Protocolos Microbiologia

Universidade Federal do Triângulo Mineiro Departamento de Ciências Biológicas Disciplina de Microbiologia Aplicada Relatório de Prática

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E DE MATERIAIS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009

OBJETIVO Preparo de meios de cultura e materiais para elaboração de práticas no laboratório de Microbiologia.

INTRODUÇÃO Em um laboratório de microbiologia, é importante que existam equipamentos e normas para proporcionar segurança e exatidão nos resultados. Para isso, segundo a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), são precisos equipamentos mínimos para seu funcionamento adequando, como: estufa bacteriológica, forno de Pasteur, autoclave, microscópio binocular, centrifugador de baixa rotação, homogeneizador, banhomaria de pequena dimensão, destilador para água, balança para tarar tubos, balança comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de fluxo laminar. Com estes equipamentos, pode-se então dar início à prática de microbiologia, sem riscos de contaminação e com segurança.

MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizados os seguintes equipamentos: Autoclave Papel pardo Barbante Pipetas Balão de fundo chato Balança de precisão Espátula de madeira Meio de cultura sólido Água destilada Placa de Petri Tubo de ensaio Bico de Bunsen Fita crepe termossensível Ponteiras descartáveis Preparação dos meios de cultura Foram preparados os meios de cultura: ágar MacConkey, ágar Mueller-Hinton, ágar manitol, meio SIM, ágar Uréia e ágar sangue. Na preparação do ágar MacConkey, preparou-se 500mL de ágar com uma concentração de 51,5g/L. Para isso, pesou-se 25,75g de meio de cultura sólido em uma balança de precisão, com o auxílio de uma espátula de madeira. Essa quantidade foi adicionada a um balão de fundo chato e, então, adicionou-se 500mL de água destilada. O preparado foi homogeneizado, lacrado e autoclavado. Na retirada, o meio estava a 121ºC, sendo resfriado em água corrente, até 45ºC. Posteriormente, este foi adicionado a placas de Petri para solidificação. O bico de bunsen foi utilizado para a retirada de possíveis bolhas no meio. Os demais meios de cultura foram preparados á semelhança do anterior, porém com concentrações diferentes: Ágar Mueller-Hinton: 500 mL à concentração de 36g/L. Ágar manitol: 500 mL à concentração de 111g/L.

Meio SIM: 100 mL à concentração de 30g/L. Ágar Uréia: 95 mL à concentração de 25,2g/L. Ágar sangue: 800 mL à concentração de 40g/L à 5% de sangue humano Processo de autoclavagem Foi utilizado invólucro de papel pardo, para envolver pipetas, ponteiras, tubos de ensaio e o gargalo do balão de fundo chato. Identificou-se o material com fita crepe termossensível, o nome dos meios de cultura e os volumes das pipetas. Estes foram lacrados com barbante. Em seguida adicionou-se água destilada para cobrir a resistência da autoclave e, posteriormente, inseriu os materiais na autoclave. Esta foi fechada e ligada durante 30 minutos a 121ºC. Após esse tempo, aguardar a saída do vapor e diminuição da pressão, abrindo a autoclave e retirando os materiais com cuidado.

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RESULTADOS E DISCUSSÃO Após a solidificação dos meios, estes são armazenados, podendo ser utilizados para culturas e em prova bioquímicas para análise de microrganismos. Os equipamentos autoclavados estarão prontos para serem utilizados, com uma capacidade de armazenamento de até 15 dias. Segundo o manual da ANVISA “Segurança e Controle de Qualidade no Laboratório de Microbiologia Clínica”, todos os materiais e resíduos do laboratório deverão ser descontaminados antes de serem utilizados e descartados através de um método de descontaminação aprovado, como a esterilização por calor úmido (autoclave). Outras medidas para diminuir os riscos no laboratório referem-se, principalmente, a: Pipetagem: É contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clínico (sangue, liquor, urina, etc.) ou de suspensões bacterianas. Deve-se utilizar, sempre que possível, pipetas automáticas ou bulbos de borracha; Flambagem de Alça Bacteriológica: Deve ser feita através de chama, que deve estar entre o manipulador e a alça, sempre que for feito a manipulação de material biológico ou durante transferência de massa bacteriana; Disseminação de Esporos de Fungos: Ao se trabalhar com fungos, particularmente os filamentosos, recomenda-se o uso de cabines biológicas.

BIBLIOGRAFIA 1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. 2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI, 2001 3. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Segurança e Controle de Qualidade no Laboratório de Microbiologia Clínica. Disponível em: <www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_2_2004.pdf>. Acesso em: 12 nov. 2009 4. MANUAL DE BIOSSEGURANÇA dos Ambulatórios da Faculdade de Odontologia da PUCRS. Disponível em: . Acesso em: 12 nov. 2009 5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS COM PROVAS BIOQUÍMICAS. Disponível em: <www.microbiologia.ufba.br/aulas/provas%20bioquimicas.doc>. Acesso em: 12 nov. 2009 6. AUTOCLAVES VERTICAIS. Disponível em: . Acesso em: 12 nov. 2009

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COLETA, SEMEADURA E COLORAÇÃO DE GRAM DE AMOSTRAS CLÍNICAS

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009

OBJETIVO Coletar amostras de fossas nasais, orofaringe e urina, para semeadura e identificação pelo método de Gram.

INTRODUÇÃO Quando se suspeita de uma doença infecciosa, devem ser solicitados cultivos apropriados ou técnicas dirigidas à detecção sorológica de antígenos e anticorpos. Em muitas instituições e comunidades, pode-se contar com patologistas, microbiologistas e técnicos para auxiliar os médicos na seleção das amostras adequadas para cultivo, e solicitar as provas apropriadas para alcançar o máximo isolamento ou detecção do microrganismo. É possível que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa mais importante na confirmação final de que um microrganismo é responsável pelo processo de enfermidade infecciosa. Uma amostra mal colhida pode resultar em fracasso no isolamento de microrganismos importantes. As infecções urinárias estão entre as enfermidades mais freqüentes na prática médica, sendo que o sexo feminino é o mais afetado devido à proximidade do ânus com a abertura urinária e ao fato da uretra feminina ser mais curta do que a masculina entre outros fatores, o que proporciona a predominância de enterobactérias neste sítio anatômico, sobretudo Escherichia coli. É altamente recomendável que os microbiologistas efetuem exames microscópicos diretos das amostras enviadas para cultivo. Não só pode ser possível proporcionar ao médico um rápido diagnóstico presuntivo, mas também a detecção de microrganismos específicos pode servir como guia para selecionar os meios de cultura apropriados e fornecer uma valiosa comparação de controle de qualidade com os isolados recuperados. A coloração de Gram, descoberta há pouco menos de 100 anos, é utilizada com muita freqüência para o exame microscópico direto de amostras e subcultivos.

MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizados os seguintes materiais: Swab Espátula de madeira Bico de bunsen Ágar sangue Ágar MacConkey Ágar manitol Amostras biológicas Alça de platina Tubos de ensaio Lâmina Cristal violeta Lugol Álcool etílico 95% Fucsina de Gram Óleo de imersão Microscópio ótico Pipeta automática Ponteiras descartáveis Soro fisiológico

Coleta e semeadura de material Foram coletas amostras clínicas dos próprios estudantes, utilizando-se um swab para material das fossas nasais e um para a orofaringe. Nas fossas nasais, esfrega-se o swab, umedecido com soro fisiológico, com movimentos circulares delicados, pressionando-o contra a parede lateral do nariz, conforme desenho abaixo:

http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20Inf luenza%20AH1N1.pdf

Após a coleta, o material é semeado por técnica de esgotamento no ágar manitol, próximo à chama do bico de bunsen. Na orofaringe, colhe-se swab, umedecido com soro fisiológicos, na área posterior da faringe e tonsilas, evitando tocar na língua, abaixando esta com a espátula de madeira, conforme desenho abaixo:

http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20Inf luenza%20AH1N1.pdf

Após a coleta, o material é semeado por técnica de esgotamento no ágar sangue, próximo à chama do bico de bunsen. A urina foi coletada previamente de um paciente do Hospital Escola, e foi feita a

técnica de semeadura em esteira, no meio MacConkey, próximo à chama do bico de bunsen. Coloração de Gram Após o crescimento nos meios de cultura, foi feito um esfregaço do material em duas lâminas, conforme o esquema abaixo. Na primeira, foram utilizadas três colônias diferentes do meio ágar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colônia do ágar manitol (A) e uma colônia do ágar MacConkey (B). Deixar secar ao ar.

Após isso, deve-se fixar o material na lâmina, passando-a três a quatro vezes através da chama do bico de bunsen, de modo que o material não seja removido durante o procedimento durante o procedimento de coloração. Coloca-se a lâmina sobre um suporte para coloração e cobrir a superfície com solução de cristal violeta. Após um minuto, lavar bem com água destilada. Cobrir o esfregaço com solução de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com água destilada. Sustenta-se a lâmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfície do esfregaço com álcool durante alguns poucos segundos. Lavar com água corrente e colocar novamente a preparação sobre suporte para coloração. Adiciona-se fucsina de Gram durante um minuto e lavar com água corrente. Coloca-se a lâmina em posição vertical deixando que o excesso de água escorra e o esfregaço seque. Examinar o esfregaço com óleo de imersão na objetiva de 100x no microscópio óptico. Método de diluição da urina Após a coleta da urina, utiliza-se uma pipeta automática para fazer a diluição em soro desta. No primeiro tubo, contendo 100μL de soro, adiciona-se 10μL de urina. Posteriormente, toma-se 10μL desta solução e adicionar no segundo tubo, que contem 1000μL de soro. Homogeneizar e descartar 10μL deste segundo tubo. Foram, então, semeadas em esteira, em três placas contendo ágar MacConkey, utilizando uma alça de platina, sendo a primeira placa semeada com a urina sem diluição, a segunda com a urina da primeira diluição e a terceira com a urina da segunda diluição, conforme esquema:

Após a incubação por 24 horas a 37ºC, é feita a contagem do número de colônias e multiplica-se pelo fator de calibração para emitir o resultado em unidades formadoras de colônias (U.F.C) por mL.

