改良环介导等温扩增技术快速检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌

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瑟 　

■固圈 　

微 生 物 学 报 Ａｃｔ ａ　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏｂｉ ｏｌ ｏｇｉ ｃ ａ　 Ｓｉ ｎｉ ｃ ａ　 ４９（ ３）： ３７８—３８２；４　Ｍａ ｒ ｃｈ　 ２ ００９ 　 Ｉ ＳＳＮ　 ０００１—６２０９：ＣＮ　１ｌ一１９ ９５／ Ｑ　 ｈｔ ｔ ｐ： ／ ／ ｊ ｏｕｒ ｎ ａｌ ｓ． ｉ ｍ． ａ ｃ． ｃｎ／ ａｃ ｔ ａ ｍｉ ｃｒ ｏ ｃｎ　

改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴儿 配 方 奶 粉 中 的 阪 崎 肠　 杆 菌　 胡连 霞 ，张伟　 ， 张先 舟 ， 袁耀 武 ，张蕴 哲 ， 张会 彦 ， 马 晓 燕 ，苏旭 东　 （ 河 北 农 业 大 学食 品科 技 学 院 ， 保 定 ０７１ ００１） 　

摘 要 ：【目的】采用改 良环介 导等 温扩增 （ＬＡＭＰ）技术 ， 快 速检 测婴 儿 配方 奶粉 中的 阪崎 肠杆 菌 。【方 法 】以阪　 崎肠 杆菌 （ ＡＴＣＣ２ ９５４ ４）的 １６Ｓ一 ２３Ｓ 　 ｒ ＲＮＡ间区序 列作 为 靶 序列 ， 设 计 内、外 引物 和 环引 物 ， 通过 肉眼观 察 白色　

沉淀 ， 判断检 测结果 。 【 结果】 ＬＡＭＰ检测 阪崎肠杆 菌 的灵 敏度 为 ０． １ ０１ 　ＣＦＵ／ ｍＬ， 人工 污染 阪崎 肠杆 菌 的婴儿　 配方 奶粉 的检 出限为 １． １ 　ＣＦＵ／ ｇ。采用试 剂盒提 取 ＤＮＡ， 从 样 品处 理到 报告 结果 ， 耗时 １ 　ｈ。而对 照 ， ＰＣＲ检　 测 阪崎肠杆 菌 的灵 敏度 为 １ ０１ 　ＣＦＵ／ ｍＬ， 人工 污染 阪崎肠 杆菌 的婴 儿配 方奶 粉 的检 出 限为 １１ ００ 　ＣＦＵ／ ｇ。采用　

同样 方法提 取 ＤＮＡ， 从样 品处 理到报 告结 果 ， 耗时 ３ 　ｈ。【 结 论 】因此 ， ＬＡＭＰ检测 婴儿 配方 奶粉 中的 阪崎 肠杆　 菌灵 敏度 高 ， 耗 时短 ， 方 法简便 。 　 关 键词 ：环介导 等温 扩增 ； ＬＡＭＰ； 检测； 阪 崎肠杆 菌 ；婴儿 配方 奶粉　 中 图 分 类 号 ：Ｑ９３— ３ 　

文献标 识码 ： Ａ　

文章 编号 ： ０００１— ６２ ０９ （ ２ ００９）０３— ０３７８． ０５ 　

阪 崎肠 杆 菌 （Ｅｎｔ ｅ ｒ ｏ ｂａ ｃ ｔ ｅ ｒ 　 ｓ ａ ｋａ ｚ ａｋｉ ｉ ）是 人 和 动 物　

ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ， ＬＡＭＰ） 是 Ｎｏｔ ｏｍｉ等在 ２ ０００年 开发 的一　

肠道 内寄生 的一种 革 兰 氏 阴性 无 芽孢 杆 菌 ， 属 肠 杆　

种 新 颖 的 恒 温 核 酸 扩 增 方 法 ，其 原 理 是 针 对 目的 基　

菌科 。 阪崎 肠杆菌 是 条 件致 病 菌 ， 在 一定 条 件 下 对　

因的 ６个 区域设计 ４条 特 异 引物 ， 利 用 一 种链 置换　

所有 人 群都 有致 病 性 ， 尤其 对 出生 ２８天 内 ， 低 体 重　

ＤＮＡ聚合酶 （Ｂｓ ｔ 　ＤＮＡ　ｐｏ ｌ ｙ ｍｅ ｒ ａｓ ｅ）在等 温 ６５℃左右 ， 　

儿 或免疫 力低下 的婴 幼 儿 ，引起 严 重 的新 生 儿 脑 膜　

几十分 钟 ，即可实现 核酸 的高效扩 增　～Ｊ 。４条引 物　

炎、 菌血症 、 小肠 结肠炎 ， 并可 能引起 神经 功能紊 乱 ， 　

对靶序 列 的 ６个特 异序列 区域 的识别 ， 保 证 了 ＬＡＭＰ 　

造成 严重 的后遗 症 ， 死亡率高达 ２ ０％ ～５０％ 以 上 ， 　

扩增 的 高 度 特 异 性 。 ＬＡＭＰ不 需 要 模 板 的 热 变　

只有婴儿 配方奶 粉 中的阪崎肠 杆菌 与疾病 的爆 发相　

性。 　， 。 长 时间温度 循 环 ， 在 等 温条 件 下扩 增 ， 不 会 因　

联 系 ，已经 引 起 世 界 范 围 内 的广 泛 关 注　Ｉ ３ 　。 目前　

温度改 变而造 成时 间的浪 费 。有无 肉眼可见 的焦磷　

对 阪崎 肠 杆 菌 的检测 方 法 主 要有 ＦＤＡ推 荐 的 传 统　

酸镁 的白色 沉 淀　

检测 方法 ， 免疫学 方法 和各 种 ＰＣＲ方 法 。传统 检 测　

简单 的方法 。ＬＡＭＰ将成 为可 以替代 ＰＣＲ的核酸扩　

方法 操作繁 琐 ， 检 测 时 间长 ， 而 且灵 敏度 较 低 ； 免 疫　

增 的新 技术 。增加 环 引物 的环介 导 等 温 扩增 方法 ， 　

学 方法 的特异性 和灵敏 度也不 理想 ； ＰＣＲ方 法敏感 、 　

使反应 速度 可提高 １ ／ ２～１ ／ ３＿ ｌ 　。 　

快 速Ｈ　， 但 由于需要 昂贵 的仪 器设 备 、 繁 琐 的电泳 过　 程 以及对 检测人 员较 高 的 技术 要 求 ，而 使其 难 以在　 基 层普及 和推 广 。 　

环 介 导 等 温 扩 增 （Ｌｏｏ ｐ— ｍｅｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ　ｉ ｓ ｏ ｔ ｈｅ ｒ ｍａ ｌ 　

， 成 为 判 断核 酸 是 否 扩 增 的最　

１ 材 料和 方 法　 １． １ 材 料　

１． １． １ 　 主 要仪 器 设备 和 试 剂 ：电热 恒 温 水浴 锅 ，高　

基金项 目： 河 北 省 自然科 学基 金 （ Ｃ２０ ０８０ ０ ０２１ ６） 　

通 信 作者 。Ｔｅ ｌ ： ＋８ ６— ３１ ２－ ７５２ ８１ ８６；Ｅ－ ｍａｉ ｌ ：ｚ ｈａ ｎ ｇ ｗｅ ｉ ６３１ １ ２６＠ｙ ａ ｈｏ ｏ． ｃ ｏ ｎ． ｒ ｃ ｎ 　 作者简介： 胡 连 霞 （１ ９７ ２一）， 女， 河北省献县 ， 硕士 ， 从 事 有 害 微 生 物 检 测 及控 制 的研 究 。Ｅ． ｍａ ｉ ｌ ： ｈ ｕｌ ｉ ａ ｎ ｘｉ ａ１ ６ ８＠ｔ ｏ ｍ． ｃ ｏｍ　 收 稿 日期 ： ２ ００８ ． １１ － １ １： 修 回 日期 ： ２ ００８ ． １ ２． ０８ 　

