDsbA-peptide complex presented herein provides an insight into the specificity observed within the catalytic cycle conjunction with the description of the structure of a EcDsbA-EcDsbB complex (21) and differences in the dynamics of the different r VcDsbA enzyme (18), a clearer picture is beginning to emerge of the factors regulating the catalytic cycle of DsbA. Thus, oxidized DsbA substrates through a mechanism that is common to many TRX family oxidoreduc- tases via the formation of backbone hydrogen bonds to a prior to the conserved cis-proline residue of the TRX fold. Subtle changes in the composition of this loop and the residues that surround it a substrate spec- ificity. The relatively higher specificity of reduced DsbA for DsbB results from additional interactions of DsbB within the hy on the surface of DsbA, which may become more accessible as a result of interdomain motions that are present in the reduced DsbA.

Acknowledgments—We greatly appreciate the gift of strains JCB570 and JCB571 from Professor James Bardwell (University of Michigan, Ann Ar the BIOCARS staff at the Advanced Pho- ton Source for assistance with data collection. NMR data were ana- lyzed using the program SPARKY.6 REFERENCES 1. Collet, JF, and Bardwell, JC (2002) Mol. Mikrobiol. 44, 1–8 2. Bardwell, JC, Lee, JO, Jander, G., Martin, N., Belin, D., and Beckwith, J.

17844 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 284 • NUMBER 26 •JUNE 26, 2009

(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1038–1042 3. Heras, B., Shouldice, SR, Totsika, M., Scanlon, MJ, Schembri, MA, and Martin, JL (2009) Nat. Rev. Microbiol. 7, 215–225 4. Ha, UH, Wang, Y., and Jin, S. (2003) Infect. Immun. 71, 1590–1595 5. Dacheux, D., Epaulard, O., de Groot, A., Guery, B I., Polack, B., and Toussaint, B. (2002) Infect. Immun. 70, 3973–3977 6. Watarai, M., Tobe, T., Yoshikawa, M., and Sasakawa, C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4927–4931 7. Miki, T., Okada, N., and Danbara, H. (2004) J. Biol. Chem 279, 34631–34642 8. Jackson, MW, and Plano, GV (1999) J. Bacteriol. 181, 5126–5130 9. Peek, JA, and Taylor, RK (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6210–6214 10. Bardwell, JC, McGovern, K., and Beckwith, J. (1991) Cell 67, 581–589 11. Missiakas, D., Georgopoulos, C., and Raina, S. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7084–7088 12. Stafford, SJ, Humphreys, DP, and Lund, PA (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 179–184 13. Yu, J. (1998) Infect. Immun. 66, 3909–3917 14. Martin, JL, Bardwell, JC, and Kuriyan, J. (1993) Nature 365, 464–468 15. Hu, SH, Peek, JA, Rattigan, E., T JL (1997) J. Mol. Biol. 268, 137–146 16. Schirra, HJ, Renner, C., Czisch, M., Huber-Wunderlich, M., Holak, TA, and Glockshuber, R. (1998) Biochemistry 37, 6263–6276 17. Guddat, LW, Bardwell, JC, and Martin, JL (1998) Structure 6, 757–767 18. Horne, J., d'Auvergne, EJ, Coles, M., Velk Charman, WN, Prankerd, R., Gooley, PR, and Scanlon, MJ (2007) J. Mol. Biol. 371, 703–716 19. Martin, JL (1995) Structure 3, 245–250 20. Guddat, LW, Bardwell, JC, Zander, T (1997) Protein Sci. 6, 1148–1156 21. Inaba, K., Murakami, S., Suzuki, M., Nakagawa, A., Yamashita, E., Okada, K., and Ito, K. (2006) Cell 127, 789–801 22. Dutton, RJ, Boyd, D., Berkmen, M., and Beckwith, J. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 11933–11938 23. Vivian, JP, Scoullar, J., Robertson, AL, Bottomley, SP, Horne, J., Chin, Y., Wielens, J., Thompson, PE, Velkov, T., Piek, S., Byres, E., Bedd Kahler, CM, Rossjohn, J., and Scanlon, MJ (2008) J. Biol. Chem 283, 32452–32461 24. Heras, B., Kurz, M., Jarrott, R., Shouldice, SR, Frei, P., Robin, G., Cemazar, M., Tho n̈ y-M R., and Martin, JL (2008) J. Biol. Chem 283, 4261–4271 25. Grimshaw, JP, Stirnimann, CU, Brozzo, MS, Malojcic, G., Gru ẗ ter, MG, Capitani, G., and Glockshuber, R. (2008) J. M 26. Dumoulin, A., Grauschopf, U., Bischoff, M., Tho n̈ y-Meyer, L., and BergerBächi, B. (2005) Arch. Mikrobiol. 184, 117–128 27. Hiniker, A., Ren, G., Heras, B., Zheng, Y., Laurinec, S., Jobson, RW, Stuckey, JA, Martin, JL, and Bardwell, JC (2007) Proc. N 104, 11670–11675 28. Ren, G., Stephan, D., Xu, Z., Zheng, Y., Tang, D., Harrison, RS, Kurz, M., Jarrott, R., Shouldice, SR, Hiniker, A., Martin, JL, Heras, B., and Bard- well, JC ( 284, 10150–10159 29. Sinha, S., Langford, PR, and Kroll, JS (2004) Microbiology 150, 2993–3000 30. Tinsley, CR, Voulhoux, R., Beretti, JL, Tommassen, J., and Nassif, X. (2004) J. Biol. Chem 279, 27078–27087 31. Kadokura, H., Tian, H., Zander, T., Bardwell, JC, and Beckwith, J. (2004) Science 303, 534–537 32. Darby, NJ, and Creighton, TE (1995) Biochemistry 34, 3576–3587 33. Ruddock, LW, Hirst, TR, and Freedman, RB (1996) Biochem. J. 315, 1001–1005 34. Sko ́rko-Glonek, J., Sobiecka-Szkatuła, A., and Lipin s̃ ka, B. (2006) Acta Biochim. Pol. 53, 585–589 35. Amann, E., Ochs, B., and Abel, KJ (1988) Gene 69, 301–315 36. Marley, J., Lu, M., and Bracken, C. (2001) J. Biomol. NMR 20, 71–75 37. Coupri C., Quéméneur, E., and Moutiez, M. (2000) 6 TD Goddard and DG Knel Biochemistry 39, 6732–6742