RESULTADOS Na cultura de ágar sangue, cresceram três tipos de colônias diferentes, todas apresentando aspecto brilhante: 1. Acinzentada com alfa-hemólise; 2. Amarelada com gama-hemólise; 3. Transparente com gama-hemólise. Na cultura de ágar manitol (A), cresceu apenas um tipo de colônia, sendo esta rosa e brilhante. Na cultura de ágar MacConkey (B), cresceu apenas um tipo de colônia, sendo esta transparente, permanecendo inalterado a cor do meio. Após feita a coloração de Gram destas colônias, foram encontrados os seguintes resultados, de acordo com o esquema:

● ● ● ● ●

Na região 1 da placa de ágar sangue, foram encontrados cocos Gram-negativos e Gram-positivos. Na região 2 da placa de ágar sangue, foram encontrados apenas cocos Gramnegativos. Na região 3 da placa de ágar sangue, foram encontrados apenas cocos Gramnegativos. Na região A da placa de ágar manitol, foram encontrados cocos Gram-positivos. Na região B da placa de ágar MacConkey, não foram encontrados microrganismos.

No método de diluição da urina, foi feito a seguinte contagem: ● Sem diluição – Houve crescimento em massa de bactérias. ● Diluição 1:100 – Foram contadas 200 colônias que, ao ser multiplicado pelo fator de diluição (100), corresponde a 20.000 UFC a cada 10μL. Porém, a contagem deve ser feita em 1000μL, sendo encontrado 2.000.000 UFC/mL. ● Diluição 1:1000 – Foram encontradas 17 colônias que, ao ser multiplicado pelo fator de diluição (1000), corresponde a 17.000 UFC a cada 10μL. Porém, a contagem deve ser feita em 1000μL, sendo encontrado 170.000 UFC/mL.

DISCUSSÃO Segundo o módulo IV da apostila da ANVISA. O meio Ágar sangue, oferece ótimas condições de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus sp e Staphylococcus sp. A interpretação da cor original do meio é vermelho. Na beta hemólise, apresenta halo transparente ao redor das colônias

semeadas (lise total dos eritrócitos). Na alfa hemólise, apresenta halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos). Na gama hemólise (sem hemólise) há ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros). Analisando os resultados obtidos da coloração de Gram de colônias retiradas do ágar sangue, pode-se fazer as seguintes inferências: • Região 1 – A hemólise presente no ágar sangue é justificada pela presença de cocos Gram-positivos, sendo estes do gênero Streptococcus produtores de hemolisinas. A presença de cocos Gram-negativos pode ser justificado por uma mistura de colônias, uma contaminação ou uma possível lavagem excessiva durante a coloração de Gram. • Regiões 2 e 3 – A falta de hemólise no ágar sangue pode ser justificada pela presença de cocos Gram-negativos, não produtores de hemolisinas. O ágar manitol é seletivo para Staphylococcus sp., através da fermentação do manitol. Analisando os resultados obtidos da coloração de Gram de colônias retiradas de ágar manitol, pode-se confirmar que realmente se trata de uma espécie de Staphylococcus. O ágar MacConkey, por apresentar cristal violeta como um de seus componentes, inibe o crescimento de microrganismos Gram-positivos, especialmente enterococos e estafilococos. Como a concentração de sais de bile é relativamente baixa, em comparação com outros meios, este meio não é tão seletivo para Gram-negativos. Ele é utilizado para isolar estes microrganismos e verificar a fermentação ou não de lactose. Analisando os resultados obtidos da coloração de Gram de colônias retiradas do ágar MacConkey, não se pode inferir nada, pois estas eram observadas no aumento de 10x, mas não eram observadas no aumento de 100x. A urina é um excelente meio de cultura, bactérias contaminantes podem multiplicarse quando a mesma é mantida à temperatura ambiente e invalidar os resultados da cultura. A semeadura deve ser feita com a urina em temperatura ambiente, espécimes que não possam ser examinados em 2 horas após a micção devem ser refrigerados. As contagens bacterianas permanecem estáveis por pelo menos 24 horas nessas condições. De uma maneira geral, utiliza-se a seguinte convenção para a análise dessas culturas: Acima de 100.000 UFC/mL = indício de infecção Entre 10.000 a 90.000 UFC/mL = suspeita de infecção Entre zero a 9.000 UFC/mL = sem significado clínico Analisando-se os resultados obtidos nas duas diluições, ficou evidente a presença de uma infecção, devido à presença de mais de 100.000 UFC/mL.

BIBLIOGRAFIA 1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. 2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI, 2001 3. FREITAS, Valdionir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A coloração de Gram e as variações na sua execução. NewsLab, São Paulo, SP, v. 14, n. 82, p. 124-128, out. 2006. 4. TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM. Brasília: Ministério da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. Série TELELAB, 1997. 5. PROTOCOLOS DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA – Urocultura. Disponível em: . Acesso em: 12 nov. 2009

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ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009

OBJETIVO Isolar e identificar, através de provas bioquímicas, as espécies de cocos Grampositivos mais comuns isolados de seres humanos.

INTRODUÇÃO Com exceção dos membros da família Enterobacteriaceae, as bactérias Grampositivas, principalmente os cocos, são os microrganismos isolados com mais freqüência a partir de amostras biológicas humanas em laboratórios de microbiologia. Essas bactérias estão amplamente distribuídas na natureza, e podem ser isoladas de ambientes ou como habitantes comensais da pele, mucosas e outros sítios. Os cocos Gram-positivos produzem uma variedade de doenças, incluindo foliculite, furúnculo, carbúnculo, erisipela e celulite (estreptococos), além de pneumonia e bacteremia (pneumococos). Portanto, o isolamento e identificação desses microrganismos, a partir de amostras clínicas, sempre deve ser correlacionado com o quadro clínico do paciente.

MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizados os seguintes materiais: Swab Bico de bunsen Meios de cultura ágar sangue, Mueller Hinton, ágar DNAse, ágar manitol Amostras biológicas Alça de platina Agulha de platina Pinça Lâmina Cristal violeta Lugol Álcool etílico 95% Fucsina Gram Óleo de imersão Microscópio ótico Peróxido de hidrogênio Tubos de ensaio contendo plasma de coelho Solução salina Discos de antibióticos (novobiocina, bacitracina e optoquina) Tubos contendo ágar bile esculina, caldo NaCl a 6,5% Coloração de Gram Foi feito um esfregaço do material em duas lâminas. Na primeira, foram utilizadas três colônias diferentes do meio ágar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colônia do ágar manitol e uma colônia do ágar MacConkey. Deixar secar ao ar. Após isso, deve-se fixar o material na lâmina, passando-a três a quatro vezes através da chama do bico de bunsen, de modo que o material não seja removido durante o procedimento durante o procedimento de coloração. Coloca-se a lâmina sobre um suporte para coloração e cobrir a superfície com solução de cristal violeta. Após um minuto, lavar bem com água destilada. Cobrir o esfregaço com solução de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com água destilada. Sustenta-se a lâmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfície do esfregaço com álcool

