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微 生 物 学 报 Act a Mi c r obi ol ogi c a Si ni c a 49( 3): 378—382;4 Ma r ch 2 009 I SSN 0001—6209:CN 1l一19 95/ Q ht t p: / / j our n al s. i m. a c. cn/ ac t a mi cr o cn
改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴儿 配 方 奶 粉 中 的 阪 崎 肠 杆 菌 胡连 霞 ,张伟 , 张先 舟 , 袁耀 武 ,张蕴 哲 , 张会 彦 , 马 晓 燕 ,苏旭 东 ( 河 北 农 业 大 学食 品科 技 学 院 , 保 定 071 001)
摘 要 :【目的】采用改 良环介 导等 温扩增 (LAMP)技术 , 快 速检 测婴 儿 配方 奶粉 中的 阪崎 肠杆 菌 。【方 法 】以阪 崎肠 杆菌 ( ATCC2 954 4)的 16S一 23S r RNA间区序 列作 为 靶 序列 , 设 计 内、外 引物 和 环引 物 , 通过 肉眼观 察 白色
沉淀 , 判断检 测结果 。 【 结果】 LAMP检测 阪崎肠杆 菌 的灵 敏度 为 0. 1 01 CFU/ mL, 人工 污染 阪崎 肠杆 菌 的婴儿 配方 奶粉 的检 出限为 1. 1 CFU/ g。采用试 剂盒提 取 DNA, 从 样 品处 理到 报告 结果 , 耗时 1 h。而对 照 , PCR检 测 阪崎肠杆 菌 的灵 敏度 为 1 01 CFU/ mL, 人工 污染 阪崎肠 杆菌 的婴 儿配 方奶 粉 的检 出 限为 11 00 CFU/ g。采用
同样 方法提 取 DNA, 从样 品处 理到报 告结 果 , 耗时 3 h。【 结 论 】因此 , LAMP检测 婴儿 配方 奶粉 中的 阪崎 肠杆 菌灵 敏度 高 , 耗 时短 , 方 法简便 。 关 键词 :环介导 等温 扩增 ; LAMP; 检测; 阪 崎肠杆 菌 ;婴儿 配方 奶粉 中 图 分 类 号 :Q93— 3
文献标 识码 : A
文章 编号 : 0001— 62 09 ( 2 009)03— 0378. 05
阪 崎肠 杆 菌 (Ent e r o ba c t e r s a ka z aki i )是 人 和 动 物
a mp l i ic f a t i o n, LAMP) 是 Not omi等在 2 000年 开发 的一
肠道 内寄生 的一种 革 兰 氏 阴性 无 芽孢 杆 菌 , 属 肠 杆
种 新 颖 的 恒 温 核 酸 扩 增 方 法 ,其 原 理 是 针 对 目的 基
菌科 。 阪崎 肠杆菌 是 条 件致 病 菌 , 在 一定 条 件 下 对
因的 6个 区域设计 4条 特 异 引物 , 利 用 一 种链 置换
所有 人 群都 有致 病 性 , 尤其 对 出生 28天 内 , 低 体 重
DNA聚合酶 (Bs t DNA po l y me r as e)在等 温 65℃左右 ,
儿 或免疫 力低下 的婴 幼 儿 ,引起 严 重 的新 生 儿 脑 膜
几十分 钟 ,即可实现 核酸 的高效扩 增 ~J 。4条引 物
炎、 菌血症 、 小肠 结肠炎 , 并可 能引起 神经 功能紊 乱 ,
对靶序 列 的 6个特 异序列 区域 的识别 , 保 证 了 LAMP
造成 严重 的后遗 症 , 死亡率高达 2 0% ~50% 以 上 ,
