Tổng Hợp Sol Gel.docx

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU BỘ MÔN VẬT LIỆU SILICAT ---------------o0o---------------

BÁO CÁO MÔN HỌC: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC VẬT LIỆU VÔ CƠ ĐỀ TÀI: TỔNG HỢP SOL – GEL MỚI TRONG THỦY TINH HOẠT TÍNH SINH HỌC 45S5 SỬ DỤNG ACID HỮU CƠ LÀM CHẤT XÚC TÁC.

GVHD:

TS. Nguyễn Xuân Thanh Trâm

SVTH - MSSV:

Lê Mỹ Hằng - 1610954 Nguyễn Bảo Ngân - 1612164

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 11 NĂM 2018

i

MỤC LỤC DANH SÁCH HÌNH ẢNH MINH HỌA ...................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG SỐ LIỆU .................................................................................... iv TÓM TẮT BÁO CÁO .................................................................................................... 1 Chương 1 GIỚI THIỆU .................................................................................................. 2 1.1. Tổng quan .................................................................................................... 2 1.2. Tình hình nghiên cứu ................................................................................... 2 1.3. Mục tiêu ........................................................................................................ 3 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................... 4 2.1. Tổng hợp Sol - gel ........................................................................................ 4 2.2. Tính chất hóa lý và đặc điểm cấu trúc .......................................................... 5 2.2.1. Kính hiển vi điện tử quét và phân tích tia X (SEM - EDXS) ................ 5 2.2.2. Quang phổ hồng ngoại biến đổi Furier (FTIR) ...................................... 6 2.2.3. Nhiễu xạ tia X (XRD) ............................................................................ 6 2.2.4. Xác định diện tích bề mặt cụ thể bằng phương pháp BET .................... 6 2.3. Thử nghiệm hoạt tính sinh học trong ống nghiệm........................................ 7 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................... 8 3.1. Tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm quá trình Sol – gel .............................. 8 3.2. Đặc điểm cấu trúc của thủy tinh sinh học ..................................................... 9 3.3. Đặc điểm diện tích bề mặt cụ thể của thủy tinh sinh học ........................... 12 3.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học trong ống nghiệm cho thủy tinh sinh học . 13 Chương 4 KẾT LUẬN .................................................................................................. 16

ii

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 18 A new sol–gel synthesis of 45S5 bioactive glass using an organic acid as catalyst ..... 20

iii

DANH SÁCH HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình 2.1. Sơ đồ quy trình Sol – gel.................................................................................. 5 Hình 3.1. Phổ FTIR của sol – gel và Bioglass® thương mại......................................... 11 Hình 3.2. XRD của sol – gel và Bioglass® thương mại. ............................................... 12 Hình 3.3. Ảnh chụp hiển vi SEM của thủy tinh sol-gel và Bioglass® thương mại (độ phóng đại thấp và cao). .................................................................................................. 13 Hình 3.4.Phân tích SEM-EDXS của sol – gel và Bioglass® thương mại sau thời gian ngâm vào SBF. ............................................................................................................... 14

iv

DANH SÁCH BẢNG SỐ LIỆU Bảng 2.1. Điều kiện thử nghiệm của quá trình Sol – gel. ................................................ 5 Bảng 2.2. Nồng độ ion của huyết tương người và dung dịch SBF được sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học trong ống nghiệm. ......................................................................... 7 Bảng 3.1. Thành phần nguyên tố của bột sol – gel được tổng hợp với axit nitric làm chất xúc tác (dòng in đậm tương ứng với bột tối ưu có tên sol-gel 1). ............................ 8 Bảng 3.2. Thành phần nguyên tố của bột sol – gel được tổng hợp với axit citric làm chất xúc tác (dòng đậm tương ứng với bột tối ưu có tên sol-gel 2). ................................ 8

1

TÓM TẮT BÁO CÁO Bài báo cáo này trình bày về một phương pháp sol-gel mới được tìm ra để tổng hợp thủy tinh hoạt tính sinh học 45S5. Chứng minh được acid citric có thể sử dụng thay thế acid nitric để làm chất xúc tác phản ứng sol – gel. Sự thay thế acid nitric bằng axit citric làm giảm mạnh nồng độ dung dịch acid cần thiết để xúc tác sự thủy phân của silicon và alkoxide photphat. Hai loại bột sol – gel với các thành phần hóa học rất gần với 45S5 được tổng hợp bằng cách sử dụng cả dung dịch acid nitric 2M hoặc dung dịch acid citric 5 mM. Những loại bột này được đặc tả và so sánh với Bioglass® thương mại. Tính chất bề mặt của hai loại bột thủy tinh sinh học này được đánh giá bằng phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM) và phương pháp Brunauer–Emmett– Teller (BET). FTIR và XRD cho biết sự kết tinh một phần liên kết với sự hình thành pha kết tinh trong hai loại bột. Hoạt tính sinh học trong ống nghiệm được nghiên cứu tại các thời điểm quan trọng trong những giờ đầu tiên khi ngâm trong dung dịch mô phỏng tế bào SBF. Sau bốn giờ chứng minh được mức độ hoạt tính sinh học của hai bột sol – gel là tương tự và còn cao hơn so với Bioglass® thương mại. Sự cải thiện hoạt tính sinh học này làm tăng độ xốp và diện tích bề mặt cụ thể của loại bột được tổng hợp bằng quá trình sol – gel. Hơn thế nữa, dùng acid citric thay cho acid nitric đã rất hiệu quả trong việc xúc tác các phản ứng sol – gel mà không cần thay đổi hoạt tính sinh học trong thủy tinh hoạt tính 45S5.

2

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1. Tổng quan Thủy tinh hoạt tính sinh học là vật liệu có tính chất dẫn xương và tạo xương, cho phép nó có khả năng chữa lành và thay thế cấu trúc xương bị bệnh hoặc bị hư hại. Các tính chất này nhờ vào phương pháp hòa tan tiến bộ trong môi trường sinh lí: môi trường sinh ra canxi, photphat; các ion natri sẽ trải qua quá trình hình thành lớp apatit, qua đó tạo ra một liên kết cực mạnh với các chuỗi mô xương ở xung quanh. Nhiều thành phần của thủy tinh hoạt tính mang mối quan tâm lớn đến natri canxi phosphatsilicat, borosilicate hoặc từ 13 đến 93 hợp chất. 1.2. Tình hình nghiên cứu Lary Hench đã phát triển loại Bioglass® 45S5 nổi tiếng có cấu trúc bậc 4 SiO2– CaO–Na2O–P2O5 với một thành phần oxit cho phép nó có thể liên kết với cả chuỗi mô cứng và mềm (hoạt tính sinh học loại A). Nó đã được sử dụng từ nhiều thập kỉ trong nhiều thiết bị y tế như chỉnh hình và điều trị nha khoa. Thủy tinh hoạt tính thương mại được sản xuất truyền thống bằng quá trình nóng chảy – làm lạnh đòi hỏi nhiệt độ rất cao, nó giới hạn độ xốp, bề mặt cụ thể của loại bột này. Trong khi đó chúng tôi nỗ lực nghiên cứu phát triển phương pháp sol – gel để có được loại bột thủy tinh hoạt tính với độ tinh khiết cao và đồng nhất. Nó cũng mở rộng phạm vi các thành phần hóa học khi so sánh với quá trình nóng chảy - làm lạnh truyền thống. Những ích lợi này làm cho phương pháp sol – gel rất hiệu quả khi tổng hợp thủy tinh hoạt tính 45S5. Mặc dù quá trình sol – gel phải thực hiện trong điều kiện môi trường ở nồng độ thấp, tuy nhiên hiện nay các phương pháp tổng hợp lại dùng acid mạnh (acid nitric và acid hydrocloric) hoặc bazơ (ammonia hydroxide) có nồng độ cao (lên tới 1M) để xúc tác phản ứng sol – gel. Do đó cần tìm cách để làm quá trình diễn ra sạch hơn, tránh điều kiện pH quá cao hoặc quá thấp hay nhiệt độ cao. Đã có nhiều báo cáo về phương pháp tổng hợp hạt nano thủy tinh hoạt tính sử dụng acid hữu cơ có nồng