胡 连 霞等 ：改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴儿 配 方 奶 粉 中的 阪 崎 肠 杆 菌 ． ／ 微 生 物学 报 （２０ ０９） ４９（ ３） 　

３７９　

速冷 冻离 心 机 （ＳＩ ＧＭＡ３Ｋ３０， 德 国西格 马 公 司 ），ＰＣＲ　

工污 染不 同浓 度 的 阪崎 肠杆 菌 ，人 工污 染 的奶 粉溶　

扩 增 仪 （Ｗｈａ ｔ ｍａ ｎ 　Ｔ　Ｇｒ ａ ｄｉ ｅ ｎｔ基 因 扩 增 仪 ，德 国　

液 中 阪 崎 肠 杆 菌 的 浓 度 为 １． １ ０×１ ０　ＣＦＵ／ ｍＬ　

Ｂｉ ｏｍｅｔ ｒ ａ公 司 ），恒 温 培 养 箱 ，凝 胶 成 像 系 统　

１． １ ０×１ ０～ ＣＦＵ／ ｍＬ。同 时从 每 稀 释度 奶 粉 溶 液 中取　

（Ｋｏ ｄａ ｋＥＤＡＳ２ ９０， 美 国柯 达 公 司 ），电泳 仪 （北 京 市 六　

１ 　ｍＬ分别 加入 ｌ 　ｍＬ无水 乙醇 、ｌ 　ｍＬ氨水 和 ｌ 　ｍＬ石　

厂 生 产 ＤＸＹ． ３３Ａ 型 ），微 量 移 液 器 （０． １ ～　

油醚 ， 混 匀 。混 合 物 以 ９５ ６２． ５×ｇ， 离心 １ ０　 ｍｉ ｎ。弃　

１ ０ ００ＬＩ ＢＩ ＯＨＩ Ｔ芬兰 ）等 。 ＤＮＡ试 剂 盒 （Ｂｉ ｏ 　Ｂａ ｓ ｉ ｃ 　Ｉ ｎｃ． 　

去上 清 液 ，剩 余 的 沉 淀 分 别 用 １ 　ｍＬ　１ ０　ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ　ＴＥ　

１ ６ ０　 Ｔ０ｒ ｂａ ｙ 　Ｒｏ ａ ｄ，Ｍａｒ ｋｈ ａｍ　Ｏｎｔ ａｒ ｉ ｏ 　Ｌ３Ｒ　１ 　 Ｇ６ 　Ｃａ ｎａｄ ａ）， 　

（ ｐＨ７． ８）溶解 。再 用 试剂 盒 法 提 取 溶 液 中 阪崎 肠 杆　

Ｂｓ ｔ ＤＮＡ聚合 酶 ，Ｔａ ｑ　 ＤＮＡ聚合 酶 ，ｄＮＴＰ，１ ０×Ｌｏ ａｄ ｉ ｎｇ 　

菌基 因组 ＤＮＡ，直 接 进 行 ＬＡＭＰ和 ＰＣＲ检 测 ，确定　

ｂｕ ｆｅ ｒ， ＤＮＡ　 Ｍａｒ ｋｅ ｒ 　 ＤＬ１ ００、 ＤＬ２０００， ＬＡＭＰ引 物等 购 自　

检 出限 。 　

或合 成 于上海 生工 生 物 工程 有 限公 司 ；营养 肉汤 培　

１． ２． ３ 模 板 ＤＮＡ的制 备 ： 用 ＤＮＡ试 剂盒 提 取 阪崎　

养基 ， 营养 琼脂 培养基 等 购 自北京 路桥 公 司。 　

肠杆 菌 ＤＮＡ，按 照 制 造 商 的说 明所 提 取 的 ＤＮＡ， 溶　

１． １． ２　 菌 株 ：本 实 验 室 保 存 的 阪 崎 肠 杆 菌　

解在 １ ００　 的洗脱 缓 冲液 中 ， 储 存在 一２ ０℃备 用 。 　

（ ＡＴＣＣ２９５ ４４、ＡＴＣＣ５１ ００７、ＡＴＣＣ５１ ０２ ４），由南 开 大 学　

１． ２． ４ 引 物设 计 ：为 了检 测 阪崎 肠 杆菌 ，针对 阪崎　

生命 学 院提供 。 　

肠 杆菌 （ ＡＴＣＣ２ ９５４４）Ｇｅ ｎＢａ ｎｋ中 （ 基 因号 ＡＹ７０２０９ ３） 　

１． １． ３ 样 品来源 ： 婴 儿配方 奶 粉购 自当地超 市 。 　

１ ６Ｓ． ２３Ｓ　 ｒ ＲＮＡ间区序列 ， 运 用 引物设 计 软件 （ｈｔ ｔ ｐｓ： ／ ／ 　

１． ２ 方 法　

ｐｒ ｉｍｅ ｒ ｅ ｘｐｌ ｏ ｒ ｅ ｒ ．ｉ ｐ／ ｌ ａ ｍｐ３． ０． ０／ ｉ ｎｄｅ ｘ．ｈｔ ｍ１） 在 线 进 行　

１． ２． １ 纯菌 培养 ： 阪崎 肠杆 菌 接种 于 新鲜 无 菌 的 营　

ＬＡＭＰ引 物设 计 。引 物 设 计 的原 则 如 ｎｏ ｔ ｏｍｉ 　ｅ ｔ 　ａ ｌ Ｌ ５ ｊ 　

养 肉汤培 养基 中 ， ３７℃培 养 １ ２　 ｈ。用 生 理 盐 水 进 行　

所述 。设 计 的 ６条 引物是 ： ２条 外 引 物 （Ｆ３和 Ｂ３）， ２ 　

１ ０倍 系列稀 释 ， 一直 稀释 到 １ ０　。采用稀 释 平板 法 ， 　

条 内引物 （ＦＩ Ｐ和 ＢＩ Ｐ），以及 ２条 环引 物 （ ＬＦ和 ＬＢ）。 　

测定 其 纯 培养 物 活 菌 数 为 １． ０１×１ ０ 　ＣＦＵ／ ｍＬ；同时　

２个 外 引物 被 描 述 为上 游 外 引 物 （Ｆ３）和 下游 外 引　

一

物（ Ｂ３）。２个 内引 物 被 描 述 为上 游 内引 物 （ＦＩ Ｐ）和　

从每 稀释度 菌 液 中取 １ 　ｍＬ直 接 用试 剂 盒法 提 取 阪　

下游 内 引物 （ ＢＩ Ｐ）。此外 ， 两个 环 引物被 描 述 为上游　

崎肠 杆菌基 因组 ＤＮＡ， 作 为模 板 ， 进 行 ＬＡＭＰ和 ＰＣＲ　

环 引物 （ＬＦ）和 下 游 环 引 物 （ ＬＢ）。扩 增 基 因组 中 的　

试验。 　

１． ２． ２ 人 工污染 婴儿 配方 奶 粉 ： 在人 工 污染 阪崎肠　 杆菌前 ， 婴儿 配 方奶粉 按 ＦＤＡ推荐 的常 规检 验 法 和　 ＰＣＲ法 检测证 实不 含 阪崎肠 杆菌 。然后将 阪崎 肠 杆　 菌人 工 污染 到婴儿 配方 奶 粉 中 ： 取 ２５ 　ｇ婴 儿 配 方奶　 粉溶 于 ２２５ 　ｍＬ灭菌生 理盐 水 中 ， 然 后对 奶粉 溶 液人　