扩增 的 高 度 特 异 性 。 LAMP不 需 要 模 板 的 热 变
只有婴儿 配方奶 粉 中的阪崎肠 杆菌 与疾病 的爆 发相
性。 , 。 长 时间温度 循 环 , 在 等 温条 件 下扩 增 , 不 会 因
联 系 ,已经 引 起 世 界 范 围 内 的广 泛 关 注 I 3 。 目前
温度改 变而造 成时 间的浪 费 。有无 肉眼可见 的焦磷
对 阪崎 肠 杆 菌 的检测 方 法 主 要有 FDA推 荐 的 传 统
酸镁 的白色 沉 淀
检测 方法 , 免疫学 方法 和各 种 PCR方 法 。传统 检 测
简单 的方法 。LAMP将成 为可 以替代 PCR的核酸扩
方法 操作繁 琐 , 检 测 时 间长 , 而 且灵 敏度 较 低 ; 免 疫
增 的新 技术 。增加 环 引物 的环介 导 等 温 扩增 方法 ,
学 方法 的特异性 和灵敏 度也不 理想 ; PCR方 法敏感 、
使反应 速度 可提高 1 / 2~1 / 3_ l 。
快 速H , 但 由于需要 昂贵 的仪 器设 备 、 繁 琐 的电泳 过 程 以及对 检测人 员较 高 的 技术 要 求 ,而 使其 难 以在 基 层普及 和推 广 。
环 介 导 等 温 扩 增 (Loo p— medi a t e d i s o t he r ma l
, 成 为 判 断核 酸 是 否 扩 增 的最
1 材 料和 方 法 1. 1 材 料
1. 1. 1 主 要仪 器 设备 和 试 剂 :电热 恒 温 水浴 锅 ,高
基金项 目: 河 北 省 自然科 学基 金 ( C20 080 0 021 6)
通 信 作者 。Te l : +8 6— 31 2- 752 81 86;E- mai l :z ha n g we i 631 1 26@y a ho o. c o n. r c n 作者简介: 胡 连 霞 (1 97 2一), 女, 河北省献县 , 硕士 , 从 事 有 害 微 生 物 检 测 及控 制 的研 究 。E. ma i l : h ul i a n xi a1 6 8@t o m. c om 收 稿 日期 : 2 008 . 11 - 1 1: 修 回 日期 : 2 008 . 1 2. 08
胡 连 霞等 :改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴儿 配 方 奶 粉 中的 阪 崎 肠 杆 菌 . / 微 生 物学 报 (20 09) 49( 3)
379
速冷 冻离 心 机 (SI GMA3K30, 德 国西格 马 公 司 ),PCR
工污 染不 同浓 度 的 阪崎 肠杆 菌 ,人 工污 染 的奶 粉溶
扩 增 仪 (Wha t ma n T Gr a di e nt基 因 扩 增 仪 ,德 国
液 中 阪 崎 肠 杆 菌 的 浓 度 为 1. 1 0×1 0 CFU/ mL
Bi omet r a公 司 ),恒 温 培 养 箱 ,凝 胶 成 像 系 统
1. 1 0×1 0~ CFU/ mL。同 时从 每 稀 释度 奶 粉 溶 液 中取
(Ko da kEDAS2 90, 美 国柯 达 公 司 ),电泳 仪 (北 京 市 六
1 mL分别 加入 l mL无水 乙醇 、l mL氨水 和 l mL石
厂 生 产 DXY. 33A 型 ),微 量 移 液 器 (0. 1 ~
油醚 , 混 匀 。混 合 物 以 95 62. 5×g, 离心 1 0 mi n。弃
1 0 00LI BI OHI T芬兰 )等 。 DNA试 剂 盒 (Bi o Ba s i c I nc.