durante alguns poucos segundos. Lavar com água corrente e colocar novamente a preparação sobre suporte para coloração. Adiciona-se fucsina de Gram durante um minuto e lavar com água corrente. Coloca-se a lâmina em posição vertical deixando que o excesso de água escorra e o esfregaço seque. Examinar o esfregaço com óleo de imersão na objetiva de 100x no microscópio óptico. Provas Bioquímicas Produção de catalase: Colocar 2mL de água oxigenada (H2O2) em um tubo de ensaio. Utilizando um swab estéril, tocar na colônia de cocos Gram-positivos e mergulhar no tubo contendo H2O2. Se houver formação de bolhas a reação é positiva; se não formar, a reação é negativa. Produção de coagulase: Tocar em 2-3 colônias com a alça de platina flambada e fria e introduzir em tubo de ensaio contendo 1mL de plasma de coelho. Homogeneizar bem e incubar em estufa microbiológica à 37ºC. Fazer a primeira leitura com uma hora de incubação e de hora em hora, até quatro horas. Se negativo, fazer nova leitura com 24 horas. Se houver formação de coágulo, o teste é positivo; se não, o teste é negativo. Crescimento em ágar manitol salgado: Esta prova é confirmatória para as bactérias da espécie S. aureus. Tocar as colônias com alça e semear em placa contendo meio ágar manitol salgado. Incubar a placa em estufa microbiológica à 35-37ºC por 18-24 horas. A espécie S. aureus é capaz de crescer e fermentar o manitol presente no meio, modificando a cor do mesmo que originalmente era rosa para amarelo. Presença de DNAse: Esta prova também é confirmatória para as bactérias da espécie S. aureus e testa a capacidade da bactéria de produzir a enzima denominada DNAse, capaz de digerir o DNA. Semear 2 a 3 colônias da bactéria no centro do ágar DNAse. Incubar à 35-37ºC por 18-24 horas. Proceder à leitura adicionando HCl. Se as colônias produzirem DNAse, ao adicionar o HCl este precipitará o DNA restante no ágar, tornando o meio opaco e ao redor das colônias será formado um halo transparente. Sensibilidade à Novobiocina: Fazer uma suspensão bacteriana em tubo contendo salina. A turvação deve ser semelhante ao tubo 0,5 da escala de MacFarland. Umedecer um swab estéril na suspensão bacteriana e semear uniformemente em placa contendo ágar Mueller Hinton. Em seguida, utilizando uma pinça, colocar um disco de Novobiocina no centro da placa. Fixar o disco comprimindo-o em direção ao meio. Incubar a placa em estufa microbiológica à 35-37ºC. A leitura é feita com 24 horas; se houver um halo de inibição do crescimento ao redor do disco de Novobiocina, a bactéria é considerada sensível; se não houver formação de halo, a bactéria é considerada resistente. Prova de CAMP: Em placa de ágar sangue, fazer uma estria central com bactérias da espécie S. aureus hemolítica usando a alça de platina flambada e, em seguida, fazer estrias perpendiculares à estria central com bactérias do gênero Streptococcus a ser identificada. A prova é considerada positiva quando são formadas regiões de hemólise em formato de seta próximo ao crescimento das duas espécies. Sensibilidade à Optoquina e Bacitracina: Fazer uma suspensão bacteriana em tubo contendo salina. A turvação deve ser semelhante ao tubo 0,5 da escala de MacFarland. Semear a placa de ágar sangue com swab estéril umedecido na suspensão em toda a superfície da placa, uniformemente. Com o auxílio de uma pinça, colocar os discos de optoquina e bacitracina na placa. Tomar o cuidado de não colocá-los muito próximos um do outro e nem próximos à borda da placa. Incubar em estufa microbiológica a 37ºC por

18-24 horas. Caso haja a formação de um halo ao redor do disco de optoquina, a bactéria pertence provavelmente a espécie S. pneumoniae; caso o halo se forme ao redor do disco de bacitracina, provavelmente é um estreptococos ß-hemolítico do grupo A. Crescimento em meio Bile-esculina e NaCl a 6,5%: Com a agulha de platina, tocar a colônia suspeita e introduzir em ágar Bile-esculina. Para o caldo de NaCl, tocar a colônia com alça e homogeneizar bem a bactéria no meio líquido. Incubar ambos em estufa microbiológica a 35-37ºC por 18-24 horas. Para o meio bile-esculina, o teste é considerado positivo se o meio ficar enegrecido. Para o caldo NaCl, o teste é positivo caso haja turvação e mudança de cor do meio.

RESULTADOS Analisando-se a lâmina, observou-se cocos Gram-positivos. Iniciou-se a bateria de testes bioquímicos para duas bactérias diferentes. Primeiro Teste Teste da catalase: Houve formação de bolhas, caracterizando um teste positivo. Com isso confirma-se o diagnóstico de Estafilococos e passa a ser feita identificação do gênero. Prova da coagulase: Houve formação de coágulo, sendo um teste positivo, indicando Staphylococcus aureus. Teste em ágar manitol salgado: Houve crescimento neste meio, indicando teste positivo. Presença de DNAse: Houve produção de DNAse, indicando teste positivo. O diagnóstico é provavelmente de Staphylococcus aureus. Segundo Teste Teste da catalase: Não houve formação de bolhas, caracterizando um teste negativo. Com isso confirma-se o diagnóstico para Estreptococos ou Enterococos. Teste do NaCl: Houve turvação e mudança de cor do meio, sendo um teste positivo Teste da bile-esculina: Não houve enegrecimento do meio, sendo um teste negativo. Sensibilidade à Optoquina e Bacitracina: Não houve formação de halo ao redor dos discos de antibióticos, caracterizando resistência. Teste de CAMP: Não houver formação de áreas com hemólise, caracterizando um teste negativo. O diagnóstico é provávelmente de Streptococcus agalactiae.

DISCUSSÃO S. aureus é, sem dúvida, o patógeno humano mais importante entre os estafilococos. É encontrado no ambiente externo e em narinas anteriores de 20% a 40% dos adultos. Outros sítios de colonização incluem pregas cutâneas, períneo, axilas e vagina. Embora esse microrganismo possa fazer parte da microbiota humana normal, pode produzir infecções oportunistas importantes em condições apropriadas. De acordo com o observado na lâmina, a positividade do teste da catalase foi suficiente para classificar o gênero como sendo Staphylococcus. Após o teste da coagulase identificar o microrganismo como S. aureus, os testes em ágar manitol salgado e DNAse foram apenas confirmatórios, devendo o teste de Novobiocina ser ignorado para esta espécie. S. agalactiae é a principal causa de doença nos períodos neonatal e perinatal. Em mulheres, o microrganismo coloniza vagina e reto, e a colonização vaginal assintomática é observada em 5% a 35% das mulheres grávidas. Na realidade, a colonização da vagina

pode representar contaminação retal, sendo o trato gastrintestinal o principal reservatório desse microrganismo. O recém-nascido é colonizado por transmissão vertical, seja no útero ou durante o parto, a partir da mãe portadora. Entre os lactentes colonizados, a doença pode aparecer em um a quatro deles para cada 1.000 nascidos vivos. Na maioria, são beta-hemolíticos, mas por vezes também são alfa-hemolíticos, pelo que não podemos usar hemólise para pesquisar os S. agalactiae. De acordo com o observado na lâmina, a negatividade do teste da catalase não foi suficiente para classificar o gênero do microrganismo, podendo este ser Streptococcus ou Enterococcus. O diagnóstico de S. agalactiae deu-se primeiramente pela presença de incompatibilidade nos testes de NaCl e bile-esculina, eliminando a possibilidade de ser do gênero Enterococcus sp. ou outros Estreptococos sp. Prosseguindo-se para o teste da optoquina e bacitracina, mostrando que esse microrganismo é resistente a ambos antibióticos. O que separaria S. agalactiae de dos alfa hemolíticos ( S. viridans e S. pneumoniae) seria a positividade do teste de Camp, cujo o resultado foi negativo, provavelmente devido à interferência do sangue utilizado no teste.

BIBLIOGRAFIA 1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. 2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI, 2001 3. Microbiologia – Streptococcus. Disponível em: . Acesso em: 13 nov. 2009 4. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. Disponível em: . Acesso em: 13 nov. 2009

Universidade Federal do Triângulo Mineiro Departamento de Ciências Biológicas Disciplina de Microbiologia Aplicada Relatório de Prática

BACTERIOSCOPIA

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009

OBJETIVO Analisar lâminas contendo microrganismos corados por Gram.

INTRODUÇÃO A morfologia dos microrganismos só pode ser observada ao microscópio. Mas, devido ao seu reduzido tamanho e ao seu índice de refração muito próximo do índice de refração da água, não é fácil sua observação microscópica. Sendo também, em geral, não pigmentados, a observação microscópica só se torna possível aumentando o contraste entre o meio envolvente e o conteúdo celular. Para o preparo de um bom esfregaço para exame bacterioscópico, deve-se seguir normas padronizadas para que os esfregaços sejam bem feitos. O Setor de Microbiologia, depois de corar as lâminas, tem de observar uma grande extensão destas para conclusão do diagnóstico. Para permitir o estudo das propriedades das bactérias e classificá-las em grupos para efeitos de diagnóstico, várias colorações biológicas e procedimentos específicos foram desenvolvidos. Das colorações há duas que são de interesse fundamental em Bacteriologia Médica, a coloração de Gram e a coloração de ZiehlNeelsen.

MATERIAIS E MÉTODOS Microscópio Óptico Óleo de imersão Lâminas preparadas pela coloração de Gram Nesta prática deve-se observar as laminas ao microscópio óptico, contendo as bactérias isoladas, e identificá-las de acordo com seu comportamento tintorial e sua morfologia.

RESULTADOS Foram observadas dez lâminas: 1.Análise de liquor, foi isolado Neisseria meningitidis. Diplococos Gram negativos. 2.Secreção vaginal (vaginose), observa-se Clue Cells, envolvida por Coco bacilos Gram positivos, provavelmente Gardnerella sp. 3. Secreção oral, Streptococcus sp. 4.Neisseria sp., diplococos no citoplasma da célula. 5.Secreção vaginal normal. Presença de lactobacilos (de cor roxa) – Flora Doderlaine 6.Secreção vaginal (Candida). Presença de células do epitélio vaginal com bactérias e em evidencia da Candida, que possui uma tamanho bem acentuado. 7.Fezes (normal), pode-se observar todos os tipos de microrganismos, tanto bacilos quanto cocos, gram positivos e negativos. 8.Líquido sinovial, observa-se cocos Gram positivos 9.Líquido pleural, observa-se Streptococcus pneumoniae (Pneumococos) 10.Secreção de lesão genital, observa-se bacilos gram negativos possivelmente Haemophilus ducrey.

