Summary Nucleic Acid Extraction Methods

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ

NUCLEIC ACID EXTRACTION METHODS

Ο ζθνπφο ηεο εμαγσγήο είλαη λα απειεπζεξσζεί ην λνπθιετληθφ νμχ απφ ην θχηηαξν γηα ηε ρξήζε ζηηο επαθφινπζεο δηαδηθαζίεο. Ιδαληθά, ην λνπθιετληθφ νμχ πξέπεη λα κελ είλαη κνιπζκέλν κε πξσηεΐλε, πδαηάλζξαθα, ιηπίδηα, ή άιιν λνπθιετληθφ νμχ, δει., ην DNA ρσξίο RNA ή RNA ρσξίο DNA. Η αξρηθή απειεπζέξσζε ηνπ, επηηπγράλεηαη κε ην ζπάζηκν ηνπ θπηηάξνπ θαη ησλ ππξεληθψλ κεκβξαλψλ (λύση κυττάρων),ε νπνία πξαγκαηνπνηείηαη ζε ζπλζήθεο πνπ δελ θαηαζηξέθνπλ ην λνπθιετληθφ νμχ. Μεηά ην πιηθφ θαζαξίδεηαη θαη θαζνξίδεηαη ε ζπγθέληξσζε ηνπ δείγκαηνο.

ΑΠΟΜΟΝΩ΢Η DNA Πξψηνο ν Miescher απνκφλσζε ην DNA απφ αλζξψπηλα θχηηαξα ην 1869. Πξφζθαηεο δηαδηθαζίεο ρξεζηκνπνηνχλ ηηο δηαθνξέο ζηε δηαιπηφηεηα. κεγάισλ ρξσκνζσκηθψλ DNA, ησλ πιαζκηδίσλ θαη ησλ πξσηετλψλ ζε αιθαιηθά buffers.Τα κεγάια ρξσκνζσκηθά DNA θαη νη πξσηεΐλεο,ζε ρακειφ PH θαηαθξεκλίδνληαη, ελψ ηα ζρεηηθά κηθξά επηζηξέθνπλ ζηελ αξρηθή θαηάζηαζε.

Προεηοιμαζία ηοσ δείγμαηος Τν λνπθιετληθφ νμχ πξέπεη λα πξνζηαηεχεηαη απφ ηηο αλζξψπηλεο, κπθεηηαθέο, βαθηεξηαθέο θαη πξνεξρφκελεο απφ ηφ πεγέο ζην θιηληθφ εξγαζηήξην. Α) Δμπύρηνα κύηηαρα ζε αναζηολή (αίμα). Αλάινγα κε ηνλ ηχπν θιηληθνχ δείγκαηνο πνπ ζηέιλεηαη γηα ηελ αλάιπζε, ην δείγκα κπνξεί θαη πξέπεη λα επεμεξγαζηεί εθ ησλ πξνηέξσλ γηα λα θαηαζηήζεη ηα εκπχξελα θχηηαξα δηαζέζηκα απφ ηα νπνία ζα εμαρζεί ην λνπθιετληθφ νμχ. Γηα παξάδεηγκα, ηα ιεπθά θχηηαξα αίκαηνο (WBCs) πξέπεη λα απνκνλσζνχλ απφ ηα δείγκαηα αίκαηνο ή κπειψλ ησλ νζηψλ είηε κε θπγνθέληξεζε είηε κε ιχζε. Γηα ηε θπγνθέληξεζε, νιφθιεξν ην αίκα ή ν

