改良环介导等温扩增技术快速检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌

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簿  

瑟  

■固圈  

微 生 物 学 报 Act a  Mi c r obi ol ogi c a  Si ni c a  49( 3): 378—382;4 Ma r ch  2 009   I SSN  0001—6209:CN 1l一19 95/ Q  ht t p: / / j our n al s. i m. a c. cn/ ac t a mi cr o cn 

改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴儿 配 方 奶 粉 中 的 阪 崎 肠  杆 菌  胡连 霞 ,张伟  , 张先 舟 , 袁耀 武 ,张蕴 哲 , 张会 彦 , 马 晓 燕 ,苏旭 东  ( 河 北 农 业 大 学食 品科 技 学 院 , 保 定 071 001)  

摘 要 :【目的】采用改 良环介 导等 温扩增 (LAMP)技术 , 快 速检 测婴 儿 配方 奶粉 中的 阪崎 肠杆 菌 。【方 法 】以阪  崎肠 杆菌 ( ATCC2 954 4)的 16S一 23S   r RNA间区序 列作 为 靶 序列 , 设 计 内、外 引物 和 环引 物 , 通过 肉眼观 察 白色 

沉淀 , 判断检 测结果 。 【 结果】 LAMP检测 阪崎肠杆 菌 的灵 敏度 为 0. 1 01  CFU/ mL, 人工 污染 阪崎 肠杆 菌 的婴儿  配方 奶粉 的检 出限为 1. 1  CFU/ g。采用试 剂盒提 取 DNA, 从 样 品处 理到 报告 结果 , 耗时 1  h。而对 照 , PCR检  测 阪崎肠杆 菌 的灵 敏度 为 1 01  CFU/ mL, 人工 污染 阪崎肠 杆菌 的婴 儿配 方奶 粉 的检 出 限为 11 00  CFU/ g。采用 

同样 方法提 取 DNA, 从样 品处 理到报 告结 果 , 耗时 3  h。【 结 论 】因此 , LAMP检测 婴儿 配方 奶粉 中的 阪崎 肠杆  菌灵 敏度 高 , 耗 时短 , 方 法简便 。   关 键词 :环介导 等温 扩增 ; LAMP; 检测; 阪 崎肠杆 菌 ;婴儿 配方 奶粉  中 图 分 类 号 :Q93— 3  