DISCUSSÃO A realização da prática de bacterioscopia teve como fundamento principal proporcionar conhecimento sobre os aspectos de microrganismo comumente encontrados em diferentes secreções do organismo humano. As lâminas de microbiotas normais foram utilizadas para evidenciar que nem toda estrutura do organismo é estéril, e que podem alojar microrganismos que ao migrar para outras regiões, produzem infecções de intensidades que vão de leve a grave. No caso da meningite a bacterioscopia agrupa morfológica e tintorialmente os agentes, permitindo sua classificação com pequeno grau de especificidade (bacilos Grampositivos, bacilos Gram-negativos, diplococos Gram-positivos, diplococos Gram-negatvos, bacilos álcool–ácido resistentes, leveduras, etc. Pode ser realizada no líquor ou no raspado de pele (na presença de lesões ou sufusões hemorrágicas) e escarro. Na flora vaginal de mulheres normais são comumente isoladas: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus fecalis, Lactobacillus sp, Corynebacterium sp, E. coli, Bacteroides fragilis, Fusobacterium sp, Veillonella sp, Peptococcus sp, Peptostreptococcus sp. além de Staphylococcus aureus , Streptococcus sp (Grupo B - β hemolítico), Clostridium perfringens, Proteus, Klebsiella. E podem encontrar organismos potencialmente patogênicos como Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes. Na bacterioscopia o ambiente vaginal pode ser classificado: PADRÃO I = EQUILÍBRIO DO ECOSSISTEMA •90 a 95% de flora de Doderlein; •5 a 10% de outras bactérias e •Ausência ou raros polimorfonucleares(PMN) PADRÃO II = DESEQUILÍBRIO MODERADO DO ECOSSISTEMA •50% de flora de Doderlein; •50% de outras bactérias e •Moderada quantidade de PMN PADRÃO III = DESEQUILÍBRIO INTENSO DO ECOSSISTEMA •Flora de Doderlein praticamente ausente; •Quase 100% de outras bactérias e •PMN abundantes PADRÃO IV = COMPATÍVEL COM VAGINOSE BACTERIANA •Flora de Doderlein ausente •Proliferação de bactérias aeróbias e anaeróbias (G. vaginalis) •PMN raros PADRÃO VI - presença de Trichomonas vaginalis PADRÃO VII - presença de fungos do gênero Candida O Líquido Sinovial (LS) é um ultrafiltrado do plasma, acrescido de ácido hialurônico sintetizado por sinoviócitos do tipo B. Suas principais funções são as de promover a lubrificação da articulação, o amortecimento de impactos e nutrir a cartilagem articular. As principais alterações encontradas no LS seriam decorrentes de traumas, presença de corpo estranho (cristais/bactérias) e inflamação primária da sinóvia. A não-utilização da análise laboratorial do LS, nestes casos, aumentaria o erro diagnóstico em 25% Bacterioscopia: Gram: positivo em cerca de 50% dos casos de Artrite Infecciosa. Nos casos de etiologia estafilocócica pode chegar a 75%, enquanto que nas Artrites Gonocócicas é positivo em apenas 25% dos casos; BAAR: positividade baixa, em torno de 20% dos casos; PAS: também possui baixa positividade. Em todo o mundo, o Streptococcus pneumoniae é o mais freqüente agente etiológico de infecções adquiridas na comunidade que acometem o sistema respiratório e

está associado com 3 a 5 milhões de mortes por ano. Nos EUA, é responsável por 500.000 casos anuais de pneumonia, 50.000 casos de bacteremia, 3.000 casos de meningite e cerca de 7 milhões de casos de otite média aguda. Haemophilus ducreyi é bacilo Gram-negativo, intracelular, anaeróbico facultativo, com dimensões de um a 2µm por 0,5µm, com extremidades arredondadas e desprovido de cápsula ou motilidade. Dispõe-se em cadeias simples ou duplas no interior de polimorfonucleares. Seu cultivo é difícil, crescendo moderadamente em meios de ágarchocolate. É responsável pela doença sexualmente transmissível cancro mole, caracterizada clinicamente pela presença de ulcerações dolorosas, em número variado, de bordas irregulares e frequentemente envoltas por halo eritematoso vivo, localizadas em região genital, anal ou anogenital, acompanhadas ou não de adenopatia satélite.

BIBLIOGRAFIA 1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. 2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI, 2001 3. PORTAL DE GINECOLOGIA - Vulvovaginites. Disponível em: . Acessado em: 15 nov. 2009 4. SINÓVIANÁLISE: Guia prático. Disponível em: . Acessado em: 15 nov. 2009 5. MENINGITES – Manual de Instruções Critérios de Confirmação e Classificação. Disponível em: . Acessado em: 15 nov. 2009 6. ZETTLER, Eduardo Walker. A reação em cadeia da polimerase na detecção da resistência à penicilina em Streptococcus pneumoniae. J. bras. pneumol. vol.30 no.6 São Paulo Nov./Dec. 2004 7. JUNIOR, W. B.; SHIRATSU, R.; PINTO, V. Abordagem nas doenças sexualmente transmissíveis. An. Bras. Dermatol. vol.84 no.2 Rio de Janeiro Mar./Apr. 2009

Universidade Federal do Triângulo Mineiro Departamento de Ciências Biológicas Disciplina de Microbiologia Aplicada Relatório de Prática

ANTIBIOGRAMA

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009

OBJETIVO Determinar o perfil de sensibilidade a antimicrobianos de amostras de cocos Grampositivos (Staphylococcus e Enterococcus), pelo teste de disco difusão; Determinar o valor da concentração inibitória mínima (CIM) para a vancomicina, pelo teste de diluição em caldo;

INTRODUÇÃO O antibiograma é um teste que oferece como resultado padrões de resistência ou susceptibilidade de uma bactéria específica a vários antimicrobianos (antibióticos ou quimioterápicos). Seu objetivo é tanto a análise do espectro de sensibilidade/resistência a drogas de uma bactéria quanto a determinação da concentração mínima inibitória, esta é definida como a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que impede crescimento visível de um microorganismo no teste de sensibilidade por diluição em ágar ou caldo. A técnica de disco-difusão (Kirby-Bauer) e de diluição em caldo são exemplos de testes de sensibilidade e resistência a antimicrobianos. Para esses testes deve ter padronização do meio de cultura, inóculo (escala 0,5 Mc Farland – 108 bactérias/mL) e antimicrobianos. Estes últimos são de acordo com a bactéria isolada e é fornecido pelo Manual do Clinical and Laboratory Sandards Institute (CLSI)/NCCLS. Nele pode-se identificar os grupos de drogas sugeridas para os antibiogramas. Os antimicrobianos são divididos em classes: beta-lactâmicos, aminoglicosídeos, glicopepitídeos e macrolídeos. Para obter um teste de qualidade, deve-se observar a espessura do ágar na placa, o caldo na microdiluição e macrodiluição, pH, estocagem apropriada das placas, discos, drogas e soluções estoques dos antimicrobianos e temperatura de incubação. A técnica de disco-difusão é a mais utilizada, padronizada pelo CLSI, é realizada no ágar Müeller-Hinton ou sangue. Esta técnica ainda possibilita a flexibilidade na escolha dos discos, é de baixo custo, fácil execução e interpretação e tem ainda boa reprodutibilidade. É um teste qualitativo, dando como resultado se o microorganismo é sensível, intermediário ou resistente. È necessário ainda para realizar a técnica: o inóculo, os discos impregnados com antimicrobiano e a difusão da droga. A ausência do halo de inibição indica que o microorganismo é resiste a tal antimicrobiano. A presença do halo de inibição indica que o microorganismo pode ser sensível, intermediário ou resistente, dependendo do tamanho deste halo. A técnica de diluição em caldo é a considerada “padrão ouro”, no Brasil é pouco utilizado, é de baixo custo, difícil execução e também é padronizada pelo CLSI. Para realizá-la deve-se determinar a CIM (Concentração inibitória mínima), dada em µg/mL. Este método é quantitativo (breakpoints), dando como resultado que o microorganismo pode ser sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano.

MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizados os seguintes materiais: Cultura axênica dos microrganismos em meio sólido Tubos de ensaio contendo soro fisiológico estéril Tubo nº0,5 da escala de Mc Farland Swab Bico de bunsen

Placas de Petri com ágar Mueller Hinton Alça de platina Pinças estéreis Discos de antibióticos Tubos de ensaio contendo caldo Mueller Hinton estéril Solução estoque aquosa de vancomicina Pipetas automáticas Ponteiras estéreis Estufa microbiológica Tabelas de sensibilidade/resistência a antimicrobianos (CLSI) Teste de Disco Difusão Faz-se uma suspensão bacteriana, a partir da cultura de bactérias, com turvação semelhante ao tubo nº0,5 da escola Mc Farland (aproximadamente 108 bactérias/mL). Posteriormente, utilizando um swab, inocular a suspensão na superfície da placa de ágar Mueller Hinton, passando o swab em toda a superfície do ágar e, posteriormente, repetese o procedimento outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60º. Após a placa secar, coloca-se os antimicrobianos sob a superfície da placa com a pinça flambada e fria, pressionando-os levemente contra a superfície do meio, sendo a distância entre eles de 24mm, conforme figura abaixo:

http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/practi/antibio1.jpg

A placa é incubada a 35-37ºC por 16-18 horas em estufa microbiológica. Após esse tempo, mede-se o halo formado e é feita a classificação dos microrganismos. Teste de Diluição em Caldo Faz-se uma diluição seriada da solução estoque de vancomicina, transferindo 975µL da mesma para o tubo de ensaio nº1 (concentração final de 256µg/mL do antimicrobiano) contendo 975µL de caldo Mueller Hinton. Homogeniza-se e transfere 975µl do tubo nº1 para o tubo seguinte (nº2) e assim por diante. Desprezar 975µL do último tubo (concentração final de 0,5µg/mL). Posteriormente, adiciona-se 25µL de suspensão bacteriana semelhante ao tubo nº0,5 da escala de Mc Farland ( aproximadamente 108 bactérias/mL) em cada um dos tubos contendo diferentes

concentrações da droga. Faz-se também, um controle positivo (25µL de suspensão bacteriana em 975µL de caldo Mueller Hinton, para ser o controle de crescimento da bactéria) e um negativo (1000µL de caldo Mueller Hinton em um tubo de ensaio estéril, para ser o controle de esterilidade do caldo). A incubação é feita por 24 horas a 35-37ºC em estufa microbiológica. Após esse tempo, observa-se o crescimento bacteriano nos tubos. A concentração inibitória mínima (CIM) é a menor concentração de agente antimicrobiano que inibe completamente o crescimento dos microrganismos nos tubos. Posteriormente, classifica-se o microrganismo em sensível, intermediário ou resistente.

