Restriction Enzymes

Restriction Enzyme  Digestion Timothy G. Standish, Ph. D.

©2000 Timothy G. Standish

●

Enzymes are the Tools of  DNA Technology

The tools of DNA technology are the same enzymes  used by cells to modify their own DNA: – DNA Polymerases – DNA Ligase

●

●

One special class of enzyme is pivotal to the cloning of  DNA and many other techniques used in DNA  Technology These enzymes are the restriction endonucleases

– Restriction ­ Because for the way they work, they restrict  bacteriophages to only one host bacterial strain.  They are also  restricted to acting on only specific DNA sequences – Endonuclease ­ They cut nucleic acids in the middle not just  the ends

©2000 Timothy G. Standish

●

Restriction Endonucleases

There are a number of different sub classes of  restriction endonucleases – Type I ­ Recognize specific sequences and cut DNA  at a nonspecific site > than 1,000 bp away – Type II ­ Recognize palindromic sequences and cut  within the palindrome – Type III ­ Recognize specific 5­7 bp sequences and  cut 24­27 bp down stream of the site.

●

Type II restriction endonucleases are the most  useful class as they recognize specific palindomic  sequences in DNA and cut the sugar phosphate  backbone within the palindrome

©2000 Timothy G. Standish

What is a Palindrome? A palindrome is anything that reads the same  forwards and backwards: ● English palindromes: ● Mom ● Dad ● Tarzan raised Desi Arnaz rat. ● Able was I ere I saw Elba (supposedly said by  Napoleon) ● Doc note I dissent, a fast never prevents a fatness,  I diet on cod. ●

©2000 Timothy G. Standish

DNA Palindromes

Because DNA is double stranded and the strands  run antiparallel, palindromes are defined as any  double stranded DNA in which reading 5’ to 3’  both are the same ● Some examples: ●

The EcoRI cutting site: –  5'­GAATTC­3' –  3'­CTTAAG­5' ● The HindIII cutting site: –  5'­AAGCTT­3' –  3'­TTCGAA­5' ●

©2000 Timothy G. Standish

Uses of Restriction  Endonucleases

Because restriction endonucleases cut specific  sequences they can be used to make “DNA  fingerprints” of different samples of DNA.  As  long as the cutting site changes on the DNA or  the distance between cutting sites changes,  fragments of different sizes will be made. ● Because Type II restriction endonucleases cut  only at palindromes, they leave “sticky ends” that  will base pair with any other fragment of DNA  cut with the same enzyme.  This is useful in  cloning. ●

©2000 Timothy G. Standish

R. E.s and DNA Ligase 

Can be used to make recombinant DNA EcoRI

EcoRI

GAATTC CTTAAG

GAATTC CTTAAG G CTTAA

1 Digestion

AATTC G

2 Annealing of sticky ends

Ligase

G AATTC CTTAA G

3 Ligation

4 Recombinant DNA G AATTC CTTAA G

©2000 Timothy G. Standish

● ●

● ● ●

●

Gel Electrophoresis

Separates DNA (or RNA or Protein) fragments on the  basis of charge and size Because DNA is an acid, it looses protons in basic  buffers, thus it has a negative charge that should be  uniform per unit length Agarose (a polysaccharide) or other gel matrices are  difficult for large DNA fragments to move through The larger the fragment, the more difficulty it has  moving through gels By placing DNA in a gel, then applying a voltage  accross the gel, the negatively charged DNA will move  toward the positive pole Large fragments lag behind while small fragments move  throght the gel relatively rapidly

©2000 Timothy G. Standish

Gel Electrophoresis Wells

©2000 Timothy G. Standish

Gel Electrophoresis Wells

©2000 Timothy G. Standish

Gel Electrophoresis ­

Wells Large Direction  of DNA Travel

Small

+

©2000 Timothy G. Standish

©2000 Timothy G. Standish