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ κπειφο ησλ νζηψλ πνπ αλακηγλχεηαη κε ηζνηνληθφ αιαηνχρν είλαη επηζηξσκέλα κε Ficoll. Τν Ficoll είλαη έλα πιηθφ ζαθραξφδεο πνπ δελ δηαπεξλά ηηο κεκβξάλεο. Καηά ηε θπγνθέληξεζε, ηα κνλνπχξελα WBCs (ηα επηζπκεηά θχηηαξα γηα ηελ εμαγσγή ηνπ λνπθιετληθνχ νμένο)βξίζθνληαη πάλσ απν ηε δψλε πνπ ζρεκαηίδεη ην Ficoll. Τν ζηξψκα πνπ πεξηέρεη ηα κνλνπχξελα θχηηαξα αθαηξείηαη απφ ην ζσιήλα θαη πιέλεηαη ζε αιαηνχρν πξίλ ζπλερηζηεί ε δηαδηθαζία απνκφλσζεο ηνπ λνπθιεΐληθνχ νμένο. Μηα άιιε κέζνδνο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα απνκνλψζεη ηα εκπχξελα θχηηαξα είλαη ε εθκεηάιιεπζε ησλ δηαθνξψλ ζην σζκσηηθφ εχζξαπζην RBCs θαη WBCs. Η επψαζε νιφθιεξνπ ηνπ αίκαηνο ή ηνπ κπεινχ ησλ νζηψλ ζην buffer ή ην λεξφ ζα νδεγήζεη ζηε ιχζε ηνπ RBCs πξηλ απφ ηα WBCs. Τα WBCs γίλνληαη θφθθνη έπεηηα απφ ηε θπγνθέληξεζε, αθήλνληαο θελφ ζηε κεκβξάλε RBC θαη ηελ αηκνγινβίλε, αληίζηνηρα. Β) Γείγμαηα ιζηού. Τα θξέζθα ή παγσκέλα δείγκαηα ηζηνχ πξέπεη λα ρσξηζηνχλ πξηλ αξρίζνπλ νη δηαδηθαζίεο απνκφλσζεο DNA. Η ιείαλζε ηνπ παγσκέλνπ ηζηνχ ζην πγξφ άδσην, ε νκνγελνπνίεζε ηνπ ηζηνχ, ή απιά ην θνκκάηηαζκα ηνπ ηζηνχ πνπ ρξεζηκνπνηεί έλα ρεηξνπξγηθφ λπζηέξη κπνξνχλ λα δηαηαξάμνπλ νιφθιεξα ηα δείγκαηα ηζηνχ. Ο ζηαζεξφο ελζσκαησκέλνο ηζηφο πξέπεη λα απνπαξαθπλσζεί ζην μπιφιην (έλα κίγκα ηξηψλ ηζνκεξψλ ηνπ δηκεζπινβελδνιίνπ). Μεηά απφ επεμεξγαζία κε μπιφιεο, ν ηζηφο ζπλήζσο ελπδαηψλεηαη κε κεησκέλεο ζπγθεληξψζεηο αηζαλφιεο. Γ) Μικροοργανιζμοί. Μεξηθά βαθηεξίδηα θαη κχθεηεο έρνπλ ζθιεξά θπηηαξηθά ηνηρψκαηα πνπ πξέπεη λα ζπαζηνχλ γηα λα απειεπζεξσζεί ην λνπθιετληθφ νμχ. Απηφ κπνξεί λα επηηεπρζεί είηε ελδπκηθά κε δηάθνξα έλδπκα π.ρ ιπζνδχκε είηε κεραληθά. Οη ελδπκαηηθέο κέζνδνη είλαη ιηγφηεξν πηζαλφ λα βιάςνπλ ην ρξσκνζσκηθφ DNA θαη έηζη πξνηηκψληαη. Επεμεξγαζία κε SDS (sodium dodecyl sulfate) θαη ΝαΟΗ παξνπζία Tris, ΕDTA θαη γιπθφδεο κπνξεί λα ζπάζεη ηα βαθηεξηαθά θπηηαξηθά ηνηρψκαηα. Μεηά ην βξαζκφ κε ζνπθξφδε, Triton X-100, Tris buffer θαη EDTA θαη πξνζζήθε ιπζνδχκεο απειεπζεξψλεηαη DNA, ην νπνίν θαηαθξεκλίδεηαη κεηά ηελ πξνζζήθε αιθνφιεο. Τν DNA δηαζπάηαη κε δηαδηθαζίεο ΝανΗ ή βξαζκνχ πνπ ην κεηνπζηψλνπλ θαη κπνξεί λα κελ είλαη θαηάιιειεο κέζνδνη φπσο νη αλαιχζεηο κε πεξηνξηζηηθά ελδπκα πνπ απαηηνχλ δίθισλν DNA. Τν πιενλέθηεκα απηψλ ησλ κεζφδσλ είλαη ε ηαρχηεηα θαη ε απινηεηά ηνπο.

Οργανικές Μέθοδοι Απομόνωζης Μεηά απφ ηελ απειεπζέξσζε ηνπ DNA απφ ην θχηηαξν, ν πεξαηηέξσ θαζαξηζκφο απαηηεί ηελ αθαίξεζε ηεο κφιπλζεο ησλ πξσηετλψλ, ησλ ιηπηδίσλ, πδαηαλζξάθσλ. Απηφ επηηπγράλεηαη ρξεζηκνπνηψληαο έλα δηάιπκα πςεινχ άιαηνο, ρακεινχ PH θαη νξγαληθφ κίγκα θαηλφιεο-ρισξνθνξκίνπ. Τν δηάιπκα απηφ δηαιχεη εχθνια ηνπο πδξνθνβηθνχο κνιπζκαηηθνχο παξάγνληεο φπσο ηα ιηπίδηα θαη ιηπνπξσηεΐλεο θαη ζπιιέγεη ηα ππνιείκκαηα θπηηάξσλ. Γηα λα απνθεπρζεί ε κφιπλζε κε RNA, Rnαζε κπνξεί λα πξνζηεζεί ζε απηφ ην ζεκείν ή ζην επαλαδηαηαγκέλν DNA ζην ηέινο ηεο δηαδηθαζίαο. Όηαλ ε θαηλφιε θαη ην ρισξνθφξκην πξνζηίζεληαη ζην πδξφθηιν ιπκέλν θχηηαξν, δεκηνπξγείηαη κηα κνξθή δηθαζηθνχ γαιαθηψκαηνο. Μεηά ηε θπγνθέληξεζε ην πδξνθνβηθφ ζηξψκα (ιηπίδηα) ζα βξεζεί ζην θαηψηαην ζεκείν, ηα ακθίθπια (ππνιείκκαηα θπηηάξσλ) ελδηάκεζν ζηξψκα (άζπξν ίδεκα) θαη ηα πδξφθηια ζηελ θνξπθή. Σην αλψηεξν ζηξψκα πεξηέρεηαη ην DNA ην νπνίν ζπιιέγεηαη