文献标 识码 : A 

文章 编号 : 0001— 62 09 ( 2 009)03— 0378. 05  

阪 崎肠 杆 菌 (Ent e r o ba c t e r   s a ka z aki i )是 人 和 动 物 

a mp l i ic f a t i o n, LAMP) 是 Not omi等在 2 000年 开发 的一 

肠道 内寄生 的一种 革 兰 氏 阴性 无 芽孢 杆 菌 , 属 肠 杆 

种 新 颖 的 恒 温 核 酸 扩 增 方 法 ,其 原 理 是 针 对 目的 基 

菌科 。 阪崎 肠杆菌 是 条 件致 病 菌 , 在 一定 条 件 下 对 

因的 6个 区域设计 4条 特 异 引物 , 利 用 一 种链 置换 

所有 人 群都 有致 病 性 , 尤其 对 出生 28天 内 , 低 体 重 

DNA聚合酶 (Bs t  DNA po l y me r as e)在等 温 65℃左右 ,  

儿 或免疫 力低下 的婴 幼 儿 ,引起 严 重 的新 生 儿 脑 膜 

几十分 钟 ,即可实现 核酸 的高效扩 增 ~J 。4条引 物 

炎、 菌血症 、 小肠 结肠炎 , 并可 能引起 神经 功能紊 乱 ,  

对靶序 列 的 6个特 异序列 区域 的识别 , 保 证 了 LAMP  

造成 严重 的后遗 症 , 死亡率高达 2 0% ~50% 以 上 ,  

扩增 的 高 度 特 异 性 。 LAMP不 需 要 模 板 的 热 变 

只有婴儿 配方奶 粉 中的阪崎肠 杆菌 与疾病 的爆 发相 

性。  , 。 长 时间温度 循 环 , 在 等 温条 件 下扩 增 , 不 会 因 

联 系 ,已经 引 起 世 界 范 围 内 的广 泛 关 注 I 3  。 目前 

温度改 变而造 成时 间的浪 费 。有无 肉眼可见 的焦磷 

对 阪崎 肠 杆 菌 的检测 方 法 主 要有 FDA推 荐 的 传 统 

酸镁 的白色 沉 淀 

检测 方法 , 免疫学 方法 和各 种 PCR方 法 。传统 检 测 

简单 的方法 。LAMP将成 为可 以替代 PCR的核酸扩 

方法 操作繁 琐 , 检 测 时 间长 , 而 且灵 敏度 较 低 ; 免 疫 

增 的新 技术 。增加 环 引物 的环介 导 等 温 扩增 方法 ,  

学 方法 的特异性 和灵敏 度也不 理想 ; PCR方 法敏感 、  

使反应 速度 可提高 1 / 2~1 / 3_ l  。  

快 速H , 但 由于需要 昂贵 的仪 器设 备 、 繁 琐 的电泳 过  程 以及对 检测人 员较 高 的 技术 要 求 ,而 使其 难 以在  基 层普及 和推 广 。  

环 介 导 等 温 扩 增 (Loo p— medi a t e d i s o t he r ma l  

, 成 为 判 断核 酸 是 否 扩 增 的最 

1 材 料和 方 法  1. 1 材 料 

1. 1. 1   主 要仪 器 设备 和 试 剂 :电热 恒 温 水浴 锅 ,高 

基金项 目: 河 北 省 自然科 学基 金 ( C20 080 0 021 6)  

通 信 作者 。Te l : +8 6— 31 2- 752 81 86;E- mai l :z ha n g we i 631 1 26@y a ho o. c o n. r c n   作者简介: 胡 连 霞 (1 97 2一), 女, 河北省献县 , 硕士 , 从 事 有 害 微 生 物 检 测 及控 制 的研 究 。E. ma i l : h ul i a n xi a1 6 8@t o m. c om  收 稿 日期 : 2 008 . 11 - 1 1: 修 回 日期 : 2 008 . 1 2. 08  

胡 连 霞等 :改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴儿 配 方 奶 粉 中的 阪 崎 肠 杆 菌 . / 微 生 物学 报 (20 09) 49( 3)  

379 

速冷 冻离 心 机 (SI GMA3K30, 德 国西格 马 公 司 ),PCR 

工污 染不 同浓 度 的 阪崎 肠杆 菌 ,人 工污 染 的奶 粉溶 

扩 增 仪 (Wha t ma n  T Gr a di e nt基 因 扩 增 仪 ,德 国 

液 中 阪 崎 肠 杆 菌 的 浓 度 为 1. 1 0×1 0 CFU/ mL 

Bi omet r a公 司 ),恒 温 培 养 箱 ,凝 胶 成 像 系 统 

1. 1 0×1 0~ CFU/ mL。同 时从 每 稀 释度 奶 粉 溶 液 中取 

(Ko da kEDAS2 90, 美 国柯 达 公 司 ),电泳 仪 (北 京 市 六 

1  mL分别 加入 l  mL无水 乙醇 、l  mL氨水 和 l  mL石 

厂 生 产 DXY. 33A 型 ),微 量 移 液 器 (0. 1 ~ 

油醚 , 混 匀 。混 合 物 以 95 62. 5×g, 离心 1 0  mi n。弃 

1 0 00LI BI OHI T芬兰 )等 。 DNA试 剂 盒 (Bi o  Ba s i c  I nc.  