3

độ cực thấp ( khoảng 0.01M) để xúc tác phản ứng hóa học. Trong số đó, dung dịch acid citric được sử dụng phổ biến để xúc tác sự thủy phân silicon alkoxide. Ý tưởng này đến từ việc tìm cảm hứng trong tự nhiên, do vậy nó được xét là cảm hứng sinh học. Tiến bộ của hóa học sol – gel là sự hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp trong tảo cát và bọt biển thủy tinh. Những sinh vật này tích trữ acid silicic Si(OH)4 từ môi trường nhờ hoạt động của protein và các phân tử khác để tạo ra cấu trúc silica phức tạp. Việc giải thích các cơ chế là nền tảng của cơ chế sinh học dẫn đến sự tổng hợp silica trong ống nghiệm trong điều kiện môi trường sinh lí sử dụng protein, polypeptides, acid amin và chủ yếu là acid citric để xúc tác các phản ứng sol – gel. Xét thành phần cụ thể của thủy tinh hoạt tính sinh học, đặc biệt là hàm lượng canxi và photphat, lấy cảm hứng từ hình thái xương là việc cần thiết. Vì vậy, acid citric dùng để kích thích các phản ứng sol – gel trong trường hợp này. 1.3. Mục tiêu Mục tiêu chính của bài này là xét đến khả năng thành công khi tổng hợp sol –gel để chuyển hóa thủy tinh hoạt tính 45S5 bằng dung dịch acid citric nồng độ thấp để xúc tác các phản ứng thủy phân. Đầu tiên, xác định thông số sol – gel tối ưu để đạt được thành phần hóa học 45S5 bằng cách sử dụng cả acid nitric thông thường và acid citric loại mới làm chất xúc tác. Ở phần hai, so sánh tính chất hóa lí và hoạt tính sinh học trong ống nghiệm của hai loại bột sol – gel với loại Bioglass® 45S5 thương mại.

4

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1. Tổng hợp Sol - gel Tổng hợp sol – gel trong thủy tinh hoạt tính đã được thực hiện theo một phương pháp thông thường trong tổng hợp thủy tinh sinh học 45S5, sử dụng các tiền chất hóa học sau: Tetraethyl orthosilicate Si(OC2H5)4 (TEOS), Triethyl phosphate PO(C2H5)3 (TEP), Canxi nitrate tetrahydrate Ca(NO3)2.4H2O và Natri nitrate NaNO3. Hai dung dịch acid là acid nitric (HNO3) hoặc acid citric (C6H8O7) được sử dụng để xúc tác các phản ứng thủy phân. Phản ứng thủy phân và ngưng tụ được thực hiện trong một thiết bị phản ứng nhiệt để có thể kiểm soát được nhiệt độ phản ứng. Tỉ lệ mol của TEOS, TEP, NaNO3 và Ca(NO3)2.4H2O được điều chỉnh theo tỉ lệ của SiO2, P2O5, Na2O và CaO trong 45S5. Để đạt được sol tinh khiết, tỉ lệ mol giữa dung dịch acid và bốn tiền chất hóa học được chỉnh đến 10. Đầu tiên, dung dịch acid (26 ml) được khuấy từ gia nhiệt tại nhiệt độ mong muốn sau đó TEOS (11.6 ml) và TEP (1ml) được thêm vào bằng cách nhỏ giọt và khuấy cho tới khi đạt được dung dịch trong suốt. Sau đó, thêm từ từ bột NaNO3(4.66g) và khuấy cho tới khi tan hoàn toàn. Cuối cùng thêm từ từ bột Ca(NO3)2.4H2O và khuấy trong một giờ để đạt được sol trong suốt. Do đó, sol bắt đầu biến đổi thành dạng gel thông qua phản ứng đa trùng ngưng. Sau đó gel được giữ ở 60oC suốt 12 giờ và lần lượt sấy ở 200oC và 700oC khoảng 5 giờ và 2 giờ. Sau sấy, nghiền gel thành bột mịn. Bột này được nén ép thủ công để mô tả đặc tính của thành phần nguyên tố và dùng cho các kiểm tra độ hoạt tính sinh học. Để quan sát tính chất cụ thể của hai loại thủy tinh sinh học tổng hợp bằng quá trình sol – gel, ta so sánh nó với loại Bioglass® thương mại tổng hợp bằng quá trình nóng chảy – làm lạnh truyền thống.

5

Bảng 2.1. Điều kiện thử nghiệm của quá trình Sol – gel.

Tiền chất Na2O

Tetraethylorthosilicate (TEOS): Si(OC2H5)4. Natri nitrate: NaNO3.

Tiền chất CaO

Canxi nitrate tetrahydrat:

Tiền chất SiO2

Ca(NO3)2.4H2O

Nhiệt độ phản ứng

Triethylphosphate (TEP): PO(C2H5)3. 20oC, 35oC, 50oC.

Xúc tác

Acid nitric: HNO3 0.5M và 2M.

Tiền chất P2O5

Acid citric: C6H8O7 0.5mM, 5mM và 50mM.

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình Sol – gel. 2.2. Tính chất hóa lý và đặc điểm cấu trúc 2.2.1. Kính hiển vi điện tử quét và phân tích tia X (SEM - EDXS) Hình thái của các loại bột được quan sát bằng phương pháp SEM sử dụng kính hiển vi điện tử LaB6 vận hành từ 0 – 30 kV. Kính hiển vi liên kết với phổ kế tán xạ

6

năng lượng EDAX trang bị máy dò window Si (Li) siêu mỏng được làm mát bằng Nitơ lỏng. Phổ kế liên kết với hệ thống thu thập và định lượng GENESIS (Eloïse SARL, France) dựa trên phương pháp ZAF dùng để xác định nồng độ nguyên tố của mẫu phân tích. Tất cả kết quả vi phân tích tia X trong bài báo này thu được bằng phương pháp: thu thập và định lượng bốn phổ trên bốn vùng phẳng của hạt bột chọn bởi SEM. Tất cả phổ tia X được thu với năng lượng 15 keV và thời gian thu bằng 100s. Giá trị cuối của nồng độ nguyên tố được xác định sau khi tính toán các giá trị trung bình và tán xạ. 2.2.2. Quang phổ hồng ngoại biến đổi Furier (FTIR) Phân tích đặc điểm cấu trúc của bột được thực hiện bằng phép chiếu quang phổ FTIR. Phổ FTIR thu được ở chế độ phản xạ với một hệ thống ảnh FTIR đi cùng với một phổ kế hoạt động ở dải 400 – 2000 cm-1 với phổ có độ phân giải 4 cm-1. 2.2.3. Nhiễu xạ tia X (XRD) Sự kết tinh của bột được nghiên cứu bằng phương pháp XRD sử dụng nhiễu xạ kế Bruker D8 Advance, dùng tia bức xạ đồng đơn sắc (CuKα ) có bước sóng λ = 0.154046 nm. Các nhiễu xạ được ghi nhận ở các bước 0.04o với thời gian thu hồi là 12s trong phạm vi nhiễu xạ góc 2θ trong khoảng từ 10o đến 60o. Các pha kết tinh sau đó được xác định bằng PDF thuộc Trung tâm quốc tế về dữ liệu nhiễu xạ ( ICDD). 2.2.4. Xác định diện tích bề mặt cụ thể bằng phương pháp BET Các phép đo hấp phụ nitơ sử dụng dụng cụ Micromeritics ASAP 2010 ở 77K. Phương pháp Brunauer Emmett Teller áp dụng để thu diện tích bề mặt từ dữ liệu đẳng nhiệt hấp phụ vật lí. Các đường đẳng nhiệt được xây dựng theo từng điểm bằng cách hấp thụ và thải ra lượng khí đã biết, với đủ thời gian cho phép để cân bằng tại mỗi áp suất tương đối (P/P0 với P là áp suất hơi cân bằng và P0 là áp suất hơi bão hòa). Phương pháp BET dựa trên việc xác định thể tích đơn lớp, tức là lượng nito tương ứng với sự hấp phụ của một đơn lớp hoàn chỉnh (Vmono). Trước khi phân tích, mẫu được để qua đêm ở 170oC trong lò. Trước khi hấp phụ, nó bị rút hết khí trong môi trường chân không ở 250oC suốt 1 giờ. Diện tích bề mặt được xác định từ một tập hợp 10 điểm thử nghiệm trong phạm vi tuyến tính của đồ thị BET (0.05 < P/P0< 0.3).