位 置从 ４３９至 ６２７区域 １ ８９ 　ｂｐ目的基 因片 断 。引物　 的名称 和具 体 序列见 表 １。ＦＩ Ｐ由 Ｆ１的一 个互 补序　 列 和 正 向序 列 Ｆ２构 成 。ＢＩ Ｐ由 Ｂ１的一个 互 补 序列　 和正 向序列 Ｂ２构 成 。每 条 引 物在 基 因组 中具 体 的　 位 置 如 图 １所 示 。 　

表 １ 　 ＬＡＭＰ 引 物　 Ｔａｂｌ ｅ　１ 　 ＬＡＭ Ｐ　 ｐｒ ｉｍ ｅｒ ｓ　

Ｐｒ ｉ ｍｅ ｒ 　 ａｎ ｎ ｉ ｅ 　

Ｓ ｅ ｑ ｕｅ ｎ ｃｅ （５ 　 —｝３ 　） 　

Ｆｏｒｗａｒｄ　ｏｕｔ ｅｒ（Ｆ３） 　

ＡＡＡ　 Ｉ 　 ＣＧＣＧＧＴＧＴＧＴＣＡＧ　

Ｂａ ｃ ｋ ｗａ ｒｄ 　 ｏ ｕｔ ｅ ｒ（ Ｂ３） 　 Ｆｏｒ ｗ ａｒｄ　ｉ ｎｎｅｒ 　ｐｒ ｉｍｅｒ（ＦＩ Ｐ） 　

ＧＧＴＩ ＴＣＣＣＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＴ　

Ｂａ ｃ ｋ ｗａ ｒ ｄ 　 ｉ ｎｎ ｅ ｒ 　 ｐ ｉｍｅ ｒ ｒ（ＢＩ Ｐ） 　

ＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＡＴＧＣＧＣＣＧＧＴＴＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＡ　

Ｆｏ ｗａ ｒ ｒｄｌ ｏ ｏｐ 　 ｐｒ ｉｍｅ ｒ（ＬＦ） 　 Ｂａ ｃ ｋ ｗａ ｒ ｄ 　 ｌ ｏ ｏ ｐ　 ｐ ｉｍｅ ｒ ｒ（ ＬＢ） 　

ＡＧＣＧＣＣＧＧＴＡＡＧＧＴＧＡＴＡ　

ＡＣＣＧＴＧＴＡＣＧＣＴｒＧＴＴＣＧＣ　 ＩＴｒＣＴＣＴＣＡＡＡＣＴｌ ＣＧＣＡＧＣＡＣ　

ＡＡＣＣ　 ｒＣＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡ　

４ ０１ 　 ｒＩ （　 ＡＡＣＡＧ　ＡＣ　畸 ＣＫ） ＣＴ　ＯＣ　兀　 ＴｃＣ　Ｇ　 丑　 ＧＡＡ ￣

（　

・

４ ８１ 　Ｇ　 ＴＫＴＩ ∞

Ｆ３　

－ 　 （　

ＧＧ． 兀 Ｇ弼 ＡＯＧ　１　 ｌ ＡＡＯ。ＧＡＡＣ　ＡＡ（ Ｋ￣ Ｔ ＡＣＡＣ　ＧＧ． Ｉ（硒ｌ Ａ［ ０３Ｃ　ｃｒ ｃＫｉ ＣＡＧＩＣＡ　Ｇ　

． ． 卜－——一 ＬＦ—・———＿＿■－ ． －＿ ＿—＿－——— Ｆ１———————－ － － 　 ５６１ 　ＡＡ１ＣＩ （阢

ＧＧＴＧ　ＴＧＴＣＡＧＡＧＴＣ　ＴＣ１ ＵＡＡＡＣＴＣ　ＧＣＡＧＣＡＣＧＡＡ　

　 Ａ　Ａ　

Ｆ２　 ０Ｇ＾ Ⅱ 　 Ａ０ＧＡ。（ 　Ｇ（ 　

●．一 －－—一 Ｂ １ ———－——　

ａＣＣＧＧＴ　ＡＡＯＧ． Ｉ （ 　 Ⅲ　 ＧＡＡＯ。（ 订 Ⅱ　 ＡＡ　 Ⅺ００ＧＡＴ　Ｇ． Ｉ Ｃ０　

Ｇ０　

ａｌ Ｉ＝ ＧＧ　ＴＣ ＣＡ￣

　

图 １ 每 条 引 物在 基 因 组 中 的 位 置　 Ｆｉ ｇ．１ 　 Ｅａｃｈ　ｐｒ ｉｍｅｒ　ｉ ｎ　ｔ ｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ 　ｔ ｈｅ　ｌ ｏｃａｔ ｉ ｏｎ．Ｏｌ ｉ ｇｏｎｕｃｌ ｅｏｔｉ ｄｅ　ｐｒ ｉｍｅｒ ｓ 　ｕｓｅｄ　ｆ ｏｒ 　ＬＡＭＰ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｅｎｔ ｅｒｏｂａｅｔ ｅｒ　ｓ ａｋａｚａｋｉ 　ｆ ｒ ｏｍ　ｔ ｈｅ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｄａｔ ａｂａｓｅ　

（ａ ｃ ｃ ｅｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　Ｎ ｏ． ＡＹ７０ ２０９ ３）ｗｉ ｔ ｈｉ ｎ 　 ｔ ｈｅ 　 １ ６Ｓ一 ２３Ｓ 　 ｒ ＲＮＡ　 ｇ ｅ ｎｅ． Ｇｅ ｎｏ ｍｅ 　 ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ　 ｆ ｒ ｏ ｍ　 ｔ ｈｅ 　 ｐｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ　 ｏｆ 　 ４３９ － ６ ２７ 　ｒ ｅ ｇ ｉ ｏｎ 　 １８ ９ 　 ｂｐ 　 ｇｅ ｎ ｅ 　 ｒａ ｆ ｇ ｍｅ ｎｔ ｓ．ＦＩ Ｐ 　 ｃ ｏｎ ｓ ｉ ｓ ｔ ｓ 　 ｏ ｆ 　 ａ　 ｃｏｍｐｌ ｅｍｅｎｔ ａｒ ｙ　ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ 　Ｆ１ 　ａｎｄ　ａ　ｓ ｅｎｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　 Ｆ２．ＢＩＰ　ｃｏｎｓｉ ｓｔ ｓ　ｏｆ 　ａ　ｃｏｍｐｌ ｅｍ ｅｎｔ ａｒ ｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ 　ｏｆ 　Ｂ１ 　ａｎｄ　ａ　ｓｅｎｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　 Ｂ２． 　

3 80

1 2 ．

)各

B IP

物 (LF 和

1 6 弘m

t

D NA

MA

) (2 0

10

)各

LB

)

X 10 0

B io l a b s

in

m

沉淀 bu ffe

B3

8

肚m

l ／L d N T P

Lo

u

is

，

m m o

．

Mo

)

．

，

B

ly

e v e r

20

s

in

，

，

2

)

，

E

)

