Nucleic Acid Extraction Methods

ΠΑΝΔΠΙ΢ΣΗΜΙΟ ΘΔ΢΢ΑΛΙΑ΢ ΢ΥΟΛΗ ΔΠΙ΢ΣΗΜΩΝ ΤΓΔΙΑ΢ ΣΜΗΜΑ ΒΙΟΥΗΜΔΙΑ΢ – ΒΙΟΣΔΥΝΟΛΟΓΙΑ΢ ΜΠ΢: "ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ-ΜΟΡΙΑΚΗ ΓΔΝΔΣΙΚΗ,ΓΙΑΓΝΩ΢ΣΙΚΟΙ ΓΔΙΚΣΔ΢"

Nucleic Acid Extraction Methods

 ΝΑΣ΢ΑΡΙΓΗ΢ ΝΙΚΟΛΑΟ΢ ΛΑΡΙ΢Α 2009

ΑΠΟΜΟΝΩ΢Η DNA I) ΠΡΟΔΣΟΙΜΑ΢ΙΑ ΣΟΤ ΓΔΙΓΜΑΣΟ΢ 

Δμπύρηνα κύηηαρα ζε αναζηολή(αίμα)



Γείγμαηα ιζηού



Μικροοργανιζμοί

II)ΜΔΘΟΓΟΙ ΑΠΟΜΟΝΩ΢Η΢ DNA  ΟΡΓΑΝΙΚΔ΢ ΜΔΘΟΓΟΙ ΑΠΟΜΟΝΩ΢Η΢  Καζαξηζκόο από κνιύλζεηο κε νξγαληθά δηαι/ηα.  νξγαληθό κίγκα θαηλόιεο-ρισξνθνξκίνπ DNA ζην αλώηεξν ζηξώκα.

δηαρσξηζκόο

 ΑΝΟΡΓΑΝΔ΢ ΜΔΘΟΓΟΙ ΑΠΟΜΟΝΩ΢Η΢ (“salting out”)

 ΢ΣΔΡΔΗ ΦΑ΢Η ΑΠΟΜΟΝΩ΢Η΢

 Γξεγνξόηεξε θαη απνηειεζκαηηθόηεξε κέζνδνο εμαγσγήο DNA κε ηηο ζηεξεέο κήηξεο.

 CRYDE LYSIS A) Proteomic Lysis of Fixed Material  Παραθινομένα προΐόνηα

Β) Extraction With Chelating Resin  Υρηζιμοποίηζη Chelex

C) Other Rapid Extraction Methods  Κσρίως με PCR

Δλατιζηοποίηζη διαδικαζιών

 ΑΠΟΜΟΝΩ΢Η ΜΙΣΟΥΟΝΓΡΙΑΚΟΤ DNA  Γύν κέζνδνη απνκόλσζεο κηηνρνλδξηαθνπ DNA : α) Με θπγνθέληξεζε θαη ιύζε ηνπ θπηηάξνπ β) Παξόκνηα απνκόλσζε ηνπ κηηνρνλδξηαθνύ DNA θαη αλάιπζε κε πβξηδνπνίεζε ή PCR.

Απομόνωζη RNA  Σν RNA είλαη ηδηαίηεξα αζηαζέο εμαηηίαο ηεο παξνπζίαο ησλ ξηβνλνπθιεαζώλ  Δίλαη ρξήζηκν λα πξνζδηνξηζηεί ε πεξηνρή κηαο εηδηθήο ειεύζεξεο ξηβνλνπθιεάζεο (RNF) ηνπ εξγαζηεξίνπ γηα απνζήθεπζε πιηθνύ θαη ηξόπνπ εθηέιεζεο  Πξέπεη λα ηεξνύληαη ζην εξγαζηήξην νη θαλόλεο βηναζθάιεηαο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο απνκόλσζεο

 Πξέπεη λα γίλεηαη ρξήζε άξζξσλ ζρεδηαζκνύ ειεύζεξεο δεζνμπξηβνλνπθιεάζεο / ξηβνλνπθιεάζεο από πξνκεζεπηέο πνπ πεξηέρνληαη ζηε ζπζθεπαζία.

Ολικό RNA

ξηβνζσκηθό RNA(rRNA)->80-90% κεηαθνξηθό RNA (mRNA) ->2,5-5%

κεηαγξαθηθό RNA (tRNA) κηθξά λνπθιετθά RNA

Αθαίρεζη από ηο ολικό RNA  δηαθέξεη από απηή ηεο αθαίξεζεο ηνπ DNA  έλα εθαηνκκύξην επθαξπσηηθά θύηηαξα ή 10-50 mg ηζηνύ ζα δώζνπλ γύξσ ζηα 10 κg RNA. Η απόδνζε ηνπ RNA από βηνινγηθά πγξά ζα εμαξηεζεί από ηελ ζπγθέληξσζε ησλ κηθξννξγαληζκώλ ή ηελ παξνπζία άιισλ κνξίσλ ζηόρσλ ζην δείγκα