去上 清 液 ,剩 余 的 沉 淀 分 别 用 1  mL 1 0 mmo l / L TE 

1 6 0  T0r ba y  Ro a d,Mar kh am Ont ar i o  L3R 1   G6  Ca nad a),  

( pH7. 8)溶解 。再 用 试剂 盒 法 提 取 溶 液 中 阪崎 肠 杆 

Bs t DNA聚合 酶 ,Ta q  DNA聚合 酶 ,dNTP,1 0×Lo ad i ng  

菌基 因组 DNA,直 接 进 行 LAMP和 PCR检 测 ,确定 

bu fe r, DNA  Mar ke r   DL1 00、 DL2000, LAMP引 物等 购 自 

检 出限 。  

或合 成 于上海 生工 生 物 工程 有 限公 司 ;营养 肉汤 培 

1. 2. 3 模 板 DNA的制 备 : 用 DNA试 剂盒 提 取 阪崎 

养基 , 营养 琼脂 培养基 等 购 自北京 路桥 公 司。  

肠杆 菌 DNA,按 照 制 造 商 的说 明所 提 取 的 DNA, 溶 

1. 1. 2  菌 株 :本 实 验 室 保 存 的 阪 崎 肠 杆 菌 

解在 1 00  的洗脱 缓 冲液 中 , 储 存在 一2 0℃备 用 。  

( ATCC295 44、ATCC51 007、ATCC51 02 4),由南 开 大 学 

1. 2. 4 引 物设 计 :为 了检 测 阪崎 肠 杆菌 ,针对 阪崎 

生命 学 院提供 。  

肠 杆菌 ( ATCC2 9544)Ge nBa nk中 ( 基 因号 AY70209 3)  

1. 1. 3 样 品来源 : 婴 儿配方 奶 粉购 自当地超 市 。  

1 6S. 23S  r RNA间区序列 , 运 用 引物设 计 软件 (ht t ps: / /  

1. 2 方 法 

pr ime r e xpl o r e r .i p/ l a mp3. 0. 0/ i nde x.ht m1) 在 线 进 行 

1. 2. 1 纯菌 培养 : 阪崎 肠杆 菌 接种 于 新鲜 无 菌 的 营 

LAMP引 物设 计 。引 物 设 计 的原 则 如 no t omi  e t  a l L 5 j  

养 肉汤培 养基 中 , 37℃培 养 1 2  h。用 生 理 盐 水 进 行 

所述 。设 计 的 6条 引物是 : 2条 外 引 物 (F3和 B3), 2  

1 0倍 系列稀 释 , 一直 稀释 到 1 0 。采用稀 释 平板 法 ,  

条 内引物 (FI P和 BI P),以及 2条 环引 物 ( LF和 LB)。  

测定 其 纯 培养 物 活 菌 数 为 1. 01×1 0  CFU/ mL;同时 

2个 外 引物 被 描 述 为上 游 外 引 物 (F3)和 下游 外 引 



物( B3)。2个 内引 物 被 描 述 为上 游 内引 物 (FI P)和 

从每 稀释度 菌 液 中取 1  mL直 接 用试 剂 盒法 提 取 阪 

下游 内 引物 ( BI P)。此外 , 两个 环 引物被 描 述 为上游 

崎肠 杆菌基 因组 DNA, 作 为模 板 , 进 行 LAMP和 PCR 

环 引物 (LF)和 下 游 环 引 物 ( LB)。扩 增 基 因组 中 的 

试验。  

1. 2. 2 人 工污染 婴儿 配方 奶 粉 : 在人 工 污染 阪崎肠  杆菌前 , 婴儿 配 方奶粉 按 FDA推荐 的常 规检 验 法 和  PCR法 检测证 实不 含 阪崎肠 杆菌 。然后将 阪崎 肠 杆  菌人 工 污染 到婴儿 配方 奶 粉 中 : 取 25  g婴 儿 配 方奶  粉溶 于 225  mL灭菌生 理盐 水 中 , 然 后对 奶粉 溶 液人 