去上 清 液 ,剩 余 的 沉 淀 分 别 用 1 mL 1 0 mmo l / L TE
1 6 0 T0r ba y Ro a d,Mar kh am Ont ar i o L3R 1 G6 Ca nad a),
( pH7. 8)溶解 。再 用 试剂 盒 法 提 取 溶 液 中 阪崎 肠 杆
Bs t DNA聚合 酶 ,Ta q DNA聚合 酶 ,dNTP,1 0×Lo ad i ng
菌基 因组 DNA,直 接 进 行 LAMP和 PCR检 测 ,确定
bu fe r, DNA Mar ke r DL1 00、 DL2000, LAMP引 物等 购 自
检 出限 。
或合 成 于上海 生工 生 物 工程 有 限公 司 ;营养 肉汤 培
1. 2. 3 模 板 DNA的制 备 : 用 DNA试 剂盒 提 取 阪崎
养基 , 营养 琼脂 培养基 等 购 自北京 路桥 公 司。
肠杆 菌 DNA,按 照 制 造 商 的说 明所 提 取 的 DNA, 溶
1. 1. 2 菌 株 :本 实 验 室 保 存 的 阪 崎 肠 杆 菌
解在 1 00 的洗脱 缓 冲液 中 , 储 存在 一2 0℃备 用 。
( ATCC295 44、ATCC51 007、ATCC51 02 4),由南 开 大 学
1. 2. 4 引 物设 计 :为 了检 测 阪崎 肠 杆菌 ,针对 阪崎
生命 学 院提供 。
肠 杆菌 ( ATCC2 9544)Ge nBa nk中 ( 基 因号 AY70209 3)
1. 1. 3 样 品来源 : 婴 儿配方 奶 粉购 自当地超 市 。
1 6S. 23S r RNA间区序列 , 运 用 引物设 计 软件 (ht t ps: / /
1. 2 方 法
pr ime r e xpl o r e r .i p/ l a mp3. 0. 0/ i nde x.ht m1) 在 线 进 行
1. 2. 1 纯菌 培养 : 阪崎 肠杆 菌 接种 于 新鲜 无 菌 的 营
LAMP引 物设 计 。引 物 设 计 的原 则 如 no t omi e t a l L 5 j
养 肉汤培 养基 中 , 37℃培 养 1 2 h。用 生 理 盐 水 进 行
所述 。设 计 的 6条 引物是 : 2条 外 引 物 (F3和 B3), 2
1 0倍 系列稀 释 , 一直 稀释 到 1 0 。采用稀 释 平板 法 ,
条 内引物 (FI P和 BI P),以及 2条 环引 物 ( LF和 LB)。
测定 其 纯 培养 物 活 菌 数 为 1. 01×1 0 CFU/ mL;同时
2个 外 引物 被 描 述 为上 游 外 引 物 (F3)和 下游 外 引
一
物( B3)。2个 内引 物 被 描 述 为上 游 内引 物 (FI P)和
从每 稀释度 菌 液 中取 1 mL直 接 用试 剂 盒法 提 取 阪
下游 内 引物 ( BI P)。此外 , 两个 环 引物被 描 述 为上游
崎肠 杆菌基 因组 DNA, 作 为模 板 , 进 行 LAMP和 PCR
环 引物 (LF)和 下 游 环 引 物 ( LB)。扩 增 基 因组 中 的
试验。
1. 2. 2 人 工污染 婴儿 配方 奶 粉 : 在人 工 污染 阪崎肠 杆菌前 , 婴儿 配 方奶粉 按 FDA推荐 的常 规检 验 法 和 PCR法 检测证 实不 含 阪崎肠 杆菌 。然后将 阪崎 肠 杆 菌人 工 污染 到婴儿 配方 奶 粉 中 : 取 25 g婴 儿 配 方奶 粉溶 于 225 mL灭菌生 理盐 水 中 , 然 后对 奶粉 溶 液人
位 置从 439至 627区域 1 89 bp目的基 因片 断 。引物 的名称 和具 体 序列见 表 1。FI P由 F1的一 个互 补序 列 和 正 向序 列 F2构 成 。BI P由 B1的一个 互 补 序列 和正 向序列 B2构 成 。每 条 引 物在 基 因组 中具 体 的 位 置 如 图 1所 示 。
表 1 LAMP 引 物 Tabl e 1 LAM P pr im er s
Pr i me r an n i e
S e q ue n ce (5 —}3 )
Forward out er(F3)
AAA I CGCGGTGTGTCAG
Ba c k wa rd o ut e r( B3) For w ard i nner pr imer(FI P)
GGTI TCCCCATTCGGACAT
Ba c k wa r d i nn e r p ime r r(BI P)
GGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA
Fo wa r rdl o op pr ime r(LF) Ba c k wa r d l o o p p ime r r( LB)
AGCGCCGGTAAGGTGATA
ACCGTGTACGCTrGTTCGC ITrCTCTCAAACTl CGCAGCAC
AACC rCACAACCCGAAGA
4 01 rI ( AACAG AC 畸 CK) CT OC 兀 TcC G 丑 GAA  ̄
(
・