RESULTADOS O antibiograma foi utilizado para uma espécie de Enterococcus. O teste de disco difusão foi feito utilizando os seguintes antimicrobianos: Oxaciclina, Penicilina, Azitromicina, Clindamicina, Vancomicina, Claritromicina, Eritromicina e Sulfazotrim (Sulfametoxazol e Trimetoprim). Foram encontrados os seguintes resultados:

Bactéria Antimicrobiano, Concentração e Sigla Oxaciclina – OXA – 1mcg Penicilina – PEN – 10mcg Azitromicina – AZI – 15mcg Clindamicina – CL – 2mcg Vancomicina – VC – 30mcg Claritromicina – CLA – 15mcg Eritromicina – ERI – 15mcg Sulfazotrim – SFT – 25mcg

Tamanho do halo Resultado (mm) 23 15 22 30 19 27 27 28

S R S S S S S S

Para o teste de diluição em caldo, a concentração inibitória mínima de vancomicina encontrada foi de 4µg/mL. È importante destacar que em um dos grupos a concentração inibitória mínima encontrada foi de 32 µg/mL. Significando resistência a vancomicina.

DISCUSSÃO Enterococcus são cocos Gram-positivos que geralmente se dispõem em pares e cadeias curtas. Freqüentemente, a morfologia microscópica destes microrganismos não pode ser diferenciada de algumas espécies de Streptococcus. Enterococcus são anaeróbios facultativos e a temperatura ótima de crescimento é 35°C, embora a maioria dos microrganismos se desenvolva entre 10 e 45°C. Apresentam crescimento rápido em meios de cultura suplementados com sangue, produzindo colônias brancas após 24 horas de incubação. As colônias são, em geral, não hemolíticas, mas podem ser alfa ou betahemolíticas. Enterococcus podem ser cultivados na presença de altas concentrações de sal (NaCl a 6,5%), toleram sais biliares a 40% e podem hidrolisar a esculina. Estas propriedades básicas podem ser utilizadas para distinguir enterococos de outros cocos Gram-positivos, catalase negativos. São necessários testes fenotípicos selecionados, como por exemplo: reações de fermentação, hidrólise da pirrolidonil-beta-naftilamida, motilidade, produção de pigmento para diferenciar as espécies de enterococos

Enterococcus sp. são comensais do trato intestinal humano e de outros animais, mas também são causadores de infecções nosocomiais e de endocardite subaguda. Durante as duas últimas décadas, a resistência a drogas entre os cocos Gram-positivos tem aumentado. A emergência de enterococos multirresistente é um desafio à terapia, que tem sido paralelo à ocorrência de enterococcus resistentes a vancomicina (VRE) pela primeira vez relatado em 1988. Desde então, resistência à teicoplanina e/ou vancomicina começou a aparecer em todo o mundo. VRE freqüentemente expressa resistência adicional a múltiplos antibióticos, incluindo ampicilina e aminoglicosídeos, incluindo resistência a altos níveis de gentamicina e estreptomicina. Devido ao aumento da resistência a antimicrobianos, tem-se direcionado atenção ao desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos, como quinupristina-dalfopristina e linezolida. No entanto, pouco após a aprovação destes dois medicamentos, bactérias resistentes começaram a ser encontradas. Em geral, tem sido relatado que quinupristina-dalfopristina possui atividade inibitória contra E. faecium, incluindo os VRE que são resistentes a outros agentes clinicamente disponíveis.

BIBLIOGRAFIA 1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. 2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI, 2001 3. Camargo, Ilana L. B. Cunha. Estudo dos fatores de virulência em Enterococcus sp. isolados no Brasil. Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia, área de concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia,Curso de Doutorado. Ribeirão Preto, 2005.

Universidade Federal do Triângulo Mineiro Departamento de Ciências Biológicas Disciplina de Microbiologia Aplicada Relatório de Prática

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS (BGN)

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009

OBJETIVO Isolar e identificar e espécies os Bacilos Gram-negativos mais comuns isolados em seres-humanos, a partir de processos bioquímicos empregados em testes de identificação de bacilos Gram-negativos.

INTRODUÇÃO Os bacilos Gram-negativos pertencentes às Enterobacteriaceae são as bactérias isoladas com mais freqüência de amostras biológicas. Distribuídos amplamente na natureza, esses microrganismos são encontrados no solo, água, plantas e no trato intestinal de seres humanos e animais. Portanto, os membros dessa família podem ser suspeitos em virtualmente qualquer tipo de doença infecciosa e isolados de qualquer amostra recebida no laboratório. As Enterobactérias são bacilos anaeróbios facultativos e não produtores de esporos, são fermentadores de glicose e produtores de endotoxinas e exotoxinas, além de serem citocromo oxidase negativa. Devido ao grande número de espécies, uma bateria de provas bioquímicas deve ser feita, afim de caracterizar definitivamente um membro.

MATERIAIS E MÉTODOS Bico de Bunsen Alça de platina Agulha de Platina Pinça Placas contendo meio ágar MacConkey Tubos contendo meio de identificação bioquímica O/F TSI ( Tríplice açúcar e ferro) SIM (sulfeto-indol-motilidade) Uréia de Christensen Citrato de Simmons Fenilalanina Caldo Descarboxilase de Moeller (lisina, ornitina, arginina) Voges-Proskauer (VP) Vermelho de Metila (VM) Óleo Mineral estéril Estufa microbiológica Tabelas de Identificação Provas Bioquímicas: Fermentação da lactose - Bacilos islados da urina são cultivados em meio MacConkey, e observar se estas colonias conseguem utilizar a lactose presente no meio e produzir colônias róseas (fermentadoras de lactose) ou colônias transparentes (não fermentadoras de lactose). Prova da Oxidação-Fermentação (OF) da glicose – O meio OF é usado para determinar se um organismo pode sintetizar carboidratos de forma oxidativa ou fermentativa. Microrganismos sacarolíticos degradam a glicose através de fermentação ou oxidação. O produto final da fermentação é uma mistura de ácidos orgânicos. Entretanto, a quantidade de ácidos formados pela degradação oxidativa da glicose é pequena, quando comparada

com a fermentação. Portanto, para a detecção, é necessário que a reação se dê no meio de Hugh e Leifson (Meio OF). O meio OF difere dos meios de fermentação de carboidratos, por apresentar uma concentração de peptona de 0,2%, concentração de carboidratos de 1% e concentração de ágar de 0,3% (semi-sólido). A baixa relação entre proteínas e carboidratos reduz a formação de aminas alcalinas, que podem neutralizar a pequena quantidade de ácidos fracos formados pelo metabolismo oxidativo. A maior quantidade de carboidratos aumenta a quantidade de ácidos que pode ser potencialmente produzidos. O meio OF pode ser usado como um teste simples de utilização de glicose pela via oxidativa, assim como para outros carboidratos: lactose, maltose, sucrose, xilose e frutose. As reações positivas são indicadas por uma coloração amarela, evidenciada pelo indicador azul de bromotimol, que se torna amarelo em meio ácido. Uma coloração verde ou azul esverdeado indica uma reação negativa. O teste para glicose é feito em duplicata, e em um dos tubos o meio é recoberto com óleo mineral. A bactéria será considerada: oxidativa, se produzir ácido apenas no tubo sem óleo (exposto ao ar); fermentadora, se produzir ácido em ambos os tubos; e assacarolítica, se ambos os tubos permanecerem com pH alcalino após a incubação. Procedimento: com agulha de platina, flambada e fria, tocar em uma colonia da bactéria Gram-negativa. Introduzir a agulha até ¾ dos dois tubos de ensaio contendo meio OF-glicose semi sólido. Um dos tubos é mantido aberto enquanto no outro deve ser adicionado uma camada de óleo mineral estéril. O teste é considerado positivo quando o meio muda a cor de verde para amarelo. Os organismos oxidativos irão produzir reação ácida somente no tubo aberto, mantendo o tubo fechado inalterado. Já aqueles que são fermentativos, irão produzir reação em ambos os tubos.