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ θαη θπγνθεληξείηαη ζε δηάιπκα αηζαλφιε ή ηζνπξνπαλφιε ζε κηα πςειή ζπγθέληξσζε ηνπ άιαηνο νδεγψληαο ζηε δεκηνπξγία ηδήκαηνο απηνχ.(εηθ. 1.1)

Εηθ 1.1 Οξγαληθή Απνκφλσζε DNA

Ανόργανες Μέθοδοι Απομόνωζης Οη αλεζπρίεο αζθάιεηαο ζην θιηληθφ εξγαζηήξην θαζηζηνχλ ηε ρξήζε ησλ θαπζηηθψλ αληηδξαζηεξίσλ φπσο ε θαηλφιε αλεπηζχκεηε. Αξρηθά απηέο νη κέζνδνη δελ είραλ κεγάιε απφδνζε, ζήκεξα κπνξνχλ λα παξαγάγνπλ πςειήο πνηφηεηαο DNA ζε θαιέο παξαγσγέο. Η αλφξγαλε απνκφλσζε DNA θαιείηαη κεξηθέο θνξέο «salting out». Φξεζηκνπνηείηαη ζε ρακειφ pH θαη ζε πςειή αιαηφηεηα γηα λα θαηαθξεκλίζεη επηιεθηηθά ηηο πξσηεΐλεο. Μεηά ην DNA θαηαθξεκληδεηαη κε ηζνπξνπαλφιε.(εηθ. 1.2)

Εηθ 1.2 Αλφξγαλε Απνκφλσζε DNA

΢ηερεά Φάζη Απομόνωζης Γξεγνξφηεξε θαη απνηειεζκαηηθφηεξε κέζνδνο απνκφλσζεο DNA. Φξεζηκνπνηνχληαη ζηεξεέο κήηξεο πνπ κπνξνχλ λα δεζκεχνπλ θαη λα πιχλνπλ ην DNA. Σηεξεέο επηθάλεηεο κε ππξίηην δεζκεχνπλ απνηειεζκαηηθά ην DNA ζε ζπλζήθεο πςειήο αιαηφηεηαο. Υπάξρνπλ παξαιιαγέο απηήο ηεο δηαδηθαζίαο, έλα ζχγρξνλν ζχζηεκα είλαη ζηεξεέο κήηξεο ππξηηίνπ ππφ κνξθή ζηειψλ. Οη ζηήιεο έρνπλ δηάθνξα κεγέζε, αλάινγα κε ην πνζφ ηνπ DNA πνπ απνκνλψλεηαη θαη ρξεζηκνπνηνχληαη ζπλήζσο γηα λα απνκνλψζνπλ ηφ θαη βαθηεξηαθφ DNA απφ ηνλ νξφ, ην πιάζκα, ή ην εγθεθαινλσηηαίν πγξφ. Η πξνεηνηκαζία ησλ δεηγκάησλ γηα ηελ απνκφλσζε ηνπ DNA ζηα ζηεξεά θάζε αξρίδεη κε ηε ιχζε θπηηάξσλ θαη ηελ απειεπζέξσζε ησλ λνπθιετληθψλ νμέσλ, παξφκνηα κε ηηο νξγαληθέο θαη αλφξγαλεο δηαδηθαζίεο.

