Protein Eric Om Bin Anti

SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI A cosa possono servire le proteine ricombinanti? -PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina, ormone crescita). -PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (ENZIMI). -PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI. -REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.

SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI 

QUANDO? – Quando le proteine sintetizzate nei procarioti sono instabili o perdono la loro attività biologica.

PERCHE’? – Perché dopo la purificazione le proteine ricombinanti sono prive di contaminanti (composti batterici tossici o pirogeni). - Perché una serie di modificazioni sono possibili a livello post-traduzionale: 

 Corretta

formazione di ponti di solfuro

 Tagli proteolitici della forma precursore  Glicosilazione (stabilità)  Fosforilazione, acetilazione,

carbossilazione etc… (attività biologica)

GENERICO VETTORE DI ESPRESSIONE EUCARIOTICO: CARATTERISTICHE PRINCIPALI

MARCATORE SELEZIONABILE EUCARIOTICA

UNITA’ DI TRASCRIZIONE EUCARIOTICA

SISTEMI DI TRASFORMAZIONE/TRASFEZIONI DI CELLULE EUCARIOTICHE  LIEVITO: -

FORMAZIONE DI PROTOPLASTI

-

TRASFORMAZIONE CON ACETATO DI LITIO

-

ELETTROPORAZIONE

 CELLULE ANIMALI: -

INCUBAZIONE CON DNA COPRECIPITATO CON FOSFATO DI CALCIO O DEAE-DESTRANO

-

ELETTROPORAZIONE

-

VEICOLAZIONE DI DNA DA PARTE DI UN VIRUS

SISTEMI DI ESPRESSIONE BASATU SU S. cerevisiae VANTAGGI Eucariote unicellulare Ben nota la genetica e la fisiologia Crescita rapida Identificati promotori forti, plasmidici (2µ m) naturali Modificazioni posttraduzionali 

-

-

-

Secerne poche proteine GRAS organism (Generally Recognized As Safe) dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti

PROTEINE RICOMBINANTI PRODOTTE IN S. cerevisiae

VETTORI BASATI SU S. cerevisiae VETTORI PLASMIDICI O EPISOMALI ADOPERATI DIFFUSAMENTE PER PRODURRE PROTEINE ETEROLOGHE  INSTABILI IN CONDIZIONI DI CRESCITA IN LARGA SCALA (> 10L)  RIMEDI: - ALTERAZIONE CONDIZIONI DI CRESCITA 1. 

AUMENTO DELLA STABILITA’

VETTORI DI INTEGRAZIONE  POCO DIFFUSI PER BASSA RESA PROTEICA 1.

3. CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC)  CLONAGGIO DI LUNGHI SEGMENTI DI DNA (100 Kb)  ALTAMENTE STABILI

UTILIZZI DEL SISTEMA YAC  MAPPATURA FISICA DNA GENOMICO  ANALISI DI GRANDI UNITA’

TRASCRIZIONALI  PREPARAZIONE E SCREENING DI

GENOTECHE

COMPONENTI ESSENZIALI DEL SISTEMA YAC   





MARCATORE SELEZIONABILE DI E. coli (AMPR) ORIGINE DI REPLICAZIONE IN E. coli (oriE) CENTROMERI (CEN), TELOMERI (T), E SEQUENZE A REPLICAZIONE AUTONOMA (ARS) MARCATORI DI DI SELEZIONE AUXOTROFICA COME TRP1 E URA3 PER SELEZIONARE IN LIEVITO SITI DI RESTRIZIONE UNICI