4 81 G TKTI ∞
F3
- (
GG. 兀 G弼 AOG 1 l AAO。GAAC AA( K ̄ T ACAC GG. I(硒l A[ 03C cr cKi CAGICA G
. . 卜-——一 LF—・———__■- . -_ _—_-——— F1———————- - - 561 AA1CI (阢
GGTG TGTCAGAGTC TC1 UAAACTC GCAGCACGAA
A A
F2 0G^ Ⅱ A0GA。( G(
●.一 --—一 B 1 ———-——
aCCGGT AAOG. I ( Ⅲ GAAO。( 订 Ⅱ AA Ⅺ00GAT G. I C0
G0
al I= GG TC CA ̄
图 1 每 条 引 物在 基 因 组 中 的 位 置 Fi g.1 Each pr imer i n t he genome of t he l ocat i on.Ol i gonucl eoti de pr imer s used f or LAMP assay of Ent erobaet er s akazaki f r om t he GenBank dat abase
(a c c es s i o n N o. AY70 209 3)wi t hi n t he 1 6S一 23S r RNA g e ne. Ge no me a mp l i ic f a t i o n f r o m t he po s i t i o n of 439 - 6 27 r e g i on 18 9 bp ge n e ra f g me nt s.FI P c on s i s t s o f a compl ement ar y s equence of F1 and a s ense sequence of F2.BIP consi st s of a compl em ent ar y sequence of B1 and a sense sequence of B2.
3 80
1 2 .
)各
B IP
物 (LF 和
1 6 弘m
t
D NA
MA
) (2 0
10
)各
LB
)
X 10 0
B io l a b s
in
m
沉淀 bu ffe
B3
8
肚m
l /L d N T P
Lo
u
is
,
m m o
.
Mo
)
.
,
B
ly
e v e r
20
s
in
,
,
2
)
,
E
)
8 8 .
0
2 肛m
.
10
,
4
然后 将其放人
B io la b s
m m o
l /L K C l
n
此 外 取扩增 产物
0
,
E
,
与
汕 的
1
反应
LA MP
反应
P CR
扩增反应 的
B3
反应 体 系包 括
) (
10 0
25
物各 10
m
,
10
×
的
退火
57 ℃
,
(
—
s
95 ℃
;延
伸
与
1 肛L
产物
5 肛L
匀 进行
1 5 %
琼 脂 糖 凝 胶 电泳
。
,
,
d
p l i fi
u a
u s e
t io n
r e a c
a m
—
is
i s ib l e d to t he
te
r
r e s u
il e
Tu be B
.
c a
s
l
t io n n a
,
ke d
w
e
lts
o
:
p o s i t iv
hi te
f
the
in s t e
w a te r
a
LA MP
lt s
r e s u
e
,
be
pyr o pho s pha te
i n t he po s it iv
ye
r e a c
d o f DNA
e
n
Tu be A
.
te m p la t e o
c a u s e
m a
r e a c
t io
gn
iu
e s
t io n
o
f
f
p
pre
m
a
la r g e
t he
m
ix tu
c
16 S 2 3 S 一
,
的
r
S
l /L
D NA
进行
。
混合均
r
。
~ 一 一 一 一 ~
间 区 序列 即靶 序 ,
反应结果如图
。
MP
反 应
LA MP
反 应 产 生 了 白色 沉 淀 ,
和
L AM P
2
所示
没 有 产 生 白色 沉 淀
LAMP
,
P CR
10 0 0
对 。
检测 婴 儿 配 方 奶 粉 中的 阪崎 肠
杆菌 的 试 验
;
,
而
A
管未 发 生
B
管发生 了 10
检测 阪崎肠 杆 菌 的纯 培 养物 的
带
阪崎 肠 杆 菌 经 培养 采 用 稀 释 平 板 法 测 得 原 菌 ,
10
“
1 0 l .
×
10
。
。
C F U /m L
,
10
倍 系列稀释 进行
方法 在稀释到
LA MP
,
.
01
×
10
- 2
)时未 出现 沉 淀 电泳 也 无 梯形 条 ,
即 检 测 阪崎 肠 杆 菌 灵 敏 度 达
。
应 的沉 淀 图如 图 所示
。
3 A
而 常规
一
0
.
1 0 1 C F U /m L
,
相
所 示 琼脂 糖 凝胶 电泳 图如 图 ,
P CR
稀释到
10
能检 测 到 阪 崎 肠 杆 菌 稀 释 到 ,
10
。
’
倍(1 倍(1
.