Φάζεις αποκόλληζης  Οξγαληθή θάζε: Η ιύζε ηνπ θπηηάξνπ γηα ηελ απνκόλσζε ηνπ RNA γίλεηαη ζε απνξξππαληηθό ή θαηλόιε παξνπζία πςεινύ αιαηηνύ ή ζε αλαζηνιείο ηεο ξηβνλνπθιεάζεο.  Τδαηηθή θάζε: ην RNA κεηαθέξεηαη ζε έλα θαζαξό ζσιήλα θαη ην RNA θαζηδάλεη κε πξόζζεζε δπν κνλάδσλ αηζαλόιεο ή κία κνλάδα ηζνπξνπαλόιεο.  ΢ηεξεή θάζε: μεθηλάεη κε ηα ίδηα βήκαηα ηεο νξγαληθήο θάζεο.  Σν εμαγόκελν RNA έρεη ζπλήζσο επαξθή ζπγθέληξσζε θαη θαζαξόηεηα γηα άκεζε ρξήζε ζε πνιιέο κεζόδνπο.

Απομόνωζη ηοσ polyA (μεηαθορικό) RNA

 Σν RNA πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα αλάιπζε είλαη mRNA

 Γηα λα εκπινπηηζηεί ε απόδνζε ηνπ mRNA, ρξεζηκνπνηνύληαη εηδηθά ζπάληα αληίγξαθα πνπ απαζρνινύλ νιηγνκεξή ζπκίλεο ή νπξαθίιεο αθηλεηνπνηεκέλα ζε έλα ζηξώκα ζηήιεο ξεζίλεο ή ζθαηξίδηα  Σα polyT θαη polyU νιηγνκεξή ζα δέλνπλ ηελ πνιπνύξα πνπ βξέζεθε απνθιεηζηηθά ζην mRNA.  30-40 ng ηνπ mRNA από 1κg νιηθνύ RNA  Τπάξρνπλ πεξηνξηζκνί γηα ηελ απνκόλσζε ηεο polyΑ RNA κε ρξήζε νιηγνdT ή dU

ΜΔΣΡΗ΢ΔΙ΢ ΣΗ΢ ΠΟΙΟΣΗΣΑ΢ ΚΑΙ ΣΗ΢ ΠΟ΢ΟΣΗΣΑ΢ ΣΟΤ ΝΟΤΚΛΔΪΚΟΤ ΟΞΔΟ΢

Ηλεκηροθόρηζη Φαζμαηοθωηομεηρία

΢πινθηρομεηρία

Ηλεκηροθόρηζη  Σν DNA θαη ην RNA κπνξνύλ λα αλαιπζνύλ γηα ηελ πνηόηεηά ηνπο κε αλάιπζε κηαο δηαίξεζεο ηνπ απνκνλσκέλνπ δείγκαηνο ζε gel αγαξόδεο  Βξσκηνύρν αηζίδην ή ε SybrGreen Ι: ρξήζηκεο βαθέο γηα ηελ απεηθόληζε ηνπ παξαζθεπάζκαηνο  Η ππθλόηεηα ησλ εληάζεσλ ησλ κπαληώλ δείρλεη ηελ πην αθξηβή κέηξεζε ηεο πνζόηεηαο

Φαζμαηοθωηομεηρία  Σα λνπθιετθά νμέα απνξξνθνύλ αθηηλνβνιία ζηα 260nm κέζα από ηα ηδήκαηα αδελίλεο  A = ε b c (θαλόλα Lambert – Beer)  Η απνξξνθεηηθόηεηα ζ’ απηό ην κήθνο θύκαηνο είλαη έηζη αθξηβώο αλάινγε κε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ λνπθιετθνύ νμένο ζην δείγκα  Μηα κνλάδα νπηηθήο ππθλόηεηαο ζηα 260nm ηζνδπλακεί κε 50mg/l DNA θαη 40mg/l RNA  Η απνξξνθεηηθόηεηα ηνπ λνπθιετθνύ νμένο ζηα 260nm πξέπεη λα είλαη 1,6 – 2,00 θνξέο πεξηζζόηεξε ηεο απνξξνθεηηθόηεηαο ζηα 280nm  Σν RNA δίλεη κηα θάπσο πςειή αλαινγία 260nm/280nm, 2,0-2,3

΢πινθηρομεηρία  Μεηξάεη ην θζνξηζκό πνπ ζρεηίδεηαη κε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ DNA ζε ζρέζε κε ηηο θζνξίδνπζεο βαθέο πνπ είλαη εηδηθέο γηα ην DNA  Οη πεξηζζόηεξεο λέεο κέζνδνη ρξεζηκνπνηνύλ ην Hoesct 33258  Η PicoGreen θαη ε OliGreen είλαη άιιεο βαθέο εηδηθέο γηα DNA  Σν RNA κπνξεί λα κεηξεζεί ζε δηάιπκα ρξεζηκνπνηώληαο ηε gel βαθή SybrGreen ΙΙ  Οη κεηξήζεηο ζπηλζεξνκεηξίαο ρξεηάδνληαη βαζκνλόκεζε ελόο δεδνκέλνπ κε έλα γλσζηό ζηαληαξ πνζό λνπθιετθνύ νμένο πξηλ από θάζε ηξέμηκν