7

Diện tích bề mặt (SBET) được tính theo công thức: 𝑆𝐵𝐸𝑇 =

𝑉𝑚𝑜𝑛𝑜 . 𝑁𝐴 . 𝐴 𝑉𝑀

Trong đó: Vmono :Thể tích đơn lớp tại T = 273K và P = 101325 Pa (cm3.g-1). NA :Hằng số Avogadro. A :Diện tích mặt cắt ngang phân tử (VD: Nito có A = 0.162 mm2 tại 77K). VM :Thể tích mol ( 22414 cm3.mol-1). 2.3. Thử nghiệm hoạt tính sinh học trong ống nghiệm Để đánh giá hoạt tính sinh học của các loại bột, thử nghiệm trong ống nghiệm được thực hiện trong chất lỏng mô phỏng tế bào SBF. Dung dịch này vô bào, không protein với độ pH 7.4 được đệm với Tris-hydro-xymethylaminomethane (TRIS). Thử nghiệm hoạt tính sinh học thực hiện bằng cách ngâm bột vào dung dịch SBF trong 2 giai đoạn (1 giờ và 4 giờ) ở 37oC tương ứng với thời điểm quan trọng của hoạt tính sinh học đối với thủy tinh. Thể tích SBF dùng trong suốt bài thử nghiệm được tính toán theo phương pháp của Kokubo và Takadama: Thể tích SBF (ml) = 10% khối lượng hạt bột (mg). Sau khi thử nghiệm hạt bột được trích từ dung dịch và ngâm trong Acetone 10s để loại bỏ chất SBF và làm ngừng các phản ứng bề mặt. Sau khi sấy khô, bề mặt hạt bột được phân tích bằng SEM – EDXS để xác định hình thái và thành phần hóa học. Bảng 2.2. Nồng độ ion của huyết tương người và dung dịch SBF được sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học trong ống nghiệm.

8

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm quá trình Sol – gel Mục tiêu xác định các điều kiện thử nghiệm tối ưu để đạt được thành phần cấu tạo 45S5 bằng các thông số khác nhau như nhiệt độ phản ứng và nồng độ dung dịch acid dùng để xúc tác các phản ứng sol – gel. Acid nitric được thử nghiệm như một chất xúc tác bằng cách gộp ba nhiệt độ (20oC, 35oC và 50oC) và hai loại nồng độ (0.5M và 2M). Các kết quả thu được bằng phương pháp EDXS định lượng, cung cấp các thành phần nguyên tố của bột được tổng hợp với các thông số của những quá trình này.Các thông số tối ưu tạo ra thành phần tốt nhất rất gần với lí thuyết được quan sát ở 35oC và 2M (bột sol – gel này được đặt tên sol – gel 1). Bảng 3.1. Thành phần nguyên tố của bột sol – gel được tổng hợp với axit nitric làm chất xúc tác (dòng in đậm tương ứng với bột tối ưu có tên sol-gel 1).

Acid citric cũng được thử nghiệm làm chất xúc tác bằng cách gộp hai nhiệt độ (20oC và 35oC) và ba nồng độ (0.5 mM, 5 mM and 50 mM). Bảng 3.2. Thành phần nguyên tố của bột sol – gel được tổng hợp với axit citric làm chất xúc tác (dòng đậm tương ứng với bột tối ưu có tên sol-gel 2).

9

Trong trường hợp này, thông số tối ưu cung cấp thành phần cấu tạo hóa học tốt nhất được quan sát ở 20oC và 5 mM (được đặt tên là sol – gel 2). So sánh hai loại bột (sol – gel 1 và sol – gel 2) cho biết sự thiếu hụt silic và photph trong cả hai trường hợp có thể do quá trình thủy phân không đầy đủ của tiền chất và ngưng tụ không hoàn toàn do điều kiện pH không thuận lợi. Chúng tôi cũng quna sát được có sự cải thiện nhẹ trong thành phần hóa học của thủy tinh sinh học khi sử dụng acid citric (sol – gel 2). Điều này có thể do khả năng liên kết canxi và ion natri với ba nhóm carboxylic của acid citric. Do đó có thể kết luận rằng sử dụng acid citric thay vì acid nitric để xúc tác thủy phân TEOS và TEP dẫn đến quá trình tổng hợp sol – gel trong thủy tinh hoạt tính sinh học 45S5 đạt được thành phần hóa học mong muốn. 3.2. Đặc điểm cấu trúc của thủy tinh sinh học Khi so sánh với quang phổ của Bioglass® thương mại, cả hai phổ sol – gel 1 và sol – gel 2 đều thể hiện dải dao động giống với Bioglass®. Hai dải rộng tại 930cm-1 và 1039cm-1 tương ứng với dải hấp phụ silicate lần lượt là các nguyên tử oxy không cầu nối kéo dài Si – O – Si và nguyên tử oxy bắt cầu kéo dài không đối xứng Si – O – Si trong khối tứ diện silicate. Dải silicate của cấu trúc Si – O – Si uốn cong cũng được quan sát tại 487cm-1 và 503cm-1. Peak nằm trong khoảng 602cm-1 và 880cm-1 là do cấu

10

trúc P – O uốn cong trong nhóm PO43-. Dải yếu được quan sát trong khoảng 1450 cm-1 liên quan đến sự hiện diện của nhóm carbonate còn lại từ tiền chất. Do đó, dải FTIR thu được từ sol – gel 1 và sol – gel 2 rất giống nhau và rõ ràng nó cho biết cấu trúc thủy tinh của hai bột sol – gel. Thêm vào đó, so sánh với Bioglass® thương mại chỉ ra rằng sự kết tinh một phần của hai loại thủy tinh sol – gel diễn ra suốt quá trình. Bột Bioglass® về bản chất là vô định hình nhờ quá trình tổng hợp nóng chảy – làm lạnh. Tuy nhiên các phổ XRD cho thấy có ít peak kết tinh có thể do tốc độ của bước làm lạnh. Ngoài ra cũng thấy các nhiễu xạ sol – gel 1 và sol – gel 2 rất giống nhau với độ kết tinh quan trọng hơn loại Bioglass®. Thực tế có rất nhiều pha tinh thể Natri-Canxi-Silicate bên trong cấu trúc vô định hình của thủy tinh hoạt tính. Trong đó, khoáng Na2Ca2Si3O9 là chất thú vị nhất được biết có ảnh hưởng đến thủy tinh hoạt tính. Sự hình thành pha khoáng này liên quan đến vấn đề xử lí nhiệt tại 700oC trong suốt giai đoạn sấy khô dùng cho tổng hợp sol – gel. So sánh chính xác các nhiễu xạ cho thấy sự hình thành pha Na2Ca2Si3O9 của sol – gel 2 rõ rệt hơn. Quan sát này đặc trưng cho thủy tinh sinh học tổng hợp bằng quá trình sol – gel khi so sánh với loại tổng hợp bằng quá trình nóng chảy – làm lạnh thông thường. Nó có thể ảnh hưởng đến hành vi của thủy tinh hoạt tính liên kết với môi trường sinh lí khi tính chất hóa học của vật liệu sau đó bị thay đổi, ví dụ như độ hòa tan.