.
01
01
× ×
10
10
。
)时
。
)时
,
10
’
)时 出现 沉 淀 电泳 也 有 梯 形 条 带 ,
倍 (1
,
和 常 规 P C R 检 测 阪 崎 肠 杆 菌 的灵 敏 度 试 验 如
所示
”
3 B .
3
w 心 一
。
灵 敏 度 的 比较
图
.
一 一 ~ 一 一 一
,
个循
35
条环 引物 的特 异 引 物
2
A L
MP
f
一 ~ 一 ~ ~ 一
模
P CR
i n ;变 性 9 5 ℃
m
l o d d i n g b u ffe
R NA
成功地 进行 了
A L
o
w a s
‘
上下游引
的
3 弘L
z
反 应 的 肉眼可 视 结 果
引 物 中筛 选 得 到 这 套 带 有
液 浓度 为
r
n
“L
25
反应体系在
5
,
,
,
2
e
P CR
m m o
列 的 高度 保 守 的 区 域 进 行 引物 在 线 设 计 从
.
be
n u m
i p it a t i o
r e
ga t iv
n e
如
L AM P
1
.
:
ip a t e in th e
a r tic
0
在 阪崎 肠 杆 菌
2
l
l
u a
v
结果
2 2
.
,
,
7 2 c《 = ,3 0
P CR
环
50 0
,
l /L d N T P
P CR
。
)
3
.
聚合 酶
Ta q D NA
30
P H8
m m o
.
仪中反 应 的 程 序 是 预 变 性 S ;
,
聚 合 酶 链 反 应 缓 冲 液 ( Mg
,
5 U
P CR
。
T r i s H Cl
l /L
m o
1
,
l /L M g C l , 2 5
m m o
弘m
) 见表
板 和 用 灭 菌双 蒸水 补 足 体 系 45
LA MP
v
The
2
c o n tr o
DNA
反 应 的可 视 结果
LAM P
2 .
反 应 的两 条
外引物 (F 3 和
,
F ig
。
LAMP
)
图
d
检 测 阪崎 肠 杆 菌
LA MP
,
K Cl
n
lo d din g
反 应 的引 物是 检 测 阪崎 肠 杆 菌 的
r e e
gla
n
n
,
灵 敏度 和 人 工 污 染 检 出 限 进 行 了
F
T r ito
1%
.
,
.
反 应 :为 了 比 较
P CR
( 2 0 0 9 )4 9 ( 3 )
a
琼脂糖凝胶 电泳 观 察
1 5 %
,
.
.
,
水浴锅中 水浴
80 ℃
p L
5
,
1 2 5
1 /A c t a M i c r o b i o l o g i c a S i n i c
,
,
,
a
×
模板和用灭 菌双 蒸
D NA
肚L
10
d
g la
n
,
反应过 程 是首 先 在 64 ℃ 水 浴 锅
混合均匀 进行
t
e
l /L
m o
.
聚 合 酶 大 片 段 ( Ne w
3
Hu
ia
环引
,
6 , 1
l /L M g S O 。
m m o
l /L M g S 0
m m o
D NA
t
MA
,
4
LA MP
。
m
(pH
梯形 条带 以 证 实是 否 发 生 了 .
4
)各
终止 反 应 通 过 肉眼 观 察 有 无 白色 焦 磷 酸 镁
。
r
,
2 5
—
的
水补 足 体 系 10
.
外引物 (F3 和
( N H4 )2 S 0
8 u B
,
St
,
.
n x
的反 应 体 系 由 内引 物 ( F IP
肚L
l /L T r i s H C l
m m o
,
中反 应
a
0
25
:
聚 合 酶 反 应 缓 冲 液 ( Ne w
l /L
m m o
一
,
.
甜 菜碱 ( S ig m Bs
反应
LAMP
4
.
和
L ia
。
倍 (1
.