SISTEMA DI CLONAZIONE YAC

IL COSTRUTTO FINALE RECA DNA CLONATO E SI PUO’ MANTENERE STABILE IN UNA CELLULA DI LIEVITO OSPITE Ura- E Trp-

ESPRESSIONE DEL GENE ETEROLOGO DELLA SUPEROSSIDO DISMUTASI UMANA IN S. cerevisiae Cu/Zn SOD  COMBINA L’O-2 CON H2

H2O2

PRODUZIONE DI ANIONE SUPEROSSIDO - INFIAMMAZIONE - RIPERFUSIONE D’ORGANO 

 -

POTENZIALE AGENTE TERAPEUTICO: OSTEOARTRITE, ARTRITE REUMATOIDE, SCLERODERMA, SPONDILITE ANCHILOSANTE

CLONAZIONE DEL cDNA PER Cu/Zn DISMUTASI UMANA IN LIEVITO 

Trasformazione di un ceppo di lievito LEU2-



Crescita in LEU-



Espressione costitutiva di Cu/Zn-SOD acetilata in ALA all’N-terminale

ESPRESSIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI IN S. cerevisiae 

LIMITI

3.

PERDITA DEL PLASMIDE

5.

IPERGLICOSILAZIONE DELLA PROTEINA ETEROLOGA ALTERAZIONE ATTIVITA’ BIOLOGICA E IMMUNOGENICITA’

3. NO SECREZIONE PROTEICA

 RIMEDI

LIEVITI ALTERNATIVI:  Kluyverommyces lactis  Schizosaccharomyces pombe  Yarrowia lipolitica  Pichia pastoris  Hansenula polymorpha -

Pichia pastoris  LIEVITO METANOLTROFICO  COLTIVABILE FACILMENTE ED

ECONOMICAMENTE IN BIOREATTORI DI GRANDI DIMENSIONI



COSTRUZIONE DI VETTORI DI INTEGRAZIONE PER EVITARE LA PERDITA DEL PLASMIDE

VETTORE DI ESPRESSIONE CHE SI INTEGRA IN P. pastoris PER PRODUZIONE DI HBsAg (scopo vaccino) GENE AOX1: ALCOL OSSIDASI E REGOLATO DAL METANOLO oriE: DERIVANTE DA pBR322

INTEGRAZIONE DI UNA PARTE DEL VETTORE DI ESPRESSIONE NEL GENE 1 DELL’ALCOL OSSIDASI DI P. pastoris

TRASFORMAZIONE DI UN CEPPO DI P. pastoris HIS4-

RISULTATI  IN PRESENZA DI METANOLO IL CLONE

RECANTE L’UNITA’ INTEGRATA DI DNA SINTETIZZA GRANDI QUANTITA’ DI HBsAg  ASSEMBLGGIO DEL PRODOTTO

PROTEICO HBV

ANTICORPI ANTI-

PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI MEDIANTE IL SISTEMA DI ESPRESSIONE DI Baculovirus 

AcMNPV: VIRUS DELLA POLIEDROSI NUCLEARE MULTIPLA DI Autographa californica

 LINEA CELLULARE: Spodoptera

frugiperda - SI ESPRIME MOLTO BENE IL PROMOTORE DELLA POLIEDRINA

PRODUZIONE DI Baculovirus RICOMBINANTE  STEP I

TRANSFER VECTOR CONSTRUCTION E. coli -BASED PLASMID PROPAGATION

 STEP II

TRANSFECTION OF CELLS WITH AcMNPV DNA + TRANSFER VECTOR

• LOSS OF POLYHEDRIN GENE • ZONE OF CELL LYSIS • ISOLATION OF VIRUS

“VISUALIZZAZIONE” DELLE PLACCHE SENZA OCCLUSIONE:  IBRIDAZIONE DEL DNA  PCR ASSAY  GENE lacZ DI E. coli SOTTO IL

CONTROLLO DI UN PROMOTORE DEL BACULOVIRUS

 STEP III

INFEZIONE DELLE CELLULE DI INSETTO CON BACULOVIRUS RICOMBINANTE  STEP IV

RACCOLTA DELLA PROTEINA ETEROLOGA DOPO 4 O 5 GIORNI

ALCUNE DELLE PROTEINE RICOMBINANTI PRODOTTE UTILIZZANDO IL SISTEMA DEL VETTORE DI ESPRESSIONE DI BACULOVIRUS