The Structure of a DsbA-Peptide Complex 38. Collaborative Crystallography Project 4 (1994) Acta Crystallogr. Sekte. D 49. Lawrence, MC, and Colman, PM (1993) J. Mol. Biol. 234, 946–950 50, 760–763 50. Guddat, LW, Bardwell, JC, Glockshuber, R., Huber-Wunderlich, M., 39. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, GW, Zhu, G., Pfeifer, J., and Bax, A. Zander, T., and Martin, JL (1997) Protein Sci. 6, 1893–1900 (1995) J. Biomol. NMR 6, 277–293 51. Hizukuri, Y., Yakushi, T., Kawagishi, I., and Homma, M. (2006)J. Bacteriol. 40. Ayed, A., Mulder, FA, Yi, GS, Lu, Y., Kay, LE, and Arrowsmith, CH 188, 4190–4197 (2001) Nat. Struct. Biol. 8, 756–760 52. Qin, J., Clore, GM, Kennedy, WM, Huth, JR, and Gronenborn, AM 41. Warrens, AN, Jones, MD, and Lechler, RI (1997) Gene 186, 29–35 (1995) Structure 3, 289–297 42. Chung, CT, and Miller, RH (1988) Nucleic Acids Res. 16, 3580 53. Qin, J., Clore, GM, Kennedy, WP, Kuszewski, J., and Gronenborn, 43. Sardesai, AA, Genevaux, P., Schwager, F., Ang, D., and Georgopoulos, C. AM (1996) Structure 4, 613–620 (2003) EMBO J. 22, 1461–1466 54. Nordstrand, K., Åslund, F., Holmgren, A., Otting, G., and Berndt, KD 44. Macnab, RM (1986) Methods Enzymol. 125, 563–581 (1999) J. Mol. Biol. 286, 541–552 45. Wielens, J., Crosby, IT, and Chalmers, DK (2005)J. Comput. Aided Mol. 55. Ladner, JE, Parsons, JF, Rife, CL, Gilliland, GL, and Armstrong, RN Des. 19, 301–317 (2004) Biochemistry 43, 352–361 46. Bader, M., Muse, W., Zander, T., and Bardwell, J. (1998)J. Biol. Chem273, 56. Haebel, PW, Goldstone, D., Katzen, F., Beckwith, J., and Metcalf, P. 10302–10307 (2002) EMBO J. 21, 4774–4784 47. Petersen, MT, Jonson, PH, and Petersen, SB (1999) Protein Eng. 12, 57. Charbonnier, JB, Belin, P., Moutiez, M., Stura, EA, and Quéméneur, E. 535–548 (1999) Protein Sci. 8, 96–105 48. Maeda, K., Hägglund, P., Finnie, C., Svensson, B., and Henriksen, A. (2006) 58. Colbert, CL, Wu, Q., Erbel, PJ, Gardner, KH, and Deisenhofer, J. Structure 14, 1701–1710 (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 4410–4415

JUNE 26, 2009•VOLUME 284 • NUMBER 26 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 17845

Scanlon

Harry Sakellaris, Mary Pearce, Stephen P. Bottomley, Jamie Rossjohn and Martin J. Pooja Sh

Jamie S. Simpson, Jerome Wielens, Susannah Piek, Charlene M. Kahler, Jason J. Paxman, Natalie A.

James Horne, Philip E. Thompson, Yanni Chin, Enzymes Peptide Reveals a Basis for Substrate Sp

in the Catalytic Cycle of DsbA The Structure of the Bacterial Oxidoreductase Enzyme DsbA in with a doi: 10.1074/jbc.M109.011502 originally published online April 22, 2009

2009, 284:17835-17845. J. Biol. Chem

10.1074/jbc.M109.011502 Access the most updated version of this article at doi: Alerts: When a correction for this article is posted • When this article is cited • to choose from all of JBC's e-mail alerts Click here

Supplemental material: http://www.jbc.org/content/suppl/2009/04/22/M109.011502.DC1

http://www.jbc.org/content/284/26/17835.full.html#ref-list-1

accessed free at

This article cites 58 references, 21 of which can be