11

Hình 3.1. Phổ FTIR của sol – gel và Bioglass® thương mại.

12

Hình 3.2. XRD của sol – gel và Bioglass® thương mại. 3.3. Đặc điểm diện tích bề mặt cụ thể của thủy tinh sinh học Kết quả thu được từ phương pháp BET chỉ ra rằng diện tích bề mặt cụ thể của vật liệu phụ thuộc vào quá trình và cũng như các điều kiện thử nghiệm tạo ra các loại bột. Diện tích bề mặt cụ thể của các loại bột sol –gel 1, sol – gel 2 và Bioglass® lần lượt là 0.6 m2.g-1, 0.9 m2.g-1 và 0.4 m2.g-1. Ảnh chụp hiển vi SEM cho thấy ba loại bột được tạo thành từ các hạt có kích thước đa dạng. Hạt lớn nhất khoảng 100 μm và bé nhất nhỏ hơn 10 μm. Bột sol – gel 2 có vẻ mịn hơn bột sol – gel 1, trong khi sol – gel 1 mịn hơn bột Bioglass®. Các ảnh hiển vi có độ phóng đại cao khi chụp các hạt lớn của mỗi loại bột đã cung cấp nhiều thông tin quan trọng. Bề mặt hạt của hai loại bột có thô và xốp cao trong khi đó bề mặt của của Bioglass® rất nhẵn. Thêm vào đó bột sol – gel 2 có độ thô và xốp hơn sol – gel 1. Các quan sát SEM này có thể liên quan đến các kết quả thu được bằng phương pháp BET, chỉ ra rằng diện tích bề mặt của hai loại bột sol – gel cao hơn của Bioglass®, đặc biệt là sol – gel 2. Độ thô xốp rất thấp của Bioglass® là do quá trình nóng chảy – làm lạnh sử dụng chất làm lạnh cực nhanh trong pha lỏng suốt giai đoạn làm lạnh. Tuy nhiên, quan sát ban đầu được chú ý ở hiện tại do liên quan đến ảnh hưởng đặc biệt của acid citric làm tăng độ thô và xốp của bột sol – gel. Bề mặt của bột sol – gel 2 có độ xốp cao và làm từ xilanh cỡ hạt nano. Nó chỉ ra rằng sử dụng acid citric làm chất xúc tác trong phản ứng thủy phân đã thay đổi hình thái bề mặt của hạt bột ở kích cỡ nano. Rõ ràng những kết quả này làm bật lên sự khác biệt giữa các bề mặt trao đổi chất sẽ dẫn đến nhiều hành vi khác nhau trong môi trường sinh lí.

13

Hình 3.3. Ảnh chụp hiển vi SEM của thủy tinh sol-gel và Bioglass® thương mại (độ phóng đại thấp và cao). 3.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học trong ống nghiệm cho thủy tinh sinh học Sau khi ngâm 1 giờ, ảnh SEM cho biết không có bất cứ thay đổi đáng kể nào xảy ra trên ba mẫu. Sau 4 giờ, đã có thay đổi quan trọng trên hình thái bề mặt và thành phần hóa học. Mẫu Bioglass® có sự phân tách nhẹ trên bề mặt hạt bột trong suốt quá trình ngâm trong dung dịch SBF mà không có sự khoáng hóa nào. Quang phổ EDXS

14

kết hợp chứng tỏ thay đổi chính trong thành phần hóa bề mặt là nhờ sự giảm nồng độ Natri đáng kể, nó chỉ ra rằng các phản ứng hoạt tính sinh học chỉ mới vừa bắt đầu trong suốt quá trình thử nghiệm. Đối với mẫu sol – gel 1 và 2, ảnh chụp hiển vi SEM cho thấy sự khoáng hóa quan trọng trên bề mặt sau khi ngâm trong SBF cùng với sự hình thành khoáng Canxi-photphat. Sự khoáng hóa bề mặt xác nhận bởi phổ EDXS thể hiện rõ ràng mức tăng cường độ của peak Canxi và Photpho.

Hình 3.4.Phân tích SEM-EDXS của sol – gel và Bioglass® thương mại sau thời gian ngâm vào SBF. Do đó, thử nghiệm hoạt tính sinh học trong ống nghiệm của hai mẫu sol – gel rõ ràng chỉ ra rằng mức độ hoạt tính sinh học của các loại bột thu được bằng phương pháp tổng hợp sol – gel cao hơn mức của Bioglass® thương mại. Ta thường xác định rằng khi ngâm thủy tinh hoạt tính trong môi trường sinh lí, pha khoáng làm giảm động lực phản ứng hoạt tính sinh học bằng cách thay đổi nó thành Canxi photphat vô định hình. Tuy nhiên, trong trường hợp này, thủy tinh sol – gel có hoạt tính sinh học cao hơn của Bioglass®. Các hạt của thủy tinh sol – gel cho biết độ thô và xốp cao của bề mặt cho nó khả năng trao đổi chất tốt hơn trong môi trường sinh lí. Do vậy bề mặt trao đổi chất

15

của thủy tinh sinh học sol – gel quan trọng hơn bề mặt của Bioglass® tổng hợp bằng quá trình nóng chảy – làm lạnh. Các phép đo BET xác nhận diện tích bề mặt cụ thể của hai loại bột sol – gel cao hơn của Bioglass®. Mặt khác, so sánh giữa sol – gel 1 và 2 chỉ ra mức độ hoạt tính sinh học của loại bột tương tự nhau. Do đó, sử dụng acid citric thay vì acid nitric như một chất xúc tác trong suốt quá trình tổng hợp sol – gel cho phép ta thu được thủy tinh sinh học 45S5 mà không cần thay đổi độ hoạt tính sinh học.

16

Chương 4 KẾT LUẬN Trong bài này chúng tôi chứng minh bột thủy tinh hoạt tính sinh học 45S5 có thể tổng hợp bằng quá trình sol – gel sử dụng dung dịch acid citric nồng độ cực thấp thay vì sử dụng dung dịch acid nitric có nồng độ cao để xúc tác phản ứng thủy phân. Đầu tiên chúng tôi xác định các điều kiện thử nghiệm tối ưu cho quá trình tổng hợp để đạt được điều kiện thành phần hóa học của 45S5 bằng cách thay đổi hai thông số: nhiệt độ phản ứng và nồng độ dung dịch acid. Thành phần hóa học tốt nhất của thủy tinh sinh học thu được ở cả acid nitric 2M tại 35oC và acid citric 5 mM tại nhiệt độ phòng. Sử dụng acid citric như chất xúc tác để tổng hợp sol – gel cho bột 45S5 làm giảm nồng độ acid cần thiết để xúc tác các phản ứng thủy phân TEOS và TEP. Sau đó chúng tôi so sánh hai loại bột sol – gel tối ưu với Bioglass® thương mại. Đặc điểm cấu trúc làm nổi bật sự kết tinh một phần của bột sol – gel vô định hình được tạo ra bởi nhiều pha NatriCanxi-Silicate bao gồm pha khoáng đặc biệt. Sự hình thành pha tinh thể có hoạt tính sinh học cao này có liên quan đến giai đoạn sấy khô cuối cùng ở 700oC trong suốt quá trình sol – gel. Cuối cùng chúng tôi so sánh độ hoạt tính sinh học trong ống nghiệm của các loại bột sử dụng phương pháp ngâm trong dung dịch SBF. Rõ ràng chứng tỏ mức độ hoạt tính của hai loại bột sol – gel cao hơn của Bioglass® thương mại. Hơn thế nữa, độ hoạt tính của thủy tinh sinh học chủ yếu bị ảnh hưởng bởi diện tích bề mặt cụ thể trong quá trình tổng hợp bột hơn là do pha kết tinh khoáng bên trong thủy tinh. Do đó, sử dụng acid citric như chất xúc tác thay vì acid nitric trong quá trình tổng hợp sol – gel cho phép ta thu được thủy tinh sinh học 45S5 mà không cần thay đổi độ hoạt tính sinh học. Sự phát triển phương pháp mới này rất hấp dẫn vì nó sử dụng các điều kiện thích hợp để thêm vào và tóm gọn các phân tử sinh học (protein, yếu tố tăng trưởng, thuốc,…) có thể giúp tăng nhanh tốc độ hình thành phát triển cấu trúc xương, không chỉ có khả năng ở hầu hết các giao thức do có pH cực độ hoặc do các điều kiện nhiệt độ cao. Viễn cảnh của sản phẩm này sẽ bao gồm việc nghiên cứu thời gian ngâm lâu hơn

17

trong môi trường sinh lí và quan sát hành vi của tế bào khi tiếp xúc với những bề mặt prothetic này.