8 8 ．

0

2 肛m

．

10

，

4

然后 将其放人

B io la b s

m m o

l ／L K C l

n

此 外 取扩增 产物

0

，

E

，

与

汕 的

1

反应

LA MP

反应

P CR

扩增反应 的

B3

反应 体 系包 括

) (

10 0

25

物各 10

m

，

10

×

的

退火

57 ℃

，

(

—

s

95 ℃

；延

伸

与

1 肛L

产物

5 肛L

匀 进行

1 5 ％

琼 脂 糖 凝 胶 电泳

。

，

，

d

p l i fi

u a

u s e

t io n

r e a c

a m

—

is

i s ib l e d to t he

te

r

r e s u

il e

Tu be B

．

c a

s

l

t io n n a

，

ke d

w

e

lts

o

：

p o s i t iv

hi te

f

the

in s t e

w a te r

a

LA MP

lt s

r e s u

e

，

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pyr o pho s pha te

i n t he po s it iv

ye

r e a c

d o f DNA

e

n

Tu be A

．

te m p la t e o

c a u s e

m a

r e a c

t io

gn

iu

e s

t io n

o

f

f

p

pre

m

a

la r g e

t he

m

ix tu

c

16 S 2 3 S 一

，

的

r

S

l ／L

D NA

进行

。

混合均

r

。

～ 一 一 一 一 ～

间 区 序列 即靶 序 ，

反应结果如图

。

MP

反 应

LA MP

反 应 产 生 了 白色 沉 淀 ，

和

L AM P

2

所示

没 有 产 生 白色 沉 淀

LAMP

，

P CR

10 0 0

对 。

检测 婴 儿 配 方 奶 粉 中的 阪崎 肠

杆菌 的 试 验

；

，

而

A

管未 发 生

B

管发生 了 10

检测 阪崎肠 杆 菌 的纯 培 养物 的

带

阪崎 肠 杆 菌 经 培养 采 用 稀 释 平 板 法 测 得 原 菌 ，

10

“

1 0 l ．

×

10

。

。

C F U ／m L

，

10

倍 系列稀释 进行

方法 在稀释到

LA MP

，

．

01

×

10

- 2

)时未 出现 沉 淀 电泳 也 无 梯形 条 ，

即 检 测 阪崎 肠 杆 菌 灵 敏 度 达

。

应 的沉 淀 图如 图 所示

。

3 A

而 常规

一

0

．

1 0 1 C F U ／m L

，

相

所 示 琼脂 糖 凝胶 电泳 图如 图 ，

P CR

稀释到

10

能检 测 到 阪 崎 肠 杆 菌 稀 释 到 ，

10

。

’

倍(1 倍(1

．

．

01

01

× ×

10

10

。

)时

。

)时

，

10

’

)时 出现 沉 淀 电泳 也 有 梯 形 条 带 ，

倍 (1

，

和 常 规 P C R 检 测 阪 崎 肠 杆 菌 的灵 敏 度 试 验 如

所示

”

3 B ．

3

w 心 一

。

灵 敏 度 的 比较

图

．

一 一 ～ 一 一 一

，

个循

35

条环 引物 的特 异 引 物

2

A L

MP

f

一 ～ 一 ～ ～ 一

模

P CR

i n ；变 性 9 5 ℃

m

l o d d i n g b u ffe

R NA

成功地 进行 了

A L

o

w a s

‘

上下游引

的

3 弘L

z

反 应 的 肉眼可 视 结 果

引 物 中筛 选 得 到 这 套 带 有

液 浓度 为

r

n

“L

25

反应体系在

5

，

，

，

2

e

P CR

m m o

列 的 高度 保 守 的 区 域 进 行 引物 在 线 设 计 从

．

be

n u m

i p it a t i o

r e

ga t iv

n e

如

L AM P

1

．

：

ip a t e in th e

a r tic

0

在 阪崎 肠 杆 菌

2

l

l

u a

v

结果

2 2

．

，

，

7 2 c《 = ，3 0

P CR

环

50 0

，

l ／L d N T P

P CR

。

)

3

．

聚合 酶

Ta q D NA

30

P H8

m m o

．

仪中反 应 的 程 序 是 预 变 性 S ；

，

聚 合 酶 链 反 应 缓 冲 液 ( Mg

，

5 U

P CR

。

T r i s H Cl

l ／L

m o

1

，

l ／L M g C l ， 2 5

m m o

弘m

) 见表

板 和 用 灭 菌双 蒸水 补 足 体 系 45

LA MP

v

The

2

c o n tr o

DNA

反 应 的可 视 结果

LAM P

2 ．

反 应 的两 条

外引物 (F 3 和

，

F ig

。

LAMP

)

图

d

检 测 阪崎 肠 杆 菌

LA MP

，

K Cl

n

lo d din g

反 应 的引 物是 检 测 阪崎 肠 杆 菌 的

r e e

gla

n

n

，

灵 敏度 和 人 工 污 染 检 出 限 进 行 了

F

T r ito

1％

．

，

．

反 应 ：为 了 比 较

P CR

( 2 0 0 9 )4 9 ( 3 )

a

琼脂糖凝胶 电泳 观 察

1 5 ％

，

．

．

，

水浴锅中 水浴

80 ℃

p L

5

，

1 2 5

1 ／A c t a M i c r o b i o l o g i c a S i n i c

，

，

，

a

×

模板和用灭 菌双 蒸

D NA

肚L

10

d

g la

n

，

反应过 程 是首 先 在 64 ℃ 水 浴 锅

混合均匀 进行

t

e

l ／L

m o

．

聚 合 酶 大 片 段 ( Ne w

3

Hu

ia

环引

，

6 ， 1

l ／L M g S O 。

m m o

l ／L M g S 0

m m o

D NA

t

MA

，

4

LA MP

。

m

(pH

梯形 条带 以 证 实是 否 发 生 了 ．

4

)各

终止 反 应 通 过 肉眼 观 察 有 无 白色 焦 磷 酸 镁

。

r

，

2 5

—

的

水补 足 体 系 10

．

外引物 (F3 和

( N H4 )2 S 0

8 u B

，

St

，

．

n x

的反 应 体 系 由 内引 物 ( F IP

肚L

l ／L T r i s H C l

m m o

，

中反 应

a

0

25

：

聚 合 酶 反 应 缓 冲 液 ( Ne w

l ／L

m m o

一

，

．

甜 菜碱 ( S ig m Bs

反应

LAMP

4

．

和

L ia

。

倍 (1

．

0 1

×

而稀释到

就不 能检 测 到 阪崎 肠 杆菌 即灵 敏度 为 10 1 ，

其 琼 脂 糖 凝胶 电泳 图 如 图 常规

P CR

的灵 敏度试 验

，

3 C 一

L A MP

所示

。

C F U ／m L

比 较 LA

MP

。

和

更 加灵 敏 其灵 敏度 ，

舻

胡 连 霞 等 ： 改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴 儿 配 方 奶 粉 中 的 阪 崎 肠 杆 菌

是

的

P CR

2 3

10 0 0

L AM P

．

和

倍

检测人工 污染样品 中的阪崎肠

P CR

杆菌的检 出限 的 比较 人工 污 染 的奶 粉 溶 液 的 阪 崎 肠 杆 菌 的 浓 度 从 1

．

10

10

×

’

C F U ／m L

～

方法处 理 样 品提取

1

10

．

DNA

，

×

10

进行

一

。

C F U ／m L

，

按

和 常规

L A MP

1 2

．

．

测 人 工 污 染 婴 儿 配 方 奶 粉 的阪崎 肠 杆 菌 的 检 出 限试

验如 图 10

(1

0

4

所示

LA MP

。

方法在稀释 到

)时能 出沉 淀 电 泳 有 梯 形 条 带 ，

．

10

×

10

“

其沉 淀图如 图

。

稀释到

。

而 常规

4 A ．

P CR

1

．

10

C F U ／g

×

倍

，

耗时约

1 h

，

稀释到

10

。

10

。

倍 (1 倍 (1

．

10

’