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Crude Lysis Αλ θαη νη πςειήο πνηφηεηαο πξνεηνηκαζίεο DNA είλαη ηζνδχλακεο πξνο ηηο επηηπρείο δηαδηθαζίεο, ππάξρνπλ πεξηζηάζεηο πνπ είηε απνθιείνπλ είηε απαγνξεχνπλ ηνλ εθηελή θαζαξηζκφ DNA. Απηνί πεξηιακβάλνπλ ηνπο κεγάινπο αξηζκνχο δηαινγήο δεηγκάησλ κε ηηο απιέο κεζφδνπο (π.ρ., ειεθηξνθφξεζε κε ή ρσξίο ηελ ελδπκηθή πέςε πεξηνξηζκνχ θαη κεξηθά δηαδηθαζίεο ελίζρπζεο), ηελ απνκφλσζε ηνπ DNA απφ ηα πεξηνξηζκέλα πνζά αξρηθνχ πιηθνχ, θαη ηελ απνκφλσζε ηνπ DNA απφ ηα δείγκαηα πξφθιεζεο φπσο νη ζηαζεξνί, παξαθίλε-ελζσκαησκέλνη ηζηνί. Σε απηέο ηηο πεξηπηψζεηο, ε απιή ιχζε ηνπ θπηηάξνπ ζην δείγκα ζα παξαγάγεη αξθεηά ρξήζηκν DNA γηα ηηο δηαδηθαζίεο ελίζρπζεο. A) Proteomic Lysis of Fixed Material Τα παξαθίλε-ελζσκαησκέλα δείγκαηα πξέπεη λα είλαη κε μπιφιε θαη ελπδαησκέλα πξηλ απφ ηελ απνκφλσζε ηνπ λνπθιετληθνχ νμένο. Γηα κεξηθέο δνθηκέο, φπσο νη ζσκαηηθέο αλαιχζεηο κεηαιιαγήο, έλα ρσξηζηφ ηκήκα κπνξεί λα εμεηαζηεί κηθξνζθνπηθά γηα λα πξνζδηνξίζεη ηα θχηηαξα φγθσλ. Οη εππξνζδηφξηζηεο πεξηνρέο ηνπ φγθνπ κπνξνχλ έπεηηα λα απνκνλσζνχλ άκεζα απφ ηε θσηνγξαθηθή δηαθάλεηα ζε buffer ή ζπιιακβάλεηαη απφ ην ιέηδεξ θαη ηνπνζεηείηαη ζε θπβέηεο.(εηθ 1.3)

Εηθ 1.3 Crude extraction of DNA

Β) Extraction With Chelating Resin Φξεζηκνπνηείηαη ην Chelex-κηα ρειηθή έλσζε ξεηίλεο πνπ κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηελ απιή απνκφλσζε DNA. Απηή ε κέζνδνο είλαη ζπλεζέζηεξε θαη είλαη ρξήζηκε γηα ηνλ θαζαξηζκφ ηνπ DNA απφ ηα θιηληθά δείγκαηα. Γ) Other Rapid Extraction Methods Με ηελ εκθάληζε ηεο PCR, νη λέεο θαη γξεγνξφηεξεο κέζνδνη γηα ηελ απνκφλσζε DNA έρνπλ αλαπηπρζεί. Απαηηνχληαη ειάρηζηεο δηαδηθαζίεο γηα ηε αλάιπζε ηνπ πιηθνχ. Οη γξήγνξεο κέζνδνη ιχζεο θαη νη θάξηεο απνκφλσζεο DNA/απνζήθεπζεο (Whatman) παξέρνπλ αξθεηά θαζαξφ DNA πνπ κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηελ ελίζρπζε.

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Απομόνωζη Μιηοτονδριακού DNA Υπάξρνπλ δχν πξνζεγγίζεηο ζηελ απνκφλσζε ηνπ κηηνρνλδξηαθνχ DNA απφ επθαξπσηηθά θχηηαξα. Μηα κέζνδνο είλαη λα απνκνλψλεη αξρηθά ηα κηηνρφλδξηα απφ ηε θπγνθέληξεζε. Αθφηνπ νκνγελνπνηνχληαη νη πξνεηνηκαζίεο θπηηάξσλ κε επψαζε ζε πάγν, ε νκνηνγέλεηα ππνβάιιεηαη ζε θπγνθέληξεζε(ιίγεο ζηξνθέο) γηα λα θνθθνπνηήζεη ηα άζηθηα θχηηαξα, ηνπο ππξήλεο θαη ηα ππνιείκκαηα θπηηάξσλ. Τν κηηνρφλδξην κπνξεί λα θνθθνπνηεζεί απφ λεξφ ζε κηα δεχηεξε κεγάιε θπγνθέληξεζε. Τα κηηνρφλδξηα κπνξνχλ λα ιπζνχλ κε ηελ πξσηετλάζε ε νπνία αθαηξεί ηνπο πξσηετληθνχο κνιπζκαηηθνχο παξάγνληεο. Τν κηηνρφλδξηαθφ DNA έπεηηα θαηαθξεκλίδεηαη κε αηζαλφιε θαη ηνπνζεηείηαη ζε θαηάιιειν buffer γηα αλάιπζε. Η δεχηεξε πξνζέγγηζε ζηε κηηνρνλδξηαθή πξνεηνηκαζία DNA, είλαη λα απνκνλσζεί ην ζπλνιηθφ DNA φπσο πεξηγξάθεηαη αλσηέξσ. Η πξνεηνηκαζία πεξηέρεη ην κηηνρνλδξηαθφ DNA πνπ κπνξεί λα αλαιπζεί κε πβξηδνπνίεζε ή PCR.