18

TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] L.L. Hench, J. Am. Ceram. Soc. 81 (1998) 1705–1728. [2] V.J. Shirtliff, L.L. Hench, J. Mater. Sci. 38 (2003) 4697–4707. [3] L.L. Hench, Ceram. Int. 22 (1996) 493–507. [4] L.L. Hench, J. Eur. Ceram. Soc. 29 (2009) 1257–1265. [5] Y. Gu, G. Wang, X. Zhang, Y. Zhang, C. Zhang, X. Liu, M.N. Rahaman, W. Huang, H. Pan, Mater. Sci. Eng. C 36 (2014) 294–300. [6] X. Liu, M.N. Rahaman, G.E. Hilmas, B.S. Bal, Acta Biomater. 9 (2013) 7025– 7034. [7] L.L. Hench, J. Mater. Sci. Mater. Med. 17 (2006) 967–978. [8] J.R. Jones, E. Gentleman, J. Polak, Elements 3 (2007) 393–399. [9] J. Zhong, D.C. Greenspan, J. Biomed. Mater. Res. 53 (2000) 694–701. [10] D. Arcos, M. Vallet-Regi, Acta Biomater. 6 (2010) 2874–2888. [11] D. Avnir, T. Coradin, O. Lev, J. Livage, J. Mater. Chem. 16 (2006) 1013–1030. [12] B. Lei, X. Chen, Y.H. Koh, J. Sol-Gel Sci. Technol. 58 (2011) 656–663. [13] G.M. Luz, J.F. Mano, Nanotechnology 22 (2011) 494014. [14] Z. Hong, A. Liu, L. Chen, X. Chen, X. Jing, J. Non-Cryst. Solids 335 (2009) 368– 372. [15] B. Lei, X. Chen, Y. Wang, N. Zhao, C. Du, L. Fang, Biomed. Mater. 5 (2010) 054103. [16] D.J. Belton, O. Deschaume, C.C. Perry, FEBS J. 279 (2012) 1710–1720. [17] S.V. Patwardhan, Chem. Commun. 47 (2011) 7567–7582. [18] H.C. Schröder, X. Wang, W. Tremel, H. Ushijima, W.E. Müller, Nat. Prod. Rep. 25 (2008) 455–474. [19] T. Coradin, J. Livage, Colloids Surf. B: Biointerfaces 21 (2001) 329–336. [20] D. Belton, G. Paine, S.V. Patwardhan, C.C. Perry, J. Mater. Chem. 14 (2004) 2231–2241. [21] T. Mizutani, H. Nagase, N. Fujiwara, H. Ogoshi, Bull. Chem. Soc. Jpn. 71 (1998) 2017–2022.

19

[22] I. Cacciotti, M. Lombardi, A. Bianco, A. Ravaglioli, L. Montanaro, J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (2012) 1849–1866. [23] H. Pirayesh, J.A. Nychka, J. Am. Ceram. Soc. 96 (2013) 1643–1650. [24] N. Dumelie, H. Benhayoune, G. Balossier, J. Phys. D. Appl. Phys. 40 (2007) 2124–2131. [25] H. Benhayoune, J. Phys. D. Appl. Phys. 35 (2002) 1526–1531. [26] T. Kokubo, H. Takadama, Biomaterials 27 (2006) 2907–2915. [27] P.B. Wagh, A. Venkateswara Rao, D. Haranath, J. Porous. Mater. 4 (1997) 295– 301. [28] H.A. Elbatal, M.A. Azooz, E.M.A. Khalil, A. Soltan Monem, Y.M. Hamdy, Mater. Chem. Phys. 80 (2003) 599–609. [29] A. Lucas-Girot, F.Z. Mezahi, M. Mami, H. Oudadesse, A. Harabi, M. le Floch, J. NonCryst. Solids 357 (2011) 3322–3327. [30] L. Lefebvre, J. Chevalier, L. Grémillard, R. Zenati, G. Thollet, D. BernacheAssollant, A. Govin, Acta Mater. 55 (2007) 3305–3313. [31] Q.Z. Chen, I.D. Thompson, A.R. Boccaccini, Biomaterials 27 (2006) 2414–2425. [32] R.L. Siqueira, O. Peitl, E.D. Zanotto, Mater. Sci. Eng. C 31 (2011) 983–991. [33] I. Izquierdo-Barba, A.J. Salinas, M. Vallet-Regi, J. Biomed. Mater. Res. 47 (1999) 243–250. [34] R. Li, A.E. Clark, L.L. Hench, J. Appl. Biomater. 2 (1991) 231–239.

20

A new sol–gel synthesis of 45S5 bioactive glass using an organic acid as catalyst J. Faurea,*, R. Dreveta,*, A. Lemellea , N. Ben Jabera , A. Taraa , H. El Btaourib , H. Benhayounea a

Université de Reims Champagne-Ardenne, Laboratoire Ingénierie et Sciences

des Matériaux, LISM EA 4695, 21 rue Clément ADER, 51685 REIMS Cedex 2, France b

Université de Reims Champagne-Ardenne UMR CNRS MEDyC, EA 7369,

Campus Moulin de la Housse, 51687 REIMS Cedex 2, France * Corresponding authors ARTICLE INFO Article history: Received 5 July 2014 Received in revised form 10 October 2014 Accepted 11 November 2014 Available online 13 November 2014 Keywords: Bioactive glass 45S5 Sol–gel Citric acid In vitro tests Bioactivity ABSTRACT In this paper a new sol–gel approach was explored for the synthesis of the 45S5 bioactive glass. We demonstrate that citric acid can be used instead of the usual nitric

21

acid to catalyze the sol–gel reactions. The substitution of nitric acid by citric acid allows to reduce strongly the concentration of the acid solution necessary to catalyze the hydrolysis of silicon and phosphorus alkoxides. Two sol–gel powders with chemical compositions very close to that of the 45S5 were obtained by using either a 2 M nitric acid solution or either a 5 mM citric acid solution. These powders were characterized and compared to the commercial Bioglass®. The surface properties of the two bioglass powders were assessed by scanning electron microscopy (SEM) and by Brunauer–Emmett–Teller method (BET). The Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR) and the X-ray diffraction (XRD) revealed a partial crystallization associated to the formation of crystalline phases on the two sol–gel powders. The in vitro bioactivity was then studied at the key times during the first hours of immersion into acellular Simulated Body Fluid (SBF). After 4 h immersion into SBF we clearly demonstrate that the bioactivity level of the two sol–gel powders is similar and much higher than that of the commercial Bioglass®. This bioactivity improvement is associated to the increase of the porosity and the specific surface area of the powders synthesized by the sol–gel process. Moreover, the nitric acid is efficiently substituted by the citric acid to catalyze the sol–gel reactions without alteration of the bioactivity of the 45S5 bioactive glass. 1. Introduction Bioactive glasses are materials with osteoconductive and osteoproductive properties which confer them the ability to repair and replace diseased or damaged bone [1,2]. These properties result from their progressive dissolution in physiological medium, where the release of calcium, phosphate, and sodium ions will undergo the formation of an apatite layer that in turn will create a strong bond with the surrounding bone tissues [2–4]. Several compositions of bioactive glasses present a great interest such as sodium calcium phosphosilicate, borosilicates or 13–93 coumpounds [5,6]. Among them Larry Hench firstly developed the famous 45S5 Bioglass®, in the quaternary system SiO2–CaO–Na2O–P2O5, with an oxide composition that allows it

