Procedimiento

PROCEDIMIENTO Extracción de proteínas Preparación del gel 1.- Colocar unas cuantas semillas en un 1.-Montar la cámara de electroforesis, mortero y moler hasta obtener una limpiar antes la superficie del vidrio harina muy fina. expuesta al gel con SDS 0.1%. 2.- Pesar 50 mg de harina y transfererirla a un tubo para microcentrifuga. 3.- Añadir 400ul del buffer de extracción. 4.- Homogenizar con varilla de vidrio. 5.- Incubar en baño de hielo por 40 minutos, agitar en vortex cada 5 minutos. 6.- Centrifugar 10 minutos a 12 000 RPM. 7.- Recuperar el sobrenadante de un tubo limpio. Nota: el sobrenadante contiene las proteínas totales de la semilla. Guardar el tubo a -20° C hasta su uso.

2.- Preparar el gel separador de poliacrilamida al 10%. Solución de 13.33 ml acrlamida Tris-HCL pH 8.8 15.05 ml Agua desionizada 11.18 ml SDS 20% 0.2 ml TEMED 0.04 ml Persulfato de 0.2 ml amonio 10% 3.- Vaciar el gel separador hasta 2 cm antes del borde. 4.- Cubrir la superficie con 4 ml de isopropanol frío retirándolo cuando polimerice el gel. 5.- Preparar el gel concentrador. (para 1 gel) Solución de acrilamida Tris-HCL pH 6.8 M Agua desionizada SDS 20 % TEMED Persulfato de amonio 10 %

1.34 ml 1.0 ml 5.6 ml 0.04 ml 0.008 ML 0.04 ml

6.- Vaciar el gel y colocar el peine. Esperar la polimerización.

Electroforesis 1.- Tomas 20ul de la solución de proteínas y mezclarlas con 20ul de buffer de muestra 2X . 2.- Cargar el gel con las muestras y marcadores. 3.- Correr a 40 V hasta que el frente entre al gel separador. 4.- Correr a 90 V hasta que le frente quede a 0.5 cm del borde inferior del gel. 5.- Teñir 2 horas. 6.- Desteñir hasta que las bandas sean visibles. 1.- ¿Qué es la electroforesis? Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. 2.- ¿Cuál es la base de la electroforesis para la separación de moléculas biológicas? Las moléculas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales: la fricción con el solvente, movimiento browniano. 3.- ¿Para qué sirve el buffer que se coloca en la cámara? Para que la conductividad eléctrica sea optima. 4.- ¿Qué moléculas, además de proteínas se pueden estudiar con esta técnica? Carbohidratos, lípidos