Απομόνωζη RNA Όηαλ δνπιεχνπκε ζην εξγαζηήξην κε ην RNA, πξέπεη λα έρνπκε αθξηβείο πξνθπιάμεηο γηα ηελ απνθπγή εθθπιηζκνχ ηνπ δείγκαηνο ηνπ RNA. Τν RNA είλαη ηδηαίηεξα αζηαζέο εμαηηίαο ηεο παξνπζίαο ησλ ξηβνλνπθιεαζψλ, νη νπνίεο είλαη πξσηεΐλεο πνπ κπνξνχλ λα επαλέιζνπλ ζηελ αξρηθή ηνπ κνξθή θαη λα γίλνληαη δξαζηηθέο. Αληίζεηα κε ηηο δεζνμπξηβνλνπθιεάζεο, νη ξηβνλνπθιεάζεο πξέπεη λα είλαη αλελεξγέο θαη αδξαλείο πξηλ ηελ απνκφλσζε ηνπ RNA. Είλαη ρξήζηκν λα πξνζδηνξηζηεί ε πεξηνρή κηαο εηδηθήο ειεχζεξεο ξηβνλνπθιεάζεο (RNF) ηνπ εξγαζηεξίνπ γηα απνζήθεπζε πιηθνχ θαη ηξφπνπ εθηέιεζεο. Επίζεο, πξέπεη λα ηεξνχληαη ζην εξγαζηήξην νη θαλφλεο βηναζθάιεηαο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο απνκφλσζεο. Τέινο, πξέπεη λα γίλεηαη ρξήζε άξζξσλ ζρεδηαζκνχ ειεχζεξεο δεζνμπξηβνλνπθιεάζεο / ξηβνλνπθιεάζεο απφ πξνκεζεπηέο πνπ πεξηέρνληαη ζηε ζπζθεπαζία. Ολικό RNA : Υπάξρνπλ δηάθνξνη ηχπνη RNA πνπ απαληψληαη ζηνπο επθαξπσηηθνχο θαη πξνθαξπσηηθνχο νξγαληζκνχο. Τν πην άθζνλν (80-90%) RNA πνπ απαληάηαη ζε φια ηα θχηηαξα είλαη ην ξηβνζσκηθφ RNA (rRNA). Αλάινγα ηνλ ηχπν ηνπ θπηηάξνπ θαη ηηο ζπλζήθεο, ην επφκελν άθζνλν RNA (2,5-5%) είλαη ην κεηαθνξηθφ RNA (mRNA). Τν κεηαγξαθηθφ RNA (tRNA) θαη ηα κηθξά λνπθιετθά RNA είλαη επίζεο παξφληα ζην νιηθφ RNA δείγκα. Αθαίρεζη από ηο ολικό RNA: Η δηαδηθαζία αθαίξεζεο ηνπ RNA δηαθέξεη απφ απηή ηεο αθαίξεζεο ηνπ DNA. Τα δείγκαηα ησλ ΔΕΚ ηνπ αίκαηνο θαη ηνπ λσηηαίνπ κπεινχ δηαιχνληαη κε φζκσζε ή δηαρσξίδνληαη απφ ηα ιεπθά κε θπγνθέληξεζε θαη απηά ηα δείγκαηα δηαηεξνχληαη παγσκέλα ζε ξεπζηφ άδσην ή εκβαπηηζκέλα ζε buffer γηα ηελ αδξαλνπνίεζε ησλ ξηβνλνπθιεαζψλ. Τν βαθηεξηαθφ θαη ην κπθεηηαθφ RNA απνκνλψλνληαη κε ρεκηθή ιχζε ή κε ιηψζηκν ζε ξεπζηφ άδσην. Τν τηθφ RNA απνκνλψλεηαη ακέζσο απφ ηνλ νξφ ή απφ πγξφ ρσξίο θχηηαξα. Επεηδή νη πεξηζζφηεξεο κέζνδνη απνκφλσζεο νιηθνχ RNA δελ κπνξνχλ λα δηαθξίλνπλ κεηαμχ ηνπ RNA ησλ κηθξννξγαληζκψλ θαη απηνχ ηνπ θπηηάξνπ μεληζηή, πξέπεη λα ρξεζηκνπνηνχληαη πιηθά ρσξίο θχηηαξα. Η ιχζε ηνπ θπηηάξνπ γηα ηελ απνκφλσζε ηνπ RNA γίλεηαη ζε απνξξππαληηθφ ή θαηλφιε παξνπζία πςεινχ αιαηηνχ ή ζε αλαζηνιείο ηεο ξηβνλνπθιεάζεο. Άπαμ θαη ηα θχηηαξα ιπζνχλ, νη πξσηεΐλεο κπνξνχλ λα