0 1
×
而稀释到
就不 能检 测 到 阪崎 肠 杆菌 即灵 敏度 为 10 1 ,
其 琼 脂 糖 凝胶 电泳 图 如 图 常规
P CR
的灵 敏度试 验
,
3 C 一
L A MP
所示
。
C F U /m L
比 较 LA
MP
。
和
更 加灵 敏 其灵 敏度 ,
舻
胡 连 霞 等 : 改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴 儿 配 方 奶 粉 中 的 阪 崎 肠 杆 菌
是
的
P CR
2 3
10 0 0
L AM P
.
和
倍
检测人工 污染样品 中的阪崎肠
P CR
杆菌的检 出限 的 比较 人工 污 染 的奶 粉 溶 液 的 阪 崎 肠 杆 菌 的 浓 度 从 1
.
10
10
×
’
C F U /m L
~
方法处 理 样 品提取
1
10
.
DNA
,
×
10
进行
一
。
C F U /m L
,
按
和 常规
L A MP
1 2
.
.
测 人 工 污 染 婴 儿 配 方 奶 粉 的阪崎 肠 杆 菌 的 检 出 限试
验如 图 10
(1
0
4
所示
LA MP
。
方法在稀释 到
)时能 出沉 淀 电 泳 有 梯 形 条 带 ,
.
10
×
10
“
其沉 淀图如 图
。
稀释到
。
而 常规
4 A .
P CR
1
.
10
C F U /g
×
倍
,
耗时约
1 h
,
稀释到
10
。
10
。
倍 (1 倍 (1
.
10
’
,
4 c .
10
×
102)
所示
。
,
4 B .
)时能
X
时就
1 10 0 CF U / g
,
其琼脂糖凝胶 电泳 图如 图
10
.
不 能检测 到 阪崎 肠 杆菌 即检 出 限 是 ,
10
所 示 琼脂糖凝胶 电泳 图 如 图
,
3 h
10
.
即检 测 人 工 污 染婴 儿 配 方 奶 粉 中
检测 到 阪 崎 肠 杆 菌 稀 释 到 时
倍(1
,
的阪 崎 肠 杆 菌 的 检 出 限 是
。
10
) 时不 能 检测 到 阪崎 肠 杆 菌 不 出 沉 淀
电泳 无 梯 形 条带
所示
’
,
的检 出 限是
耗
比较
的
倍
10 0 0
同样
,
,
L A MP
。
阪崎肠 杆 菌在极 其少 量 的情况 下 都有 致病 性
n
“
即使是 婴 儿配 方 奶 粉 中大 肠 茵群 污 染 水 平 符
,
合相 应 的微 生 物 学 标 准 也 可 能 存 在 阪 崎 肠 杆 菌 的 ,
污染
… ”。
因此 检测 阪崎 肠 杆 菌 的 方 法 是 否 灵 敏 快
。
、
速 至 关重 要
近 年 来 阪崎 肠 杆 菌 的生 化 及分 子 检
。
,
测方法取得重 要 进展 基 于 保守 序列 如
16 S
,
23S
r
R NA 以 及 16 S 2 3 S
子 检测技术 相继 建立
最近研究表明
。
序列 采 用带有
、
¨。
“
J
本研
。
间 区 序列 作为靶
R NA
r
一
条环 引物 的
2
,
16 S 2 3 S
R NA
法检测
L A MP
各 种食 源 性 致 病 菌 方 面 具 有 良好 潜 力
究 以 阪崎 肠 杆 菌 的
r
问 区 序 列 ( ITS ) 等 的 分
R NA
r
.