22

to bond both to hard and soft tissues (class A bioactivity). Therefore it has been used since decades in many medical devices employed for orthopedic and dental treatments [7,8]. Traditionally this commercial bioactive glass is produced by the conventional melting-quenching process which requires very high temperatures and greatly limits the porosity and specific surface of the powder finally obtained. Meanwhile, increasing research efforts are being invested to develop the sol–gel process which leads to bioactive glass powders of high purity and homogeneity. The sol–gel process also significantly expands the range of the chemical composition of bioactive glasses as compared to the traditional melting-quenching method [9,10]. These advantages make the sol–gel method very efficient for the synthesis of the 45S5 bioactive glass. Even though the sol–gel process is said to proceed under mild conditions, most protocols advocate the use of strong acid (nitric acid and hydrochloric acid principally) or bases (ammonium hydroxide) at elevated concentrations (up to 1 M) to catalyze the sol–gel reactions [11]. Therefore it is suitable to find ways to make the process cleaner avoiding the usually extreme pH or high temperature conditions of most protocols. In this context, several recent papers report on the synthesis of bioactive glass nanoparticles using different organic acids at very low concentrations (typically in the range of 0.01 M) to catalyze the chemical reactions involved during the process [12– 15]. In these works, citric acid solutions are commonly used to catalyze the hydrolysis of the silicon alkoxide (TEOS: tetraethylorthosilicate). This idea comes from finding inspiration in nature, therefore it is considered to be a biomimetic inspiration. Indeed, an interesting advancement of the sol–gel chemistry is the understanding of the biosilicification in diatoms and glass sponges [16,17]. These organisms accumulate silicic acid Si(OH)4 from their environment and, through the actions of proteins and other macromolecules, form complex silica structures [17,18]. The elucidation of the mechanisms underlying the biosilicification mechanisms has led to the in vitro synthesis of silica under physiological conditions using proteins, polypeptides, amino acids and mainly citric acid to catalyze the sol–gel reactions [19–21]. Considering the

23

specific composition of bioactive glasses and in particular its calcium and phosphate content, it may be necessary to draw inspiration from bone morphogenesis. Consequently, citric acid is here used to trigger the sol–gel reactions.

Thus the main objective of this work concerns the ability to succeed the synthesis of the sol–gel derived 45S5 bioactive glass by using a low concentrated citric acid solution to catalyze the hydrolysis reaction. Firstly, we determine the optimal sol–gel parameters to reach the 45S5 chemical composition by using either the conventional nitric acid or either the innovative citric acid as catalyst. In the second part we compare the physico-chemical properties and the in vitro bioactivity of the two optimal sol–gel powders with that of the commercial 45S5 Bioglass®. 2. Materials and methods 2.1. Sol–gel synthesis The sol–gel synthesis of the bioactive glasses proceeded according to a conventional protocol for the synthesis of 45S5 bioglass [22,23] using the following chemical precursors tetraethyl orthosilicate Si(OC2H5)4 (TEOS), triethyl phosphate PO(C2H5)3 (TEP), calcium nitrate tetrahydrate Ca(NO3)2,4H2O and sodium nitrate NaNO3. Two different aqueous acid solutions prepared with nitric acid (HNO3) or with citric acid (C6H8O7) were used to catalyze the hydrolysis reaction. The hydrolysis and condensation reactions were performed within a thermostated reactor to control the reaction temperature. The different elaboration parameters tested in this

24

work are listed in Table 1 and the flowchart of the sol–gel 45S5 fabrication process is presented in Fig. 1. The molar ratio of TEOS, TEP, NaNO3 and Ca(NO3)2·4H2O were designed according to the molar ratio of SiO2, P2O5, Na2O and CaO in 45S5. To achieve a clear sol the molar ratio between the aqueous acid solution and the four chemical precursors was set to 10. Firstly, the acidic solution (26 mL) was magnetically stirred in the thermostated reactor at the desired temperature and TEOS (11.6 mL) and TEP (1 mL) were added dropwise to the solution and stirred until a clear solution was obtained. Next, the NaNO3 powder (4.66 g) was slowly added in the stirred solution until its complete dissolution. Finally the Ca(NO3)2,4H2O powder (7.15 g) was added slowly to the solution stirred during 1 h to result in a transparent sol. Therefore the sol starts to transform into gel through polycondensation reactions. The gel was then kept at 60 °C for 12 h and finally dried at 200 °C and 700 °C for 5 h and 2 h respectively. After the drying step the gel was manually crushed to obtain a fine powder. Pellets of the obtained powders were then prepared with a manual press for the characterization of the elemental composition and for the bioactivity tests. In order to observe the specific properties of the two bioglasses synthesized by the sol–gel process, they were systematically compared to commercial Bioglass® synthesized by the classical melting-quenching process. 2.2. Physico-chemical and structural characterizations 2.2.1. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis (SEM– EDXS) The morphology of the synthesized powders was observed by SEM using a LaB6 electron microscope (JEOL JSM-5400LV) operating at 0–30 kV. This microscope is associated to an energy dispersive EDAX spectrometer equipped with an ultra-thin window Si(Li) detector cooled with liquid nitrogen. This spectrometer is associated with an acquisition and quantification system GENESIS (Eloïse SARL, France) based on the ZAF method used to determine the elemental concentrations of the analyzed sample [24,25]. All the X-ray microanalysis results presented in this work were obtained according to the following method: acquisition and quantification of four

25

spectra on four flat areas of the pellet selected by SEM. All the X-ray spectra were obtained with energy of 15 keV and an acquisition time of 100 s. The final values of elemental concentrations were obtained after calculation of mean values and dispersions.

2.2.2. Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR) Structural characterizations of the powders were performed by FTIR spectroscopy. The FTIR spectra were obtained in reflexion mode with a FTIR imaging system (Spotlight, Perkin–Elmer, Courtaboeuf, France) coupled to a spectrometer (Spectrum 300, Perkin–Elmer) in the 400– 2000 cm−1 range with a spectral resolution of 4 cm−1 . 2.2.3. X-ray diffraction (XRD) The crystallinity of the powders was studied by XRD with a Bruker D8 Advance diffractometer using a monochromatic copper radiation (CuKα) of wavelength λ = 0.15406 nm. The diffractograms were recorded in steps of 0.04° with an acquisition time of 12 s in a range of diffraction angles 2θ between 10 and 60°. The crystalline phases were then identified by the powder diffraction files of the International Centre for Diffraction Data (ICDD). 2.2.4. Determination of the specific surface area by BET method

26

Nitrogen adsorption measurements were carried out using a Micromeritics ASAP 2010 instrument at 77 K. The Brunauer–Emmett– Teller (BET) method was applied to derive the surface area from physisorption isotherm data. The isotherm was constructed point-bypoint by the admission and withdrawal of known amounts of gas, with adequate time allowed for equilibration at each relative pressure (P/P0, where P is the equilibrium vapor pressure and P0 is the saturation vapor pressure). The BET method is based on the determination of the monolayer capacity, i.e. the nitrogen amount corresponding to the adsorption of a complete monolayer (Vmono). Before analysis, the samples were maintained overnight at 170 °C in an oven. Prior to adsorption, they were out-gassed under vacuum at 250 °C for 1 h. The surface area is determined from a set of 10 experimental points of the linear range of the BET plot (0.05 b P/P0 b 0.3). The surface area (SBET) is calculated according to: 𝑆𝐵𝐸𝑇 =