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ απνκνλσζνχλ κε θαηλφιε. Τα δηαιχκαηα νμπθαηλφιε, ρισξνθφξκην θαη ε αιθνφιε ηζνακπιίνπ απνκνλψλνπλ ην RNA. Σε κεξηθέο κεζφδνπο απνκφλσζεο, ε δεζνμπξηβνλνπθιεάζε πξνζηίζεηαη ζηε ιχζε, γηα λα κεησζεί ε κφιπλζε ηνπ DNA. Ελαιιαθηηθά, ε ξηβνλνπθιεάζε ρσξίο δεζνμπξηβνλνπθιεάζε πξέπεη λα πξνζηεζεί ακέζσο γηα λα απνκνλσζεί ην RNA ζην ηέινο ηεο κεζφδνπ. Μεηά ηε θάζε ηεο απνθφιιεζεο, ε πδαηηθή θάζε πνπ πεξηέρεη ην RNA κεηαθέξεηαη ζε έλα θαζαξφ ζσιήλα θαη ην RNA κε πξφζζεζε δπν κνλάδσλ αηζαλφιεο ή κία κνλάδα ηζνπξνπαλφιεο. Τν ίδεκα RNA κεηά πιέλεηαη ζε αηζαλφιε 70% θαη αησξείηαη ζε ξπζκηζηηθφ RNF ή λεξφ (εηθ. 2.1.).

Εηθ. 2.1. Οξγαληθή αθαίξεζε ηνπ νιηθνχ RNA

Η ζηεξεή θάζε απνθφιιεζεο ηνπ RNA μεθηλάεη κε ηα ίδηα βήκαηα ηεο νξγαληθήο θάζεο. Οη ζπλζήθεο ηνπ δπλαηνχ απνδηαηεηαγκέλνπ buffer πξέπεη λα ξπζκηζηνχλ πξηλ ηελ είζνδν ηεο ιπζάηεο ζηε ζηήιε. Μεξηθά ζπζηήκαηα πξνκεζεχνπλ έλα θίιηξν – ζηήιε γηα λα κεηαθηλήζνπλ ζσκαηηδηαθά πιηθά πξηλ ηελ είζνδν ηεο ζηήιεο πξνζξφθεζεο. Η ιπζάηε εηζέξρεηαη ζε κηα ζηήιε ζε ξπζκηζηηθφ πςεινχ αιαηηνχ θαη ην RNA πνπ έρεη πξνζξνθεζεί πιέλεηαη κε buffer. Τν εμαγφκελν RNA έρεη ζπλήζσο επαξθή ζπγθέληξσζε θαη θαζαξφηεηα γηα άκεζε ρξήζε ζε πνιιέο κεζφδνπο (εηθ. 2.2.).

Εηθ. 2.2. Απνκφλσζε ηνπ RNA ζε έλα ζηέξεν πιηθφ

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Γεληθά, έλα εθαηνκκχξην επθαξπσηηθά θχηηαξα ή 10-50 mg ηζηνχ ζα δψζνπλ γχξσ ζηα 10 κg RNA. Η απφδνζε ηνπ RNA απφ βηνινγηθά πγξά ζα εμαξηεζεί απφ ηελ ζπγθέληξσζε ησλ κηθξννξγαληζκψλ ε ηελ παξνπζία άιισλ κνξίσλ ζηφρσλ ζην δείγκα.

Απομόνωζη ηοσ polyA(μεηαθορικό) RNA Σπρλά, ην RNA πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα αλάιπζε είλαη mRNA. Η πιεηνςεθία απηνχ έρεη γνλίδηα πςειήο έθθξαζεο. Γηα λα εκπινπηηζηεί ε απφδνζε ηνπ mRNA, ρξεζηκνπνηνχληαη εηδηθά ζπάληα αληίγξαθα πνπ απαζρνινχλ νιηγνκεξή ζπκίλεο ή νπξαθίιεο αθηλεηνπνηεκέλα ζε έλα ζηξψκα ζηήιεο ξεζίλεο ή ζθαηξίδηα. Τα polyT θαη polyU νιηγνκεξή ζα δέλνπλ ηελ πνιπνχξα πνπ βξέζεθε απνθιεηζηηθά ζην mRNA. Μεηά ηελ πιχζε απνκαθξχλεηαη ην ππνιεηκκαηηθφ RNA, θαη ε polyΑ RNA εμάγεηαη κε πιχζηκν ηεο ζηήιεο κε δεζηφ, ιίγν αιαηηζκέλν buffer πνπ πεξηέρεη απνξξππαληηθφ. Με απηήλ ηελ πξνζέγγηζε, κπνξνχλ λα απνθηεζνχλ πεξίπνπ 30-40 ng ηνπ mRNA απφ 1κg νιηθνχ RNA (εηθ. 2.3.).