位 置从 439至 627区域 1 89  bp目的基 因片 断 。引物  的名称 和具 体 序列见 表 1。FI P由 F1的一 个互 补序  列 和 正 向序 列 F2构 成 。BI P由 B1的一个 互 补 序列  和正 向序列 B2构 成 。每 条 引 物在 基 因组 中具 体 的  位 置 如 图 1所 示 。  

表 1   LAMP 引 物  Tabl e 1   LAM P  pr im er s 

Pr i me r   an n i e  

S e q ue n ce (5   —}3  )  

Forward out er(F3)  

AAA  I   CGCGGTGTGTCAG 

Ba c k wa rd   o ut e r( B3)   For w ard i nner  pr imer(FI P)  

GGTI TCCCCATTCGGACAT 

Ba c k wa r d   i nn e r   p ime r r(BI P)  

GGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA 

Fo wa r rdl o op   pr ime r(LF)   Ba c k wa r d   l o o p  p ime r r( LB)  

AGCGCCGGTAAGGTGATA 

ACCGTGTACGCTrGTTCGC  ITrCTCTCAAACTl CGCAGCAC 

AACC  rCACAACCCGAAGA 

4 01   rI (  AACAG AC 畸 CK) CT OC 兀  TcC G  丑  GAA  ̄

( 



4 81  G  TKTI ∞

F3 

-   ( 

GG. 兀 G弼 AOG 1  l AAO。GAAC AA( K ̄ T ACAC GG. I(硒l A[ 03C cr cKi CAGICA G 

. . 卜-——一 LF—・———__■- . -_ _—_-——— F1———————- - -   561  AA1CI (阢

GGTG TGTCAGAGTC TC1 UAAACTC GCAGCACGAA 

  A A 

F2  0G^ Ⅱ   A0GA。(  G(  

●.一 --—一 B 1 ———-—— 

aCCGGT AAOG. I (   Ⅲ  GAAO。( 订 Ⅱ  AA  Ⅺ00GAT G. I C0 

G0 

al I= GG TC CA ̄

 

图 1 每 条 引 物在 基 因 组 中 的 位 置  Fi g.1   Each pr imer i n t he genome of  t he l ocat i on.Ol i gonucl eoti de pr imer s  used f or  LAMP assay of Ent erobaet er s akazaki  f r om t he GenBank dat abase 

(a c c es s i o n  N o. AY70 209 3)wi t hi n   t he   1 6S一 23S   r RNA  g e ne. Ge no me   a mp l i ic f a t i o n  f r o m  t he   po s i t i o n  of   439 - 6 27  r e g i on   18 9   bp   ge n e   ra f g me nt s.FI P   c on s i s t s   o f   a  compl ement ar y s equence of  F1  and a s ense sequence of  F2.BIP consi st s of  a compl em ent ar y sequence  of  B1  and a sense sequence of  B2.  

3 80

1 2 .

)各

B IP

物 (LF 和

1 6 弘m

t

D NA

MA

) (2 0

10

)各

LB

)

X 10 0

B io l a b s

in

m

沉淀 bu ffe

B3

8

肚m

l /L d N T P

Lo

u

is



m m o



Mo

)





B

ly

e v e r

20

s

in





2

)



E

)

8 8 .