Prova de glicose/lactose (ágar TSI) – O ágar Tríplice Açúcar é um meio empregado na triagem de enterobactérias. O meio é enriquecido pela incorporação de quatro compostos protéicos, possibilitando um bom crescimento bacteriano. É um meio sólido e inclinado (base e ápice) em tubo, que originalmente é de cor vermelha. Ele contém glicose (0,1%), lactose (10%) e sacarose (10%), citrato férrico entre outras substâncias. É utilizado para determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar carboidratos específicos existentes no meio básico com ou sem produção de gás ou H2S. • Fermentação da glicose: a concentração de glicose no meio é de apenas 0,1%, obtendo-se assim uma quantidade relativamente pequena de ácido. Inicialmente, todo o meio torna amarelo devido à degradação da glicose. Após algumas horas, os microrganismos começam a decompor oxidativamente a peptona, produzindo uma alcalinização na superfície do meio. No fundo do tubo, a degradação protéica é insuficiente para reverter o pH ácido estabelecido, e o meio mantém-se amarelo. Todas as enterobactérias fermentam a glicose. • Fermentação da lactose e da sacarose: o meio possui uma concentração maior desses açúcares (10%), permitindo que as bactérias que utilizam a lactose, com ou sem sacarose, produzam quantidades relativamente altas de ácido, suficiente para superar a reação alcalina desenvolvida na superfície do meio. O tubo permanece totalmente com coloração amarela. O indicador de pH do meio é o vermelho de fenol. • Produção de gás: ocorre formação de gás devido à degradação de moléculas de ácido fórmico, sendo evidenciado pelo aparecimento de bolhas ou rachaduras no meio.

• Produção de H2S: é evidenciada pelo aparecimento de um precipitado de coloração negra (sulfeto de ferro), proveniente da reação do H2S com o citrato férrico amoniacal contido no meio. Procedimento: BGN é inoculado nesses meios com uma agulha de platina que deve ser introduzida até quase o final do tubo. Após semeadura, estriar a superfície inclinada do ágar. Prova H2S - Em meio SIM o BGN é inoculado com uma agulha de platina até o fim do tubo sem encostar na parede do tubo. Observa-se a produção de H2S quando altera a coloração do tubo de inalterado para preto. Prova Indol – Em meio sim semeia-se a colônia de BGN, e após o crescimento adicionase o reagente de Kovac´s (cor amarela) ao longo das paredes do tubo de modo q não se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição de do reagente, são indol positivas. Prova da Motilidade – No Meio ágar SIM inocula-se em linha reta o BGN, com uma agulha de platina ate ¾ do tubo. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se na linha de inoculação, turvando o meio. Enquanto que motilidade negativa o crescimento só será na zona da picada. Prova do Citrato – O ágar Citrato de Simmons é um meio sólido e inclinado, em tubo, de cor originalmente verde. Citrato de sódio é um composto orgânico simples encontrado como um dos metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs). Algumas bactérias podem obter energia utilizando o citrato como única fonte de carbono. Esta característica é importante para a identificação de alguns membros de Enterobacteriaceae: E. coli é citrato negativo, enquanto as espécies de Enterobacter e Klebsiella são positivas. O meio a ser empregado para o teste inclui citrato de sódio e fosfato de amônia como única fonte de carbono e nitrogênio e deve ser isento de proteínas e carboidratos. As bactérias que produze a enzima citrase conseguem utilizar o citrato como única fonte de carbono e utilizam o nitrogênio do sal de amônio produzindo amônia, alcalinizando o meio. O indicador utilizado é azul de bromotimol, que em pH ácido é amarelo e em pH alcalino é azul. Caso a bactéria consiga utilizar o citrato o meio que era verde tornará azul devido a alcalinização. Caso isso não aconteça, o meio permanecerá verde (citrato negativo). Procedimento: No meio inclinado de Ágar Citrato de Simmons, inocula-se o BGN com agulha de platina em linha reta. Após a incubação, as culturas citrato positivas são identificadas pela presença de crescimento, na superfície da rampa, acompanhada de coloração azul no meio da cultura.

Prova do citrato

Prova da Uréia – O ágar Uréia de Chirstensen é um meio sólido e inclinado em tubo, de cor amarela. A urease é uma enzima que hidrolisa a uréia em amônia e dióxido de

carbono. A reação é utilizada na identificação de bactérias produtoras de urease. A amônia é um produto que alcaliniza o meio levando a um aumento do pH e, em conseqüência, uma mudança de coloração do indicador de pH. Em laboratórios clínicos, são utilizados rotineiramente dois meios para identificação da urease: caldo Stuart e ágar de Christensen. Quando acontece a viragem do pH devido a presença da enzima o meio passa a ter coloração rosa por meio do indicador de pH vermelho de fenol. Procedimento: é semeado com alça bacteriológica, onde uma porção do crescimento bacteriano é transportada paro o meio e semeada em estrias no ápice.

Prova da urease

Prova da Fenilalanina – Este meio é sólido e inclinado em tubo. Tem cor originalmente bege. A desaminação de fenilalanina forma ácido fenilpirúvico. Dentre os membros da família Enterobacteriaceae, apenas as espécies de Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima necessária para a desaminação de fenilalanina. O teste consiste na detecção de ácido fenilpirúvico, após crescimento do microrganismo em meio contendo aminoácido. O aparecimento de uma coloração verde escura após a adição de uma solução de cloreto férrico a 10% (três a cinco gotas) indica resultado positivo. Procedimento: Inocular a bactéria em ágar fenilalanina e, após incubação a 35ºC por 1824horas, adicionar 4 a 5 gotas de reagente de cloreto férrico. O desenvolvimento de uma intensa cor verde, indica uma prova positiva.

Prova da fenilalanina

Caldo base de Moeller (Prova da utilização dos aminoácidos) - A prova consiste em três tubos contendo como base o caldo descarboxilase de Moeller e fechado com óleo mineral. Em cada um dos tubos é adicionado um aminoácido diferente (lisina, arginina e ornitina), para detecção de enzimas específicas para estes substratos. A enzimas descarboxilases hidrolisam o grupo carboxil (COOH) de aminoácidos, formando aminas alcalinas e dióxido de carbono. A reação é específica, cada aminoácido é descarboxilado por uma enzima particular. Lisina e ornitina são os aminoácidos testados rotineiramente

na identificação de Enterobacteriaceae. A lisina é descarboxilada em cadaverina e a ornitina em putrescina. A reação se dá em anaerobiose. O meio contém o indicador de pH púrpura de bromocresol, que em pH ácido é amarelo e em pH alcalino é púrpura. Quando a bactéria é adicionada, ela quebra a dextrose presente e acidifica o meio, mudando a cor de roxo para amarelo-esverdeado. Este meio ácido estimula a atividade das descarboxilase (caso a bactéria o tenha) que quebram os aminoácidos, produzindo substâncias diferentes. Tudo isso eleva o pH do meio, mudando a cor novamente para roxo. Logo, o teste é considerado positivo se, após o período de incubação, apresentar cor roxa (púrpura). Se a bactéria não produz as descarboxilase, o meio fica amarelo. Por isso a necessidade de um tubo branco para poder fazer a comparação das cores sendo este da cor original do meio. Procedimento: Inocular a bactéria no caldo base de Moeller em quatro tubos (um para controle, um para arginina, um para ornitina e outro para lisina) e adicionar 1mL de óleo mineral. Após a incubação, se for positiva, o tubo controle encontra-se amarelo e os tubos contendo aminoácidos encontram-se púrpuras. Prova do Vermelho de Metila (VM) – um meio líquido e amarelado em tubo. É um teste quantitativo para identificar espécies bacterianas que produzem ácidos orgânicos (láctico, acético e fórmico) a partir da fermentação da glicose, visto que as bactérias que seguem a via de fermentação de ácidos mistos produzem ácidos suficientes para manter o pH abaixo de 4,4 (cor vermelha). Muitas espécies de Enterobacteriaceae utilizam essa via de fermentação da glicose. A formação desses ácidos pode ser detectada pelo indicador vermelho de metila, que tem seu ponto de viragem no pH 4,4. Escherichia coli apresenta teste VM positivo, enquanto Enterobacter aerogenes, VM negativo. Procedimento: Semear o caldo com um cultivo puro do microrganismo e incubar a 35ºC por 48-72 horas. Após incubação, adicionar 5 gotas de reagente de vermelho de metila. O desenvolvimento de uma cor vermelha estável na superfície do meio, indica uma prova positiva. Prova de Voges-Prouskauer (VP) – É um meio líquido em tubo, de cor amarelada (meio de Clark-Lubs). Uma outra via de fermentação de glicose que as bactérias podem utilizar é a via de acetoína (acetil metil carbinol). O ácido pirúvico é formado pela degradação fermentativa da glicose (via Embdem-Myerhoff) e é metabolizado pela via de butileno glicol, em acetoína , um produto final neutro. O acetil é convertido em diacetil, pela ação de hidróxido de potássio a 40% e oxigênio atmosférico. O diacetil é convertido em um complexo vermelho pela ação catalítica de α-naftol e creatina. Espécies dos gêneros Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia produzem acetoína e apenas pequenas quantidades de ácidos mistos, que podem ser insuficientes para diminuir o pH do meio de vermelho de metila. Procedimento: semear o caldo com u cultivo puro do microrganismo e incubar a 35ºC por 24 horas. Em seguida, adicionar 0,6mL de α-naftol a 5% e 0,2mL de KOH a 40%. Uma prova positiva é indicada pelo desenvolvimento de cor vermelha após 15 minutos ou mais da adição dos reagentes.