，

4 c ．

10

×

102)

所示

。

，

4 B ．

)时能

X

时就

1 10 0 CF U ／ g

，

其琼脂糖凝胶 电泳 图如 图

10

．

不 能检测 到 阪崎 肠 杆菌 即检 出 限 是 ，

10

所 示 琼脂糖凝胶 电泳 图 如 图

，

3 h

10

．

即检 测 人 工 污 染婴 儿 配 方 奶 粉 中

检测 到 阪 崎 肠 杆 菌 稀 释 到 时

倍(1

，

的阪 崎 肠 杆 菌 的 检 出 限 是

。

10

) 时不 能 检测 到 阪崎 肠 杆 菌 不 出 沉 淀

电泳 无 梯 形 条带

所示

’

，

的检 出 限是

耗

比较

的

倍

10 0 0

同样

，

，

L A MP

。

阪崎肠 杆 菌在极 其少 量 的情况 下 都有 致病 性

n

“

即使是 婴 儿配 方 奶 粉 中大 肠 茵群 污 染 水 平 符

，

合相 应 的微 生 物 学 标 准 也 可 能 存 在 阪 崎 肠 杆 菌 的 ，

污染

… ”。

因此 检测 阪崎 肠 杆 菌 的 方 法 是 否 灵 敏 快

。

、

速 至 关重 要

近 年 来 阪崎 肠 杆 菌 的生 化 及分 子 检

。

，

测方法取得重 要 进展 基 于 保守 序列 如

16 S

，

23S

r

R NA 以 及 16 S 2 3 S

子 检测技术 相继 建立

最近研究表明

。

序列 采 用带有

、

¨。

“

J

本研

。

间 区 序列 作为靶

R NA

r

一

条环 引物 的

2

，

16 S 2 3 S

R NA

法检测

L A MP

各 种食 源 性 致 病 菌 方 面 具 有 良好 潜 力

究 以 阪崎 肠 杆 菌 的

r

问 区 序 列 ( ITS ) 等 的 分

R NA

r

．

方法 检测婴儿

LA MP

，

配方奶粉 中的阪崎 肠 杆 菌 表现 出较 高 的灵 敏度 A L

法检测 阪崎肠 杆 菌的研 究至 今未见 报道 本 ，

种更 为稳 定 快 捷 的分子 检 测 样 品 中

一

、

阪崎 肠 杆 菌 的新 技 术 方法是

LA MP

。

种新 型 的恒 温核 酸扩增技术

一

它依赖于能够识 别靶

引物和

种具 有链 置 换 活 性 的

一

。

上 6 个特定 区 域 的 4 条

D NA

聚合 酶 在 恒 温

D NA

，

500

条 件 下 扩 增 核 酸 保 证 了 扩 增 的高 特 异 性 和 高效 率

500

由于

10 0

重 复 靶 序 列 的茎 环 状

，

，

和 花 椰 菜状

D NA

，

，

结 合 产 生 肉眼可 见 的扩增 反 应 副产 物 白色焦 一

，

磷 酸镁 沉 淀 18 9 b D

另外 核 酸大量生成 时 从

。

中析 出的焦磷 酸根 离子 与 反 应体 系 中的

dNTP s 。’

速检测

结果 鉴 定 简单 非 常适 合 高通 量 的快

。

，

。

从 研 究 结果 中我 们 可 以 看 到 改 良的 法 检 测 灵 敏度 是 常规 的 ，

A L

的

P CR

技术可 检测 到

MP

倍 许 多研 究 表

10 0 0

，

个拷 贝数甚 至 更低的靶

10

标 在检测灵 敏度上 具 有更大 的优势

’一 。。

“

而且

。

，

方法操作简单 反应快速 不需要 昂贵的仪器

MP

A L

方

MP

A L

，

明

反

L A MP

，

应典型 的 阶梯 状 条 带

所组成

DNA

的混 合 物 在琼 脂 糖 凝 胶 电泳 上 会 呈 现 出

Mg

。

独 特 的 核 酸 扩增 机 制 它 的 产 物 是 由多

L A MP

．

+

。

，

MP

研究探索 了

bD

38 1

反 应 的检 出 限 试 验

PCR

P CR

)

讨论

3

2

检

P CR

／微 生 物 学 报 ( 2 0 0 9 ) 4 9 ( 3

和常规

LAMP

。

．

，

，

设 备 繁琐 的 电泳 过 程 尤其 适 合 在 基 层 医 疗 单位 和 、

，

食 品 检 测 部 门推 广 和 应 用

。

参考文献 [

1

]

I

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[

2

]

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Kca

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200 2 2 87

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200 I

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．

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Ha

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1

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( 1 7 ) ：2 2 0 4

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c

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2206 ba

．

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n

t

３８２　

Ｌｉ ａｎｘｉ ａ 　Ｈｕ　ｅ ｔ 　ａ １． ／ Ａｃ ｔ ａ　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏｂ ｉ ｏｌ ｏ ｇｉ ｃ ａ　 Ｓｉ ｎｉ ｃ ａ（ ２００９）４９（３） 　

ｆ ｏｒ ｍｕｌ ａ， Ｇｅｎｅｖａ， Ｏｎｌ ｉｎｅ　ｒｅｐｏｒｔ： ｈｔｔ ｐ：／／ｗｗｗ ．ｗｈｏ．ｉ ｎｔ ／ 　

［１ ０］ Ｎａｇ ａｍｉ ｎｅ 　Ｋ，Ｔ　Ｈａｓ ｅ，Ｔ　Ｎｏｔ ｏｍｉ．Ａｃ ｃｅ ｌ ｅ ｒ ａｔ ｅ ｄ　ｒ ｅａ ｃｔ ｉ ｏｎ 　ｂｙ　 ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔ ｅｄ　ｉ ｓｏｔ ｈｅｒ ｍ ａｌ 　ａｍｐｌ ｉｆ ｉｃａｔ ｉｏｎ　ｕｓｉ ｎｇ　ｌ ｏｏｐ　ｐｒｉ ｍｅｒ ｓ． 　

ｏｏｄｓａｆ ｆ ｅｔ ｙ／ｍｉ ｃｒ ｏ／ｍｅｅｔ ｉ ｎｇｓ／ｆ ｅｂ２００４／ｅｎ／．２００４． 　

Ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕｌ ａｒ 　 ａｎ ｄ 　Ｃｅ ｌ ｌ ｕｌ ａｒ 　 Ｐｒ ｏｂ ｅ ｓ，２００２，１６（３）： ２２３—２ ２９． 　

ｎｔ 　ＦＡＯ／ Ｗ ＨＯ　Ｗｏｒ ｋｓ ｈｏｐ． Ｅｎｔ ｅ ｒ ｏｂａ ｃｔ ｅｒ 　ｓ ａｋａ ｚ ａｋｉ ｉ 　ａ ｎｄ　 ［３］ 　 Ｊｏｉ Ｓａｌ ｍｏｎｅｌ ｌ ａ　ｉ ｎ　ｐｏｗｄｅｒｅｄ　ｉ ｎｆ ａｎｔ 　ｆｏｒｍｕｌ ａ． Ｒｏｍｅ，Ｉ ｔ ａｌ ｙ： ＦＡＯ． 　