𝑉𝑚𝑜𝑛𝑜 . 𝑁𝐴 . 𝐴 𝑉𝑀

where Vmono is the monolayer capacity (cm3 ·g−1 ) at T = 273 K and P = 101,325 Pa, NA is the Avogadro constant, A is the molecular crosssectional area (for nitrogen, A = 0.162 nm2 at 77 K) and VM is the molar volume (22414 cm3 ·mol−1 ). 2.3. In vitro bioactivity tests To evaluate the bioactivity of the synthesized powders, in vitro tests were performed in Simulated Body Fluid (SBF). This solution is acellular, protein free with a pH of 7.4 buffered with Tris–hydroxymethylaminomethane (TRIS). Table 2 shows the composition of SBF compared to human blood plasma. In vitro bioactivity tests were performed by soaking a pellet into SBF for two periods (1 h and 4 h) at 37 °C that correspond to the key times of bioactivity for bioactive glasses. The volume of SBF used during the test is calculated according to the procedure described by Kokubo and Takadama [26]: SBF volume (mL) = 10% pellet mass (mg). After the bioactivity test the pellet was extracted from the solution and immersed into acetone for 10 s to

27

remove SBF and stop surface reactions. After drying, the pellet surface was analyzed by SEM–EDXS for morphological and chemical composition analysis. n

3. Results and discussion 3.1. Optimization of the experimental conditions of the sol–gel process In the first part of this work we aim to determine the optimal experimental conditions to reach the 45S5 composition by varying parameters such as reaction temperature and concentration of the aqueous acid solutions used to catalyze the sol– gel reactions. Nitric acid has been tested as a catalyst by combining three temperatures (20 °C, 35 °C and 50 °C) and two concentrations (0.5 M and 2 M). Table 3 presents the results obtained by quantitative EDXS that provides the elemental compositions of the powders synthesized with these process parameters. The optimal parameters, which lead to the best composition very close to the theoretical one, are observed at 35 °C and 2 M (this sol–gel powder was named sol–gel1). The citric acid has been also tested as a catalyst by combining two temperatures (20 °C and 35 °C) and three concentrations (0.5 mM, 5 mM and 50 mM). Table 4 presents the results obtained by quantitative EDXS that provides the elemental compositions of the powders synthesized with these experimental parameters. In this case, the optimal parameters that provide the best chemical composition are observed at 20 °C and 5 mM (this sol–gel powder was named sol–gel2). The comparison of the two synthesized powders (sol–gel1 and sol–

28

gel2) shows that a lack of silicon and phosphorus is observed in both cases that can be attributed to the incomplete hydrolysis of the precursors and to the incomplete condensation due to unfavorable pH conditions. We can also observe a slight improvement of the chemical composition of the bioglass by using citric acid (sol– gel2). This behavior is probably due to the ability of citric acid to chelate calcium and sodium ions with its three carboxylic groups [13, 14,27]. Therefore we can conclude that the use of citric acid instead of nitric acid to catalyze the hydrolysis of TEOS and TEP leads to the sol– gel synthesis of the 45S5 bioactive glass with the expected chemical composition.

3.2. Structural characterization of the bioglasses The FTIR spectra of the two synthesized sol–gel glasses are presented in Fig. 2 and compared with the spectrum of the commercial Bioglass®. Both spectra of sol– gel1 and sol–gel2 reveal vibration bands similar to that of Bioglass®. The two broad bands at 930 cm−1 and 1039 cm−1 correspond to silicate adsorption bands which are respectively Si–O–Si stretching of non-bridging oxygen atoms and Si–O–Si asymmetric stretching of bridging oxygen atoms within the silicate tetrahedron. Silicate bands for Si–O–Si bending mode are also observable at 478 cm−1 and 503 cm−1 [28,29]. The peak at around 602 cm−1 and 880 cm−1 are attributed to P–O bending of

29

PO4 3− groups [28,29]. The weak bands observed at around 1450 cm−1 are related to the presence of residual carbonate groups from the precursors [29]. Thus, the FTIR spectra obtained from sol–gel1 and sol–gel2 are very similar and clearly reveal the glassy structure of the two sol–gel powders. In addition the comparison with the commercial Bioglass® indicates that a partial crystallization of the two sol–gel glasses occurred during the process. The structural characterization has been completed with XRD studies. The Bioglass® powder appears to be essentially amorphous due to the melting–quenching synthesis process. However the XRD patterns reveal few crystalline peaks probably due to the speed of the quenching step [30]. We can also observe that the diffractograms of sol–gel1 and sol–gel2 are very similar (Fig. 3) with a more important crystallization than that of Bioglass®. Indeed there are several crystalline sodium calcium silicate phases inside the amorphous structure of the bioactive glass. Among them, combeite Na2Ca2Si3O9 (ICDD PDF #22.1455) is the most interesting one as it is known to influence the bioactivity. The formation of the combeite phase is associated to the heat treatment performed at 700 °C during the drying step used for sol–gel synthesis [31]. An accurate comparison of the diffractograms reveals that the formation of the Na2Ca2Si3O9 phase is more pronounced in sol–gel2. This observation is characteristic of the bioactive glasses synthesized by the sol–gel process in comparison with those synthesized by the usual melting– quenching process [32]. This may impact the behavior of the bioactive glasses in contact with physiological environment as the chemical properties of the material, such as solubility, are then modified [30–32].

30

3.3. Characterization of the specific surface area of the bioglasses

31

The results obtained from the BET method indicate that the specific surface area of the materials clearly depends on the elaboration process and also on the experimental conditions used to produce the powders. Indeed, the specific surface area of sol–gel1, sol–gel2 and Bioglass® powders are respectively 0.6 m2 ·g−1 , 0.9 m2 ·g−1 and 0.4 m2 ·g−1 . The SEM micrographs of Fig. 4 show that the three powders are constituted by grains with diverse sizes. The biggest grains are about 100 μm in size and the smallest ones are less than 10 μm. The sol–gel2 powder seems to get more small grains than the sol–gel1 powder which itself seems to have more small grains than the Bioglass® powder. The high magnification micrographs carried out on one big grain of each powder provides very interesting information. The grain surface of the two sol– gel powders is highly rough and porous whereas for the Bioglass® powder the grain surface appears to be extremely smooth. In addition the roughness and porosity observed on the grain surface of sol–gel2 is higher than that of sol–gel1. These SEM observations can be related to the results obtained from the BET method which indicate that the specific surface area of the two sol–gel powders is higher than that of the Bioglass® powder, particularly for sol–gel2. The very low roughness and porosity of the Bioglass® powder is due to the melting–quenching process that uses an extremely quick cooling of the liquid phase during the quenching step [30]. However, the original observation highlighted in the present work concerns the specific effect of citric acid which increases the roughness and the porosity of the sol–gel powder. Indeed, the surface of the sol–gel2 grain powder is highly porous and made of nanoscale cylinders. This specific observation indicates that the use of citric acid as a catalyst of the hydrolysis reaction modifies the surface morphology of the grain powder at a nanometer scale. Obviously, these results highlight differences between the exchange surfaces of the powders that could lead to various behaviors in physiological environment.