RESULTADOS O bacilo Gram-negativo isolado apresentou as seguintes características em relação às provas bioquímicas: Prova da Oxidação-Fermentação (OF) da glicose – Produção de reação ácida em ambos os tubos, mostrando-se tratar de um fermentador. Prova de glicose/lactose (ágar TSI) – Apresentou a base ácida e o ápice alcalino. Prova H2S - Não houve produção de H2S

Prova da Motilidade – O microrganismo apresentou crescimento apenas na zona da picada, sendo negativa sua motilidade. Prova do Indol – Ao adicionar-se o reagente de Kovac's, houve formação de anel incolor, sendo classificado como uma reação negativa. Prova do Citrato – Houve crescimento na superfície do meio e aparecimento de coloração azul, típicos de reação positiva. Prova da Uréia – Formou-se uma coloração rosa, indicando reação positiva. Prova da Fenilalanina – Após a adição do cloreto férrico no tubo, não houve alteração na coloração, sendo indicativo de reação negativa. Prova da Arginina – No tubo controle (sem aminoácido), a bactéria mostrou-se viável, abaixando o pH do meio e mudando sua coloração para amarelo turvo. Como o tubo contendo arginina mostrou-se púrpura, essa reação é positiva. Prova da Lisina – O tubo apresenta coloração púrpura, sendo uma reação positiva. Prova da Ornitina – O tubo apresenta coloração levemente púrpura, sendo uma reação positiva. Prova do Vermelho de Metila (VM) – Não houve alteração da cor do meio, sendo uma reação negativa Prova de Voges-Prouskauer (VP) – Não houve alteração da cor do meio, sendo uma reação negativa. Esses resultados são característicos de Klebsiella pneumoniae.

DISCUSSÃO K. pneumoniae é isolada com mais freqüência de amostras clínicas e pode causar uma forma clássica de pneumonia primária. Não é comum encontrar essa bactéria na orofaringe de pessoas normais, mas pode haver uma prevalência de 20% em pacientes hospitalizados. Essa colonização pode ser a fonte das infecções pulmonares que geralmente ocorrem em pacientes em condições debilitantes, como alcoolismo, diabetes melito e doença pulmonar obstrutiva crônica. A pneumonia tende a ser destrutiva, com necrose extensa e hemorragia, resultando na produção de escarro. Esta bactéria também pode causar uma variedade de infecções extrapulmonares, incluindo enterite e meningite, infecções urinárias e septicemia. Apesar da maior parte dos testes serem compatíveis com K. pneumoniae, há algumas considerações a serem feitas: •A positividade da prova da ornitina não é característica. Isso pode ter ocorrido por tempo insuficiente para a viragem do pH; •Os testes VM e VP foram negativos não apenas para a bactéria em questão, mas sim para todas as outras bactérias dos outros grupos. Isso pode ser resultado de alguma alteração do teste ou de seus reagentes.

BIBLIOGRAFIA 1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. 2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI, 2001 3. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. Disponível em: Acesso em: 13 nov. 2009

Universidade Federal do Triângulo Mineiro Departamento de Ciências Biológicas Disciplina de Microbiologia Aplicada Relatório de Prática

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DAS MICOSES E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009

OBJETIVO Diferenciar as colônias de fungos filamentosos e leveduriformes de acordo com as características macroscópicas; • Executar técnicas de macro e microcultivo para fungos filamentosos, identificar diferentes tipos de fungos filamentosos com base nas características de cultivo (macrocultivo) e na morfologia das estruturas fúngicas. • Identificar as leveduras em espécie com base nos seus aspectos macroscópicos e microscópicos e por meio de provas bioquímicas (zimograma e auxinograma).

INTRODUÇÃO A identificação dos fungos é, em grande parte, baseado em sua morfologia. Como eles habitam os mais variados substratos, apresenta em decorrência uma variação de tipos morfológicos,dos mais simples aos mais complexos. Considera-se no seu estudo, aspectos da morfologia macroscópica (colônias filamentosas, cremosas, cotonosas, pulverulentas, formação de pigmentação,etc) como também da morfologia microscópica. A unidade estrutural dos fungos é representada pela hifa, e o conjunto destes elementos é denominado micélio. O micélio vegetativo exerce as funções de assimilação de alimentos e fixação em substratos, podendo se diferenciar em estrutura de frutificação que serve à reprodução. Micélio Vegetativo Constituído por um aglomerado de hifas, pode ser dividido de acordo com sua morfologia em três tipos: 1. Unicelular: caracteriza as leveduras que são constituídas por células arredondadas, ovóides ou ligeiramente alongadas e que podem se reproduzir por brotamento, cissiparidade ou por outros processos. 2. Filamentoso: caracteriza os bolores, podendo apresentar-se septado ou cenocítico. As hifas podem se diferenciar em estruturas e funções variáveis recebendo, então, denominações diversas: rizóides, apressórios, anastomoses, hifas artrosporadas, etc. 3. Pseudomicélio: caracteriza um gênero de levedura (Candida). É formada de brotamentos sucessivos de células em determinadas condições de cultivo. Micélio de Frutificação ou Endocárpio Cumpre as funções de preservação e disseminação da espécie mediante a formação de células especiais denominadas esporos, que são elementos de resistência. Estes podem ser hialinos, pigmentados, simples, septados apresentando várias formas características que definem, às vezes, gêneros ou espécies de fungos. Os esporos, de acordo com sua origem, podem ser assexuados ou sexuados e tanto um como outro podem estar ou não no interior de determinadas estruturas. Esporos de origem assexuada 1. Ectósporos: esporos que se formam na extremidade de hifas especiais denominadas conidióforos. Esses esporos são denominados conídios. Ex.: Aspergillus, Penicillium. 2. Endósporos: esporos produzidos no interior de estruturas denominadas esporângios. Os esporos, nesses casos, são denominados esporangiósporos. Ex.: Rhizopus

Esporos de origem sexuada 1. Ectósporos: esporos formados na extremidade de basídios denominados basidiósporos. Ex.: Basidiomicetos 2. Endósporos: esporos no interior de células denominadas ascos. Os esporos, nesse caso,são denominados ascósporos. Ex.: Piedraia hortai.

MATERIAIS E MÉTODOS Identificação de Fungos Filamentosos: Bico de bunsen Alças de platina em gancho Placas de Agar Sabouraud Placas de Agar Batata dividido em cubos Placas de Petri estéreis para microcultivo contendo lâmina, lamínula e algodão (segundo técnica de Ridela) Agua destilada estéril Pinça Frascos com lactofenol-azul de algodão Lâminas de microscopia Culturas em tubo de ensaio de diferentes fungos filamentoso -Macrocultivo Semear um pequeno fragmento da cultura do fungo filamentoso no centro da placa de Agar Sabouraud, utilizando a alça de platina em gancho. Identificar a placa e incubar por uma semana à temperatura ambiente. -Microcultivo Colocar sobre a lâmina, dentro da placa de Petri, um cubo de Agar batata, com auxílio de pinça ou da própria alça, semear fragmentos do fungo filamentoso nos 4 cantos do Agar batata, cobrir a preparação com lamínula estéril, comprimindo-a suavemente sobre o cubo de Agar batata; umedecer o algodão hidrófilo com água destilada estéril, criando assim uma câmara úmida; identificar as placas e incubar à temperatura ambiente. -Leitura: retirar a lamínula, cuidadosamente, e colocá-la sobre uma lâmina contendo 1 gota de lactofenol-azul de algodão e examinar ao microscópio com objetiva de 10 e 40x. Identificação de Fungos Leveduriformes: Bico de bunsen Alças de platina Pinças Lâmina Lamínulas Vidraria para microcultivo (lâmina, lamínula e algodão) Agar Sabouraud Agar fubá-tweed80 Ágar base de carboidratos Agar base para carboidratos Agar base para nitrogênio Peptona Nitrato de potássio Açúcares liofilizados (dextrose, sacarose, trealose, lactose, galactose, maltose, rafinose, melibiose, inositol, ramnose, xilose).