［ｎ ］ Ｉ ｖ ｅｒ ｓ ｅｎ　Ｃ， Ｓ ｔ ｅ ｐｈｅｎ　Ｆ． Ｒｉ ｓ ｋ　ｐｒ ｏｆ ｉｌ ｅ　ｏ ｆ 　Ｅｎｔ ｅｒ ｏｈａｃ ｔ ｅｒ 　 ｓａｋａｚａｋｉ ｉ，ａｎ　ｅｍｅｒ ｇｅｎｔ 　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ａｓｓｏｃｉ ａｔ ｅｄ　ｗｉ ｔ ｈ　ｉ ｆａｎｔ ｎ 　ｍｉ ｌ ｋ　

２【 ｘ】 ６． 　

ｆ ｏｒｍｕＬａ． Ｔｒｅａｄｓ 　

ｍｅｒ　Ａ０　ａｎｄ　Ｋｅｉ ｔ ｈ　ＡＬ． Ｅｘｔ ｒａｃｔ ｉ ｏｎ ．Ｆｒｅｅ， ｆ ｉｌ ｔ ｅｒ－ｂａｓｅｄ　 ［４］ 　Ｐａｌ

（１ ４）： ４４３—４５４． 　

ｔ ｅｍｐｌ ａｔ ｅ　ｐｒ ｅｐａｒａｔ ｉ ｏｎ　ｆ ｏｒ 　ｒａｐｉ ｄ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉ ｔｉ ｖｅ　ＰＣＲ　 ｄｅｔ ｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　

ｐａ ｔ ｈｏｇｅ ｎｉ ｃ　 ｐａｒ ａｓ ｉ ｔ ｉ ｃ 　 ｐｒ ｏｔ ｏｚ ｏａ． 　 Ｊ ｏｕｒ ｎａｌ 　ｏ ｆ　 Ｃｌ ｉ ｎｉ ｃａｌ 　

［１ ２］ ＦＡＯ／ ＷＨＯ． Ｄｒ ａ ｆ ｔ 　ｒ ｉｓ ｋ　 ａｓ ｓ ｅｓ ｓ ｅ ｍｅｎｔ 　ｆ ｏｒ 　 Ｅｎｔ ｅｒ ｏ ｂａｃ ｔ ｅ ｒ 　 ｓａｋａｚａｋｉ ｉ． ｈｔ ｔｐ：／／ｗｗｗ ． ｗｈｏ． ｉ ｎｔ ／ｆ ｏｏｄｓａｆ ｅｔ ｙ／ｐｕｂｌｉ ｃａｔ ｉ ｏｎｓ／ 　

Ｍｉ ｃ ｒ ｏｂ ｉ ｏｌ ｏ ｇｙ， ２０００， ３８ （ ６）：２２７１—２２７７． 　 ｏｍｉ 　Ｔ， ［５］ 　 Ｎｏｔ

凡） ｏｄ　Ｓｃｉ ｅｎｃｅ　ａｎ ｄ 　ｔ ｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ．２００３，Ｖｏｌ 　

ｍｉ ｃｒｏ／ｍｒａ６．２００４． 　

Ｏｋａｙａｍａ　 Ｈ ， Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ 　 Ｈ ， ｅｔ 　 ａ１． １ｏｏｐ— 　

ｍｅｄｉ ａｔ ｅｄ　ｉ ｓｏｔ ｈｅｒ ｍ ａｌ 　ａｍｐ１ｉ ｉｃａｔ ｆ ｉ ｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ ． Ｎｕｃｌ ｅｉ ｃ　Ａｃｉ ｄｓ　

［１ ３］ Ｋａ ｔ ｏ　Ｈ， Ｙｏｓ ｈｉ ｄａ　Ａ， Ａｎｓ ａｉ 　Ｔ， ｅ ｔ 　ａ １． Ｌｏｏｐ— ｍｅｄ ｉ ａ ｔ ｅｄ　 ｉｓ ｏｔ ｈｅｒ ｍ ａｌ 　ａｍｐｌ ｉ ｉｃａｔ ｆ ｉ ｏｎ　ｍｅｔ ｈｏｄ　ｆ ｏｒ 　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔ ｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ 　

Ｒｅ ｓ ｅ ａｒ ｃ ｈ，２０００，２８（１ ２）：Ｅ６３一 ｅ ６３． 　

Ｅｎｔ ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　 ｆ ａｅｃａｌ ｉ ｓ　 ｉｎ　 ｉ ｎｆ ｅｃｔ ｅｄ　 ｒｏｏｔ 　 ｃａｎａｌｓ． 　 Ｏｒａｌ 　

ｃａｌ 　Ｃｏ． Ｌｔ ｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｉ ｎｃｉ ｐＩｅｓ　０ｆ　ＬＡＭＰ　ｍｅｔ ｌ １ｏｄ． 　 ［６］ 　Ｅｌｋｅｎ　Ｃｈｅｍｉ

Ｍｉ ｃｒ ｏｂ ｉ ｏｌ ｏｇｙ 　ａｎｄ　 Ｉ ｍｍｕｎ ｏｌ ｏ ｇｙ， ２００７， ２２（ ２）：１ ３１—１ ３５． 　

ｈｔ ｔ ｐ：／／ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉ ｋｅｎ．ｃｏ．ｉ ｐ／ｅ／ｔ ｅｃｈ／ｉ ｎｄｅｘ．ｈｔ ｍ１． ２００３． 　 Ｗ ａｔ ａｎａｂｅ　Ｋ ， Ｏｈｔｓｕｋａ　Ｋ ， ｅｔ 　ａ１． Ｌｏｏｐ－ 　

［１ ４］ Ｙｕｋｉ ｋｏ 　ＨＫ，Ｎｅｍｏ ｔ ｏ 　Ｊ，Ｏｈｔ ｓ ｕｋａ 　Ｋ，ｅ ｔ 　ａ１．Ｓｅｎｓ ｉ ｔ ｉ ｖｅ 　ａｎｄ　

ｍｅｄｉ ａｔ ｅｄ　 ｉ ｓｏｔ ｈｅｒ ｍａｌ 　 ａｍｐｌ ｉ ｉｃａｔ ｆ ｉ ｏｎ　 ｒｅａｃｔ ｉ ｏｎ　 ｕｓｉ ｎｇ　 ａ　

ｒ ａｐｉ ｄ　ｄｅｔ ｅｃ ｔ ｉ ｏ ｎ　ｏｆ 　Ｖｅｒ ｏ 　ｔ ｏｘ ｉ ｎ－ ｐｒ ｏ ｄｕｃｉ ｎｇ 　Ｅｓ ｃｈｅ ｒ ｉ ｃ ｈｉ ａ 　ｃ ｏｉ ｌ 　

ｎｅ　Ｋ， ［７］ 　Ｎａｇａｍｉ

ｕｓ ｉ ｎｇ 　ｌ ｏ ｏｐ— ｍｅｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ　ｉ ｓ ｏｔ ｈｅｒ ｍ ａｌ 　ａｍｐｌ ｉ ｆ ｉ ｃａ ｔ ｉ ｏ ｎ． Ｊｏ ｕｒ ｎａｌ 　ｏ ｆ　

ｎｏ ｎｄｅｎａｔ ｕｒ ｅｄ　 ｔ ｅ ｍｐｌ ａｔ ｅ．Ｃｌ ｉ ｎｉ ｃ ａｌ 　Ｃｈｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ，２００１， ４７（ ９）： 　

Ｍ ｅｄｉ ｃａｌ 　Ｍ ｉ ｃｒｏｂｉ ｏｌ ｏｇｙ，２００７，５６： ３９８—４０６． 　

１７４２ — １７４３． 　

　Ｍｏｒ ｉ，％ｕｙｏｓｈｉ 　Ｈｉ ｒａｎｏ，Ｔｓｕｇｕｎｏｒ ｉ　Ｎｏｔ ｏｒ ｎｉ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　 ［８］ 　Ｙａｓｕｙｏｓｈｉ