32

3.4. In vitro bioactivity test of the bioglasses SEM micrographs and EDXS spectra of the samples obtained from Bioglass®, sol–gel1 and sol–gel2 powders before and after immersion in SBF solution are shown in Fig. 5. After 1 h of immersion, the SEM micrographs reveal that no significant change occurred on the three samples. After 4 h of immersion significant changes of the surface morphology and of the chemical composition are observed. For the

33

Bioglass® sample a slight dissociation of the pellet surface during immersion in the SBF solution can be observed without any evidence of its mineralization. The associated EDXS spectrum demonstrates that the main change in the surface chemical composition is due to a significant decrease in sodium concentration indicating that the bioactivity reactions are just starting during the test [1]. For the sol–gel1 and sol–gel2 samples, the SEM micrographs highlight an important mineralization of their surfaces after exposure to SBF associated to the formation of a calcium phosphate deposit [26,32]. This surface mineralization is confirmed by the EDXS spectra which clearly show a strong increase of the intensities of the peaks of calcium and phosphorus. Thus, the in vitro bioactivity test of the two sol–gel samples clearly indicates that the bioactivity level of the powders obtained by the sol–gel synthesis is much higher than that of the commercial Bioglass®. It is usually established that the combeite phase decreases the bioactivity reaction kinetic of the bioactive glasses when they are immersed in physiological environment by transforming it into amorphous calcium phosphate [31]. However, in this work, the bioactivity of the sol–gel glasses appears to be higher than the bioactivity of the Bioglass®. Indeed, the grains of sol–gel glasses reveal highly rough surfaces and porosity that provide high exchange surface in physiological environment. Thus the exchange surface of the sol–gel bioglass is more important than the exchange surface of the Bioglass® synthesized by the melting– quenching process. Indeed, the BET measurements confirmed that the specific surface area of the two sol–gel glasses is higher than that of the Bioglass® [33,34]. On the other hand, the comparison between sol–gel1 and sol–gel2 indicates that the bioactivity level of the two sol–gel powders seems to be very similar. Therefore the use of citric acid instead of nitric acid as catalyst during sol–gel synthesis allows to obtain the bioactive glass 45S5 without alteration of its bioactivity.

34

4. Conclusions In this work we demonstrate that the 45S5 bioactive glass powder can be synthesized by the sol–gel process with a very low concentrated citric acid solution instead the usual highly concentrated nitric acid solution to catalyze the hydrolysis reaction. Firstly, we determine the optimal synthesis experimental conditions to reach the 45S5 elemental composition by varying two parameters, the reaction temperature and the concentration of the acid solutions. The best chemical composition of the bioactive glass has been obtained either with nitric acid at 2 M and 35 °C or either with citric acid at 5 mM and room temperature. The use of citric acid as catalyst for the sol– gel synthesis of a 45S5 powder extremely decreases the acid solution concentration necessary to catalyze the hydrolysis reactions of TEOS and TEP. We then compare the two optimal sol–gel powders with the commercial Bioglass®. The structural characterizations highlight a partial crystallization of the amorphous sol–gel powders which are made of several sodium calcium silicate phases including the combeite in particular. The formation of this highly bioactive crystal phase is associated to the last drying step at 700 °C during the sol–gel process. Finally we compare the in vitro bioactivity of the powders by using immersion tests into SBF solution. We clearly demonstrate that the bioactivity level of the two sol–gel powders is much higher than

35

that of the commercial Bioglass®. Moreover, the bioactivity of the bioactive glasses is mainly influenced by the specific surface area of the synthesized powder rather than the presence of the combeite crystalline phase inside the glass. Thus the use of citric acid instead of nitric acid as catalyst during the sol–gel synthesis allows to obtain the bioactive glass 45S5 without altering its bioactivity. The development of this new process is very attractive as it uses conditions suitable to add and encapsulate biomolecules (proteins, growth factor, drugs, etc.) that could help speed up the bone growth formation which is not only possible in most protocols owing to the usually extreme pH or high temperature conditions. A perspective of this work will then consist in the study of longer immersion time in physiological medium and observations of cell behavior in contact with these prosthetic surfaces. Acknowledgment The authors sincerely thank Professor Aldo R. Boccaccini from the University of Erlangen-Nuremberg and the Imperial College of London for kindly providing the commercial Bioglass® studied in this work. They also express their gratitude to Professor Hassan Oudadesse from the University of Rennes 1 for the BET measurements. References [1] L.L. Hench, J. Am. Ceram. Soc. 81 (1998) 1705–1728. [2] V.J. Shirtliff, L.L. Hench, J. Mater. Sci. 38 (2003) 4697–4707. [3] L.L. Hench, Ceram. Int. 22 (1996) 493–507. [4] L.L. Hench, J. Eur. Ceram. Soc. 29 (2009) 1257–1265. [5] Y. Gu, G. Wang, X. Zhang, Y. Zhang, C. Zhang, X. Liu, M.N. Rahaman, W. Huang, H. Pan, Mater. Sci. Eng. C 36 (2014) 294–300. [6] X. Liu, M.N. Rahaman, G.E. Hilmas, B.S. Bal, Acta Biomater. 9 (2013) 7025– 7034. [7] L.L. Hench, J. Mater. Sci. Mater. Med. 17 (2006) 967–978. [8] J.R. Jones, E. Gentleman, J. Polak, Elements 3 (2007) 393–399.

36

[9] J. Zhong, D.C. Greenspan, J. Biomed. Mater. Res. 53 (2000) 694–701. [10] D. Arcos, M. Vallet-Regi, Acta Biomater. 6 (2010) 2874–2888. [11] D. Avnir, T. Coradin, O. Lev, J. Livage, J. Mater. Chem. 16 (2006) 1013–1030. [12] B. Lei, X. Chen, Y.H. Koh, J. Sol-Gel Sci. Technol. 58 (2011) 656–663. [13] G.M. Luz, J.F. Mano, Nanotechnology 22 (2011) 494014. [14] Z. Hong, A. Liu, L. Chen, X. Chen, X. Jing, J. Non-Cryst. Solids 335 (2009) 368– 372. [15] B. Lei, X. Chen, Y. Wang, N. Zhao, C. Du, L. Fang, Biomed. Mater. 5 (2010) 054103. [16] D.J. Belton, O. Deschaume, C.C. Perry, FEBS J. 279 (2012) 1710–1720. [17] S.V. Patwardhan, Chem. Commun. 47 (2011) 7567–7582. [18] H.C. Schröder, X. Wang, W. Tremel, H. Ushijima, W.E. Müller, Nat. Prod. Rep. 25 (2008) 455–474. [19] T. Coradin, J. Livage, Colloids Surf. B: Biointerfaces 21 (2001) 329–336. [20] D. Belton, G. Paine, S.V. Patwardhan, C.C. Perry, J. Mater. Chem. 14 (2004) 2231–2241. [21] T. Mizutani, H. Nagase, N. Fujiwara, H. Ogoshi, Bull. Chem. Soc. Jpn. 71 (1998) 2017–2022. [22] I. Cacciotti, M. Lombardi, A. Bianco, A. Ravaglioli, L. Montanaro, J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (2012) 1849–1866. [23] H. Pirayesh, J.A. Nychka, J. Am. Ceram. Soc. 96 (2013) 1643–1650. [24] N. Dumelie, H. Benhayoune, G. Balossier, J. Phys. D. Appl. Phys. 40 (2007) 2124–2131. [25] H. Benhayoune, J. Phys. D. Appl. Phys. 35 (2002) 1526–1531. [26] T. Kokubo, H. Takadama, Biomaterials 27 (2006) 2907–2915. [27] P.B. Wagh, A. Venkateswara Rao, D. Haranath, J. Porous. Mater. 4 (1997) 295– 301.

37

[28] H.A. Elbatal, M.A. Azooz, E.M.A. Khalil, A. Soltan Monem, Y.M. Hamdy, Mater. Chem. Phys. 80 (2003) 599–609. [29] A. Lucas-Girot, F.Z. Mezahi, M. Mami, H. Oudadesse, A. Harabi, M. le Floch, J. NonCryst. Solids 357 (2011) 3322–3327. [30] L. Lefebvre, J. Chevalier, L. Grémillard, R. Zenati, G. Thollet, D. BernacheAssollant, A. Govin, Acta Mater. 55 (2007) 3305–3313. [31] Q.Z. Chen, I.D. Thompson, A.R. Boccaccini, Biomaterials 27 (2006) 2414–2425. [32] R.L. Siqueira, O. Peitl, E.D. Zanotto, Mater. Sci. Eng. C 31 (2011) 983–991. [33] I. Izquierdo-Barba, A.J. Salinas, M. Vallet-Regi, J. Biomed. Mater. Res. 47 (1999) 243–250. [34] R. Li, A.E. Clark, L.L. Hench, J. Appl. Biomater. 2 (1991) 231–239.