Salina estéril Tubo n° 5 da escala de McFarland Pipetas Ponteiras Estufa microbiológica Culturas de fungos leveduriformes -Prova do tubo germinativo: Com uma alça de platina calibrada (0,001ml), retirar uma pequena porção de uma colônia de levedura e emulsioná-la de forma asséptica em 0,5 ml de soro. Evitar, se possível, o uso de soro humano, que pode ter anticorpos ou ainda antifúngicos. Incubar a 37°C por um período de 2 a 3 horas em estufa bacteriológica. Findo este período, deve-se remover uma gota da suspensão e montar uma preparação do tipo lâmina-lamínula, para observação microscópica. O tubo germinativo, quando o teste for positivo, aparecerá como filamento fino e cilíndrico, originado do blastoconídio da levedura, no qual não se observa nenhuma zona de constrição, quer na base ou ao longo de sua extensão. -Zimograma (Fermentação de carboidratos): Preparar a suspensão de leveduras: em um tubo de ensaio,adicionar 10 ml de salina estéril; tocar as colônias da levedura e adicionar ao tubo. Observar a turvação deve ser semelhante ao tubo n°5 da escala de McFarland. Colocar 400 ul da suspensão de leveduras em tubos de ensaio contendo o meio de fermentação; foram utilizados 5 tubos contendo 8 mil de meio-base, um tipo de açúcar (dextrose, sacarose, lactose, galactose e maltose) e tubo de Durhan invertido. Fechar os tubos com tampa de rosca e incubar em estufa a 35°C. Fazer a primeira leitura com 24hrs de incubação. A leitura é considerada positiva se houver a formação de bolhas de gás dentro do tubo de Durhan. -Auxanograma (Assimilação de carboidratos): No centro de uma placa de Petri grande, coloca-se 2,5 ml da suspensão da levedura preparada anteriormente, para zimograma. Em seguida, coloca-se 50 ml de meio-base de assimilação de carboidratos previamente fundido (temperatura de aproximadamente 50°C). Homogeniza-se com movimentos circulares suaves e esperar solidificar. Após solidificação, adicionar pequenas quantidades de cada um dos 12 carboidratos a serem testados: 1 - Celobiose 2 - Dextrose

4 - Inositol 5 - Lactose

7 - Melibiose 8 - Rafinose

10 - Sacarose 11 - Trealose

3 - Galactose

6 - Maltose

9 - Ramnose

12 - Xilose

Os açúcares são distribuídos na superfícies da placa com auxilio de uma espátula, em pequenas porções. Deve-se manter distância entre os pontos de inoculação. Para facilitar a colocação dos açúcares e a leitura dividir a placa em 12 campos e enumerar. Incubar a placa a 35°C, com face que contém o meio com açucares voltada para cima e fazer a leitura entre 24-96 horas. A leitura é considerada positiva quando houver turvação no local onde foi adicionada o açúcar. Usar uma tabela padrão para identificação da espécie da levedura.

-Auxanograma ( Assimilação de nitrogênio): No centro de uma placa de Petri pequena, coloca-se 1 ml da suspensão da levedura preparada anteriormente, para o zimograma. Em seguida coloca-se 20 ml de meio-base para assimilação de nitrogênio, previamente fundido (~50°C). Homogeneizar com movimentos circulares suaves e esperar solidificar. Após solidificar dividir a placa em duas metades com a caneta. De um lado, colocar nitrato de potássio. Incubar a placa a 35°C e fazer a leitura entre 24-96 horas. A leitura deve ser interpretada da seguinte forma: a peptona serve como controle positivo, pois todas as leveduras metabolizam esta substancia; o nitrato de potássio só é metabolizado por fungos não patogênicos. Usar uma tabela padrão para identificação da espécie da levedura. -Microcultivo de leveduras: Coloca-se sobre a lâmina de microscopia o meio Agar Fubá-Tween80, previamente fundido (~50°C), cobrindo toda a superfície da lâmina. Deixar o meio solidificar. Com auxílio de alça de platina esterilizada, tocar levemente a colônia da levedura (cultura de 24-48 horas). Semear a levedura na superfície do meio de cultura fazendo de três a quatro estrias paralelas, eqüidistantes 3 a 4 mm umas das outras (ver esquemas abaixo). Cobre-se as estrias com lamínula esterilizada. Pressionar delicadamente a lamínula com uma pinça para retirar o ar retido entre a lamínula e a superfície do Agar. Identificar a placa e incubá-la à 35°C, por 48-96 horas, dentro de uma placa de Petri esterilizada; umedecer o algodão hidrófilo esterilizado com água destilada estéril e deixar no interior da placa, criando assim uma câmara úmida. Examinar as lâminas ao microscópio óptico com objetivas de 10 e 40x e observar as estruturas formadas ( hifas, pseudohifas,blastoconídios, clamidioconídios e artroconidios).

-Teste da uréia: Inocular as leveduras a serem identificadas em Agar uréia com o auxilio da agulha de platina e incubar à 37°C, por 24 h. Este teste irá avaliar a produção da enzima uréase pela levedura, a partir da hidrólise da uréia. -Meio de cultura cromogênico para Candida (Chromoagar): Inocular as leveduras a serem identificadas no Chromoagar com auxilio da alça de platina e incubar a 37°C, por 24 h.

RESULTADOS Na identificação de fungos filamentosos: Na placa de Agar Sabouraud observou-se no um fungo de textura aveludada, formato rugoso, de coloração amarelada no verso, e no anverso com coloração rosa com o centro esverdeado. Na leitura do microcultivo foi observada uma estrutura como a do desenho abaixo, que é sugestivo para Penicillium sp.

Na identificação de fungos leveduriformes: -Prova do tubo germinativo: Não foi observado a formação de tubo germinativo, excluindo a possibilidade de ser C. albicans ou C. dubliniensis. -Zimograma: nesta prova foi observada a presença de bolhas somente no tubo da dextrose e de maltose, colocando um resultado entre Candida albicans e Candida parapsilosis,segundo a tabela de fermentação de carboidratos e as espécies relacionadas. -Auxinograma (assimilação de carboidratos):

1 – Celobiose (-) 2 – Dextrose (+)

4 – Inositol (-) 5 – Lactose (-)

7 – Melibiose (-) 8 – Rafinose (-)

10 – Sacarose (+) 11 – Trealose (+)

3 – Galactose (+)

6 – Maltose (+)

9 – Ramnose (+)

12 – Xilose (+)

Este resultado segundo a tabela com as espécie de fungos leveduriformes indica ser Candida albicans ou Candida parapsilosis. -Auxinograma ( Assimilação de nitrogênio): Turvou na presença de peptona – sugerindo um FUNGO PATOGÊNICO

-Microcultivo de leveduras: Na leitura da lâmina deve-se procurar estruturas de reprodução por toda a lâmina, esta estrutura de reprodução neste caso possui características coloniais satélites como aranha, e um aspecto arborescente. -Teste da uréia: prova negativa -Meio de cultura chromagar: Observa-se uma coloração roseada. Confirmando não ser C. albicans.

DISCUSSÃO A identificação de um fungo desconhecido isolado de uma amostra biológica não é necessariamente difícil, se forem realizadas algumas observações preliminares. Na maioria dos casos não é difícil diferenciar a colônia lisa, entre pastosa e mucóide, de uma levedura que cresce sobre a superfície de um meio de isolamento primário da colônia de aspecto cotonoso ou lanoso de um bolor. Todos os isolados devem ser considerados potencialmente patogênicos; entretanto, certos grupos, incluindo fungos dimórficos, dermatófitos e certos fungos filamentosos negros, de crescimento lento, estão quase sempre relacionados com doenças quando recuperados de amostras biológicas. Portanto, devem ser identificados sem qualquer dúvida, e os informes devem estar disponíveis o mais rápido possível, para que o tratamento antimicótico possa ser instituído. Aspecto do crescimento, velocidade de crescimento e pigmentação das colônias são observações úteis para essa decisão inicial. Nos fungos filamentosos o a identificação segundo a analise de microcultivo e do macrocultivo indicou o fungo da espécie Penicillium. Nas espécies de Penicillium pequenos conídios esféricos estão dispostos em longas cadeias, a partir das extremidades de fiálides, cujas pontas são rombas e parecem cortadas. As colônias de Penicilium usualmente apresentam diversas tonalidades de verde, embora tenham sido encontradas variantes amarelas e marrom-amareladas. Em geral, é observada uma faixa branca estreita na margem de crescimento externo da colônia. Na análise de fungos leveduriformes a identificação sugeriu a espécie Candida parapsilosis, uma das especies de candida diferentes de C. Albicans. Estas fazem parte da microbiota normal de superfície cutâneas e mucocutâneas, e apenas em raras ocasiões foram consideradas como agentes de doença clínica. Entretanto várias espécies foram associadas a virtualmente todas as formas de candidíase. Em uma revisão de 1591 casos de candidíase divulgados em 37 trabalhos entre 1952 e 1992, verificaram que as espécies de Cândida não-albicans haviam sido os agentes causais de 46% das infecções sistêmicas; C. tropicallis foi responsável por 25% das infecções, C. glabrata por 8%, C. parapsilosis por 7%, e C.kruzei por 4%. Candida parapsilosis apresenta-se, desde os anos 80, como um importante patógeno hospitalar de fungemias, sendo responsável por 7% a 15% das candidemias na maioria das séries publicadas nos EUA e Europa. Sua ocorrência é ainda maior em crianças e recém-nascidos prematuros internados em unidades de terapia intensiva, onde a prevalência de candidemias por C. parapsilosis é de 17 a 50% dos casos. Caracteristicamente, C. parapsilosis prolifera-se em soluções contendo glicose, tem grande capacidade de produzir biofilme e freqüentemente coloniza a pele. Vários estudos estabelecem claramente uma associação entre a utilização de cateter venoso em posição central e maior ocorrência de fungemia por C. parapislosis. Isolados clínicos desta espécie são sensíveis a anfotericina B e aos tiazólicos. Em países da América Latina C. parapsilosis tem sido reconhecida como a segunda principal causa de infecção invasiva em diferentes casuísticas já publicadas no nosso meio.

BIBLIOGRAFIA 1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. 2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI, 2001 3. COLOMBO,A.L.; Guimarães,T. Epidemiologia das infecções hematogênicas por Candida spp.Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.36 no.5 Uberaba Sept./Oct. 2003 4. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Disponível em: Acesso em: 15 nov. 2009