［１５］ Ｍｏｒ ｉ 　Ｙ，Ｍ　Ｋｉ ｔ ａ ｏ，Ｎ　Ｔｏｍｉ ｔ ａ，ｅｔ 　ａ １．Ｒｅ ａｌ — ｔ ｉ ｍｅ　 ｔ ｕｒ ｂｉ ｄｉ ｍｅｔ ｒ ｙ 　

ｓＤｅｃｉ ｆ ｉ ｃ　ｖｉｓ ｕａｌ 　ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ　ｏｆ　ＬＡＭＰ　ｒｅａｃｔ ｉ ｏｎｓ 　ｂｙ　ａｄｄｉ ｔ ｉ ｏｎ　ｏｆ　

ｏ ｆ 　 ＬＡＭＰ　 ｒ ｅａ ｃｔ ｉ ｏｎ　 ｏｒ ｆ 　 ｑｕａｎ ｔ ｉ ｆ ｙｉ ｎｇ 　ｔ ｅ ｍｐｌ ａ ｔ ｅ　 ＤＮＡ．Ｊ ｏｕｒ ａｌ ｎ 　ｏ ｆ　

ｃａｔ ｉ ｏｎｉ ｃ　ｐｏｌ ｙｍｅｒ ｓ．ＢＭ Ｃ　Ｂｉ ｏｔ ｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ， ２Ｏ０６， ６：３． 　

Ｂｉ ｏｃ ｈｅ ｍｉ ｃ ａ２ 　 ａｎｄ　Ｂｉ ｏ ｐｈｙｓ ｉ ｃ ａｌ 　Ｍｅ ｔ ｈ ｏｄｓ，２００４，５ ９（２）：１ ４５—　

ｌ　Ｙ ， Ｎａｇａｍｉ ｎｅ　Ｋ ， Ｔｏｍｉ ｔ ａ， ｅｔ 　ａ１． Ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ　ｏｆ　ｌ ｏｏｐ－ 　 ［９］ 　 Ｍｏｉ ｍｅｄｉａｔｅｄ　 ｉ ｓｏｔ ｈｅｒｍａｌ 　 ａｍｐｌ ｉ ｉｃａｔ ｆ ｉｏｎ　 ｒ ｅａｃｔｉ ｏｎ　 ｂｙ　 ｔ ｕｒｂｉ ｄｉ ｔ ｙ　 ｄｅｒ ｉｖｅｄ　

ｆ ｒｏｍ　

ｍａｇｎｅｓｉ ｕｍ　

ｐｙｒ ｏｐｈｏｓ ｐｈａｔｅ　

１５７． 　

［１６］ Ｓｕｚ ｕｋｉ 　Ｒ，ＴＹｏｓ ｈｉ ｋａｗａ，Ｍ　 Ｉ ｈｉ ｒ ａ，ｅ ｔ 　 ａ１．Ｄｅｖｅ ｌ ｏｐｍｅｎ ｔ 　 ｏｆｔ ｈｅ 　

ｆ ｏｒｍａｔ ｉｏｎ． 　

ｌ ｏｏｐ－ｍｅｄｉ ａｔｅｄ　 ｉ ｓｏｔ ｈｅｒ ｍ ａｌ　 ａｍｐｆ ｉｆ ｉｃａｔ ｉ ｏｎ　 ｍｅｔ ｈｏｄ　ｆｏｒ　ｒａｐｉ ｄ　

Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ 　 ａｎｄ　 Ｂｉ ｏｐｈｙｓｉ ｃａｌ 　 Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ　 Ｃｏｍｍｕｎｉ ｃａｔ ｏｎｓ， ｉ 　

ｄｅｔ ｅｃ ｔ ｉ ｏ ｎ　ｏｆ 　ｅ ｙｔ ｏｍｅ ｇａ ｌ ｏ ｖｉ ｍｓ 　ＤＮＡ． Ｊ ｏｕｒ ｎ ａｌ 　ｏ ｆ　Ｖｉ ｒ ｏｌ ｏ ｇｉ ｃ ａｌ 　

２００ｌ， ２８９（１）： １ ５０—１５ ４． 　

Ｍ ｅｔ ｈｏｄｓ，２００６．１３２：２１６ —２２１． 　

Ｄｅｖｅｌ ｏｐｍ ｅｎｔ 　ｏｆ　 ａ　 ｌ ｏｏｐ— ｍ ｅｄｉ ａｔ ｅｄ　ｉ ｓ ｏｔ ｈｅｒｍ ａｌ 　 ａｍ ｐｌ ｉ ｉｃａｔ ｆ ｉ ｏｎ　 ａｓｓａｙ　 ｆｏｒ　ｒａｐｉ ｄ　ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ　 ｏｆ　 Ｅｎｔ ｅｒｏｂａｃｔ ｅｒ　ｓａｋａｚａｋｉ ｉ 　ｉ ｎ　ｐｏｗｄｅｒｅｄ　ｉ ｎｆａｎｔ 　ｆｏｒｍｕｌ ａ　 ． 　 Ｌｉ ａｎｘｉ ａ　Ｈｕ，Ｗ ｅｉ 　Ｚｈａｎｇ　 ，Ｘｉ ａｎｚ ｈｏｕ　Ｚｈａｎｇ，Ｙａｏｗｕ　Ｙｕａｎ，Ｙｕｎｚｈｅ　Ｚｈａｎｇ，Ｈｕｉ ｙａｎ　 Ｚｈａｎｇ，Ｘｉ ａｏｙａｎ　Ｍａ，Ｘｕｄｏｎｇ　Ｓｕ　

（ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ 　 ｏ ｆ 　 Ｆｏ ｏ ｄ 　 Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ 　 ａ ｎｄ 　 Ｔｅ ｃ ｈｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ，Ａｇ ｉｃ ｒ ｕ ｌ ｔ ｕｒ ａ ｌ 　 Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ 　 ｏ ｆ 　 Ｈｅ ｂ ｅ ｉ ，Ｂａ ｏ ｄ ｉ ｎ ｇ 　 ０７１ ０ ０１，Ｃｈｉ ｎａ ） 　

Ａｂｓ ｔ ｒ ａｃ ｔ ： ［ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｉｖ ｆ ｅ］Ａ　 ｌ ｏ ｏ ｐ 　 ｍｅ ｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍａ ｌ 　 ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ（ＬＡＭＰ）ｔ ｅ ｃ ｈｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ 　 ｗｉ ｔ ｈ 　 ｔ ｗｏ 　 ｌ ｏ ｏ ｐ 　 ｐｒ ｉｍｅｒ ｓ 　ｗａ ｓ 　ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｅ ｄ 　 ｆ ｏ ｒ 　 ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｌ ｙ 　 ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ 　Ｅｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ 　 ｓ ａ ｋ ａ ｚ ａ ｋｉ ｉ 　ｉ ｎ 　 ｐｏ ｗｄｅ ｒ ｅ ｄ 　 ｉ ｎ ｆ ａ ｎ ｔ 　ｆ ｏｒ ｍｕ ｌ ａ．１ 　 Ｍｅ ｔ ｈｏｄ ｓ 　 Ｊ 　Ｓｅ ｑ ｕｅ ｎ ｃ ｅ ｓ 　ｏ ｆ 　１ ６Ｓ一 ２ ３Ｓ 　ｒ ＲＮＡ　 ｏ ｆ 　Ｅｎｔ ｅ ｒ ｏｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ 　