Εηθ. 2.3. Απνκφλσζε ηνπ polyA(κεηαθνξηθφ) RNA

Υπάξρνπλ πεξηνξηζκνί γηα ηελ απνκφλσζε ηεο polyΑ RNA κε ρξήζε νιηγνdT ή dU.

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΔΣΡΗ΢ΔΙ΢ ΣΗ΢ ΠΟΙΟΣΗΣΑ΢ ΚΑΙ ΣΗ΢ ΠΟ΢ΟΣΗΣΑ΢ ΣΟΤ ΝΟΤΚΛΔΪΚΟΤ ΟΞΔΟ΢ Η εξγαζηεξηαθή αλάιπζε ησλ λνπθιετθψλ νμέσλ έρεη πνηθίια απνηειέζκαηα πνπ εμαξηψληαη απφ ηελ πνηφηεηα θαη ηελ πνζφηεηα ησλ εηζαγφκελσλ πιηθψλ. Απηφο είλαη έλαο ζεκαληηθφο ιφγνο γηα ην θιηληθφ εξγαζηήξην, θαζψο ηα απνηειέζκαηα ησλ εμεηάζεσλ πξέπεη λα είλαη επαθξηβψο ζπλαθή κε ηελ άπνςε ηεο παζνινγίαο ηεο αζζέλεηαο. Τα ζχκθσλα απνηειέζκαηα αμηψλνπλ φηη ε ηξερνχκελε απφθιηζε ζα κεηψλεηαη. Επηπρψο, νη κεηξήζεηο ηεο πνηφηεηαο θαη ηεο πνζφηεηαο ηνπ DNA θαη ηνπ RNA ζα είλαη αθξηβείο. Ηλεκηροθόρηζη Τν DNA θαη ην RNA κπνξνχλ λα αλαιπζνχλ γηα ηελ πνηφηεηά ηνπο κε αλάιπζε κηαο δηαίξεζεο ηνπ απνκνλσκέλνπ δείγκαηνο ζε gel αγαξφδεο. Οη θζνξίδνπζεο βαθέο φπσο ην βξσκηνχρν αηζίδην ή ε Sybrgreen Ι δέλνπλ ηδηαίηεξα ην DNA θαη είλαη ρξήζηκεο γηα ηελ απεηθφληζε ηνπ παξαζθεπάζκαηνο. Φξεζηκνπνηνχληαη θαη γηα ηελ αλίρλεπζε RNA. Η εκθάληζε ηνπ DNA ζην gel αγαξφδεο βαζίδεηαη ζηνλ ηχπν ηνπ απνκνλσκέλνπ DNA. Μηα θαιή πξνεηνηκαζία ηνπ πιαζκηδηαθνχ DNA κηα θσηεηλή κνλή κπάληα κέηξηαο θηλεηηθφηεηαο ελφο ππεξειηθψκελνπ πιαζκηδηαθνχ DNA θαη αζήκαληεο κπάληεο πνπ αλαπαξηζηνχλ θνκκέλν ή ζπαζκέλν πιαζκίδην (εηθ. 3.1.). Όηαλ ρξεζηκνπνηνχληαη θζνξίδνπζεο βαθέο, ην DNA θαη ιηγφηεξν ην RNA, κπνξνχλ λα κεηξεζνχλ πνζνηηθψο ζε ζχγθξηζε κε ηελ έληαζε θζνξηζκνχ ηνπ δηαηξεκέλνπ ηξέρνληνο δείγκαηνο ζην gel. Η ππθλφηεηα ησλ εληάζεσλ ησλ κπαληψλ δείρλεη ηελ πην αθξηβή κέηξεζε ηεο πνζφηεηαο.

Εηθ. 3.1. Ηιεθηξνθφξεζε

Φαζμαηοθωηομεηρία Τα λνπθιετθά νμέα απνξξνθνχλ αθηηλνβνιία ζηα 260nm κέζα απφ ηα ηδήκαηα αδελίλεο. Φξεζηκνπνηψληαο ην θαλφλα Lambert – Beer, ε ζπγθέληξσζε κπνξεί λα θαζνξηζηεί απφ ηηο ζηαζεξέο απνξξνθεηηθφηεηαο (50 γηα ην DNA, 40 γηα ην RNA). Η ζρέζε ηεο ζπγθέληξσζεο ηεο απνξξνθεηηθφηεηαο εθθξάδεηαη σο: A = ε b c (φπνπ Α = απνξξνθεηηθφηεηα, ε = κνξηαθή απνξξφθεζε, b = κήθνο κνλνπαηηνχ θαη c = ζπγθέληξσζε). Η απνξξνθεηηθφηεηα ζ’ απηφ ην κήθνο θχκαηνο είλαη έηζη αθξηβψο αλάινγε κε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ λνπθιετθνχ νμένο ζην δείγκα. Φξεζηκνπνηψληαο ηελ απνξξνθεηηθφηεηα σο έλα παξάγνληα κεηαηξνπήο απφ κία νπηηθή ππθλφηεηα ζε ζπγθέληξσζε, βξίζθνπκε φηη κηα κνλάδα νπηηθήο ππθλφηεηαο ζηα 260nm ηζνδπλακεί κε 50mg/l DNA θαη 40mg/l RNA. Οη κεηξήζεηο ηεο

ΝΑΤΣΑΡΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ θαζκαηνθσηνκεηξίαο δείρλνπλ επίζεο ηελ πνηφηεηα ηνπ λνπθιετθνχ νμένο. Η πξσηεΐλε εθπέκπεη αθηηλνβνιία ζηα 280nm κέζσ ησλ ηδεκάησλ ηξππηνθάλεο. Η απνξξνθεηηθφηεηα ηνπ λνπθιετθνχ νμένο ζηα 260nm πξέπεη λα είλαη 1,6 – 2,00 θνξέο πεξηζζφηεξε ηεο απνξξνθεηηθφηεηαο ζηα 280nm. Αλ ε αλαινγία 260nm/280nm είλαη κηθξφηεξε ηνπ 1,6, ε πξνεηνηκαζία ηνπ δείγκαηνο έρεη κνιπλζεί κε αλεπηζχκεηα πνζά πξσηεΐλεο θαη δελ έρεη επαξθή θαζαξφηεηα γηα ρξήζε. Τν RNA δίλεη κηα θάπσο πςειή αλαινγία 260nm/280nm, 2,0-2,3. Μηα πξνεηνηκαζία DNA κε αλαινγία πςειφηεξε απφ 2,0 πξέπεη λα έρεη κνιπλζεί κε RNA. ΢πινθηρομεηρία Η ζπηλζεξνκεηξία ή ε θζνξίδνπζα θαζκαηνζθνπία κεηξάεη ην θζνξηζκφ πνπ ζρεηίδεηαη κε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ DNA ζε ζρέζε κε ηηο θζνξίδνπζεο βαθέο πνπ είλαη εηδηθέο γηα ην DNA. Παιηέο κέζνδνη ρξεζηκνπνηνχζαλ ηε βαθή DABA, ε νπνία ζπλδπάδεηαη κε Α κεζπιεληθή αιδευδε γηα λα απνδψζεη θζνξίδνλ πξντφλ. Φξεζηκνπνηείηαη αθφκε γηα αλίρλεπζε ππξήλσλ θαη σο control ζηνλ πβξηδηζκφ θαη ζηηο κηθξναλαιχζεηο. Οη πεξηζζφηεξεο λέεο κέζνδνη ρξεζηκνπνηνχλ ην Hoesct 33258, κηα εηδηθή βαθή γηα DNA. Απηή ε βαθή ζπλδπάδεηαη κε ην δεχγνο Α-Τ ηεο δηπιήο έιηθαο DNA θαη είλαη εηδηθή γηα ην άζηθην δίθισλν DNA. O θζνξηδνκεηξηθφο πξνζδηνξηζκφο ηεο ζπγθέληξσζεο DNA πνπ ρξεζηκνπνηεί βαθή Hoesct 33258 είλαη πνιχ επαίζζεηνο. Η PicoGreen θαη ε OliGreen είλαη άιιεο βαθέο εηδηθέο γηα DNA, πνπ κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ γηα θζνξηδνκεηξηθή πνζνηηθφηεηα. Η PicoGreen είλαη πεξηζζφηεξν επαίζζεηε απφ ηελ Hoesct 33258, θαη δελ δέλεηαη κε κνλφθισλν DNA θαη ην RNA. Η OliGreen έρεη ζρεδηαζηεί λα δέλεη κηθξά θνκκάηηα κνλφθισλνπ DNA (νιηγνλνπθιενηίδηα). Τν RNA κπνξεί λα κεηξεζεί ζε δηάιπκα ρξεζηκνπνηψληαο ηε gel βαθή SybrGreen ΙΙ, φκσο δελ είλαη εηδηθή γηα ην RNA θαη ζα δεζεί κε ην δίθισλν DNA εμίζνπ θαιά. Έηζη, γηα λα κεηξεζεί ην RNA πξέπεη λα απνκαθξπλζεί απφ ην δείγκα ην DNA. Οη κεηξήζεηο ζπηλζεξνκεηξίαο ρξεηάδνληαη βαζκνλφκεζε ελφο δεδνκέλνπ κε έλα γλσζηφ ζηαληαξ πνζνχ λνπθιετθνχ νμένο πξηλ απφ θάζε ηξέμηκν.