方法 检测婴儿
LA MP
,
配方奶粉 中的阪崎 肠 杆 菌 表现 出较 高 的灵 敏度 A L
法检测 阪崎肠 杆 菌的研 究至 今未见 报道 本 ,
种更 为稳 定 快 捷 的分子 检 测 样 品 中
一
、
阪崎 肠 杆 菌 的新 技 术 方法是
LA MP
。
种新 型 的恒 温核 酸扩增技术
一
它依赖于能够识 别靶
引物和
种具 有链 置 换 活 性 的
一
。
上 6 个特定 区 域 的 4 条
D NA
聚合 酶 在 恒 温
D NA
,
500
条 件 下 扩 增 核 酸 保 证 了 扩 增 的高 特 异 性 和 高效 率
500
由于
10 0
重 复 靶 序 列 的茎 环 状
,
,
和 花 椰 菜状
D NA
,
,
结 合 产 生 肉眼可 见 的扩增 反 应 副产 物 白色焦 一
,
磷 酸镁 沉 淀 18 9 b D
另外 核 酸大量生成 时 从
。
中析 出的焦磷 酸根 离子 与 反 应体 系 中的
dNTP s 。’
速检测
结果 鉴 定 简单 非 常适 合 高通 量 的快
。
,
。
从 研 究 结果 中我 们 可 以 看 到 改 良的 法 检 测 灵 敏度 是 常规 的 ,
A L
的
P CR
技术可 检测 到
MP
倍 许 多研 究 表
10 0 0
,
个拷 贝数甚 至 更低的靶
10
标 在检测灵 敏度上 具 有更大 的优势
’一 。。
“
而且
。
,
方法操作简单 反应快速 不需要 昂贵的仪器
MP
A L
方
MP
A L
,
明
反
L A MP
,
应典型 的 阶梯 状 条 带
所组成
DNA
的混 合 物 在琼 脂 糖 凝 胶 电泳 上 会 呈 现 出
Mg
。
独 特 的 核 酸 扩增 机 制 它 的 产 物 是 由多
L A MP
.
+
。
,
MP
研究探索 了
bD
38 1
反 应 的检 出 限 试 验
PCR
P CR
)
讨论
3
2
检
P CR
/微 生 物 学 报 ( 2 0 0 9 ) 4 9 ( 3
和常规
LAMP
。
.
,
,
设 备 繁琐 的 电泳 过 程 尤其 适 合 在 基 层 医 疗 单位 和 、
,
食 品 检 测 部 门推 广 和 应 用
。
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Abs t r ac t : [ob j e c iv f e]A l o o p me di a t e d i s o t h e r ma l a mp l i ic f a t i o n(LAMP)t e c hn o l o g y wi t h t wo l o o p pr imer s wa s d e v e l o p e d f o r r a p i d l y d e t e c t i n g En t e r o b a c t e r s a k a z a ki i i n po wde r e d i n f a n t f or mu l a.1 Me t hod s J Se q ue n c e s o f 1 6S一 2 3S r RNA o f Ent e r ob a c t e r
s a k az a ki i( ATCC29 5 44)we r e us e d a s t a r g e t s e q ue n ce s ,t o de s i g n o ut er p ime r r s,i n ne r p ime r r s a n d l o o p p ime r r s.We j u dg e d t he r e s ul t s o f de t e c t i o n,t h r o ug h vi s i b l e t o t he na k e d e y e o f t he wh i t e pr e c i pi t a t e.1 Re s ul t s J The s e ns i t i v i t y o f t h e LAMP a s s a y was 0.101 CFU/mL:t he det ect i on l i mi t of ar t i ici f al cont ami nat i on was 1.1 CFU/g. The det ect i on coul d be f ini shed about an hour f r om deal i ng wi t h t he s ampl e t o r epor t t he r esul t s wi t h DNA ki t.Compar ed wi t h LAMP,t he s ens i t i vi t y o f t he PCR as s ay was 101
CFU/mL and t he det ect i on l i mi t of ar t i ici f al cont ami nat i on was l 100 CFU/g i n t hr ee hour s . To appl y t he s ame me t hod of
e x t r a c t i n g DNA,f r o m de li a n g wi t h t h e s a mpl e t o r e p o t t r he r e s uhs,i t t o o k a bo u t t hr e e h o ur s.1 Co nc l us i on J Th e r e f o r e,t h i s LAMp- bas ed as say i s s ens i t i ve and f as t.These r es ul t s i ndi cat e t hat LAMP can pr ovi de a r api d yet si mpl e t es t or f t he det ect i on o f
Ent er obact er s akazaki i n powdered i f ant n f or m ul a. Keywords. .1 oop—medi at ed i s ot her m al ampl i icat f i on;I A MP;det ect i on;Ent e r obac t e r sakazaki i;powder ed i f ant n or f m ul a
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Su pp o r t e d by t he Na t u r a l S c i e nc e f o u nda t i o n o f He be i P r o v i nc e( C20 08 00 021 6) Corr espondi ng aut hor.Tel: +86- 312- 7528186;E-ma ll:zhangwei 631126@ yahoo.eom.en Recei ved:ll November 2008/Revi sed:8 December 2008