ｓ ａ ｋ ａｚ ａ ｋｉ ｉ（ ＡＴＣＣ２９ ５ ４４）ｗｅ ｒ ｅ 　 ｕｓ ｅ ｄ 　 ａ ｓ 　 ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ 　 ｓ ｅ ｑ ｕｅ ｎ ｃｅ ｓ ，ｔ ｏ 　 ｄｅ ｓ ｉ ｇ ｎ 　 ｏ ｕｔ ｅｒ 　 ｐ ｉｍｅ ｒ ｒ ｓ，ｉ ｎ ｎｅ ｒ 　 ｐ ｉｍｅ ｒ ｒ ｓ 　 ａ ｎ ｄ 　 ｌ ｏ ｏ ｐ 　 ｐ ｉｍｅ ｒ ｒ ｓ．Ｗｅ 　 ｊ ｕ ｄｇ ｅ ｄ 　 ｔ ｈｅ 　 ｒ ｅ ｓ ｕｌ ｔ ｓ 　 ｏ ｆ 　 ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ，ｔ ｈ ｒ ｏ ｕｇ ｈ 　 ｖｉ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ 　 ｔ ｏ 　 ｔ ｈｅ 　 ｎａ ｋ ｅ ｄ 　 ｅ ｙ ｅ 　 ｏ ｆ 　 ｔ ｈｅ 　 ｗｈ ｉ ｔ ｅ 　 ｐｒ ｅ ｃ ｉ ｐｉ ｔ ａ ｔ ｅ．１ 　 Ｒｅ ｓ ｕｌ ｔ ｓ 　 Ｊ 　Ｔｈｅ 　 ｓ ｅ ｎｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ 　 ｏ ｆ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ＬＡＭＰ　 ａ ｓ ｓ ａ ｙ 　 ｗａｓ 　 ０．１０１ 　ＣＦＵ／ｍＬ：ｔ ｈｅ　ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ　ｌ ｉ ｍｉ ｔ 　ｏｆ 　ａｒ ｔ ｉ ｉｃｉ ｆ ａｌ 　ｃｏｎｔ ａｍｉ ｎａｔ ｉ ｏｎ　ｗａｓ 　１．１ 　ＣＦＵ／ｇ． Ｔｈｅ　ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ　ｃｏｕｌ ｄ　ｂｅ　ｆ ｉｎｉ ｓｈｅｄ　ａｂｏｕｔ 　ａｎ　ｈｏｕｒ 　 ｆ ｒ ｏｍ　ｄｅａｌ ｉ ｎｇ　ｗｉ ｔ ｈ　ｔ ｈｅ　ｓ ａｍｐｌ ｅ　 ｔ ｏ　 ｒ ｅｐｏｒ ｔ　 ｔ ｈｅ　 ｒ ｅｓｕｌ ｔ ｓ 　ｗｉ ｔ ｈ　ＤＮＡ　ｋｉ ｔ．Ｃｏｍｐａｒ ｅｄ　 ｗｉ ｔ ｈ　 ＬＡＭＰ，ｔ ｈｅ 　ｓ ｅｎｓ ｉ ｔ ｉ ｖｉ ｔ ｙ　ｏ ｆ 　 ｔ ｈｅ　 ＰＣＲ　 ａｓ ｓ ａｙ　 ｗａｓ 　 １０１ 　

ＣＦＵ／ｍＬ　 ａｎｄ　ｔ ｈｅ 　ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ　ｌ ｉ ｍｉ ｔ 　ｏｆ 　ａｒ ｔ ｉ ｉｃｉ ｆ ａｌ 　ｃｏｎｔ ａｍｉ ｎａｔ ｉ ｏｎ 　ｗａｓ 　ｌ 　 １００　ＣＦＵ／ｇ　ｉ ｎ　ｔ ｈｒ ｅｅ 　ｈｏｕｒ ｓ ． Ｔｏ 　ａｐｐｌ ｙ 　ｔ ｈｅ 　ｓ ａｍｅ 　ｍｅ ｔ ｈｏｄ　ｏｆ 　

ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ 　 ＤＮＡ，ｆ ｒ ｏ ｍ　 ｄｅ ｌｉ ａ ｎ ｇ 　 ｗｉ ｔ ｈ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ｓ ａ ｍｐｌ ｅ 　 ｔ ｏ 　ｒ ｅ ｐ ｏ ｔ　ｔ ｒ ｈｅ 　ｒ ｅ ｓ ｕｈｓ，ｉ ｔ 　 ｔ ｏ ｏ ｋ 　 ａ ｂｏ ｕ ｔ 　ｔ ｈｒ ｅ ｅ 　ｈ ｏ ｕｒ ｓ．１ 　 Ｃｏ ｎｃ ｌ ｕｓ ｉ ｏｎ　 Ｊ 　Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ，ｔ ｈ ｉ ｓ 　 ＬＡＭｐ－ ｂａｓ ｅｄ　ａｓ ｓａｙ　 ｉ ｓ 　ｓ ｅｎｓ ｉ ｔ ｉ ｖｅ 　ａｎｄ　 ｆ ａｓ ｔ．Ｔｈｅｓｅ 　ｒ ｅｓ ｕｌ ｔ ｓ　 ｉ ｎｄｉ ｃａｔ ｅ　ｔ ｈａｔ 　 ＬＡＭＰ　 ｃａｎ　 ｐｒ ｏｖｉ ｄｅ　 ａ　 ｒ ａｐｉ ｄ　ｙｅｔ 　 ｓｉ ｍｐｌ ｅ 　ｔ ｅｓ ｔ 　 ｏｒ　 ｆ ｔ ｈｅ　ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ　ｏ ｆ　

Ｅｎｔ ｅｒ ｏｂａｃｔ ｅｒ 　 ｓ ａｋａｚａｋｉ 　ｉ ｎ　ｐｏｗｄｅｒｅｄ　ｉ ｆ ａｎｔ ｎ 　 ｆ ｏｒ ｍ ｕｌ ａ． 　 Ｋｅｙｗｏｒｄｓ． ．１ ｏｏｐ—ｍｅｄｉ ａｔ ｅｄ　ｉ ｓ ｏｔ ｈｅｒ ｍ ａｌ 　ａｍｐｌ ｉ ｉｃａｔ ｆ ｉ ｏｎ；Ｉ Ａ ＭＰ；ｄｅｔ ｅｃｔ ｉ ｏｎ；Ｅｎｔ ｅ ｒ ｏｂａｃ ｔ ｅ ｒ 　 ｓａｋａｚａｋｉ ｉ；ｐｏｗｄｅｒ ｅｄ　ｉ ｆ ａｎｔ ｎ 　 ｏｒ ｆ ｍ ｕｌ ａ　

（本 文责编 ：张晓丽） 　

Ｓｕ ｐｐ ｏ ｒ ｔ ｅ ｄ 　 ｂｙ 　 ｔ ｈｅ 　 Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ 　Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎｃ ｅ 　 ｆ ｏ ｕ ｎｄａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 Ｈｅ ｂｅ ｉ 　Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎｃ ｅ（ Ｃ２０ ０８ ００ ０２１ ６） 　 Ｃｏｒｒ ｅｓｐｏｎｄｉ ｎｇ　ａｕｔ ｈｏｒ．Ｔｅｌ： ＋８６－ ３１２－ ７５２８１８６；Ｅ－ｍａ ｌｌ：ｚｈａｎｇｗｅｉ ６３１１２６＠ ｙａｈｏｏ．ｅｏｍ．ｅｎ　 Ｒｅｃｅｉ ｖｅｄ：ｌｌ 　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　 ２００８／Ｒｅｖｉ ｓｅｄ：８　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　 ２００８