0

2 肛m



10



4

然后 将其放人

B io la b s

m m o

l /L K C l

n

此 外 取扩增 产物

0



E





汕 的

1

反应

LA MP

反应

P CR

扩增反应 的

B3

反应 体 系包 括

) (

10 0

25

物各 10

m



10

×



退火

57 ℃



(



s

95 ℃

;延





1 肛L

产物

5 肛L

匀 进行

1 5 %

琼 脂 糖 凝 胶 电泳







d

p l i fi

u a

u s e

t io n

r e a c

a m



is

i s ib l e d to t he

te

r

r e s u

il e

Tu be B



c a

s

l

t io n n a



ke d

w

e

lts

o



p o s i t iv

hi te

f

the

in s t e

w a te r

a

LA MP

lt s

r e s u

e



be

pyr o pho s pha te

i n t he po s it iv

ye

r e a c

d o f DNA

e

n

Tu be A



te m p la t e o

c a u s e

m a

r e a c

t io

gn

iu

e s

t io n

o

f

f

p

pre

m

a

la r g e

t he

m

ix tu

c

16 S 2 3 S 一





r

S

l /L

D NA

进行



混合均

r



~ 一 一 一 一 ~

间 区 序列 即靶 序 ,

反应结果如图



MP

反 应

LA MP

反 应 产 生 了 白色 沉 淀 ,



L AM P

2

所示

没 有 产 生 白色 沉 淀

LAMP



P CR

10 0 0

对 。

检测 婴 儿 配 方 奶 粉 中的 阪崎 肠

杆菌 的 试 验







A

管未 发 生

B

管发生 了 10

检测 阪崎肠 杆 菌 的纯 培 养物 的



阪崎 肠 杆 菌 经 培养 采 用 稀 释 平 板 法 测 得 原 菌 ,

10



1 0 l .

×

10





C F U /m L



10

倍 系列稀释 进行

方法 在稀释到

LA MP





01

×

10

- 2

)时未 出现 沉 淀 电泳 也 无 梯形 条 ,

即 检 测 阪崎 肠 杆 菌 灵 敏 度 达



应 的沉 淀 图如 图 所示



3 A

而 常规



0



1 0 1 C F U /m L





所 示 琼脂 糖 凝胶 电泳 图如 图 ,

P CR

稀释到

10

能检 测 到 阪 崎 肠 杆 菌 稀 释 到 ,

10





倍(1 倍(1





01

01

× ×

10

10



)时



)时



10



)时 出现 沉 淀 电泳 也 有 梯 形 条 带 ,

倍 (1



和 常 规 P C R 检 测 阪 崎 肠 杆 菌 的灵 敏 度 试 验 如

所示



3 B .

3

w 心 一



灵 敏 度 的 比较





一 一 ~ 一 一 一



个循

35

条环 引物 的特 异 引 物

2

A L

MP

f

一 ~ 一 ~ ~ 一



P CR

i n ;变 性 9 5 ℃

m

l o d d i n g b u ffe

R NA

成功地 进行 了

A L

o

w a s



上下游引



3 弘L

z

反 应 的 肉眼可 视 结 果

引 物 中筛 选 得 到 这 套 带 有

液 浓度 为

r

n

“L

25

反应体系在

5







2

e

P CR

m m o

列 的 高度 保 守 的 区 域 进 行 引物 在 线 设 计 从



be

n u m

i p it a t i o

r e

ga t iv

n e



L AM P

1





ip a t e in th e

a r tic

0

在 阪崎 肠 杆 菌

2

l

l

u a

v

结果

2 2







7 2 c《 = ,3 0

P CR



50 0



l /L d N T P

P CR



)

3



聚合 酶

Ta q D NA

30

P H8

m m o



仪中反 应 的 程 序 是 预 变 性 S ;



聚 合 酶 链 反 应 缓 冲 液 ( Mg



5 U

P CR



T r i s H Cl

l /L

m o

1



l /L M g C l , 2 5

m m o

弘m

) 见表

板 和 用 灭 菌双 蒸水 补 足 体 系 45

LA MP

v

The

2

c o n tr o

DNA

反 应 的可 视 结果

LAM P

2 .

反 应 的两 条

外引物 (F 3 和



F ig



LAMP

)



d

检 测 阪崎 肠 杆 菌

LA MP



K Cl

n

lo d din g

反 应 的引 物是 检 测 阪崎 肠 杆 菌 的

r e e

gla

n

n



灵 敏度 和 人 工 污 染 检 出 限 进 行 了

F

T r ito

1%







反 应 :为 了 比 较

P CR

( 2 0 0 9 )4 9 ( 3 )

a

琼脂糖凝胶 电泳 观 察

1 5 %









水浴锅中 水浴

80 ℃

p L

5



1 2 5

1 /A c t a M i c r o b i o l o g i c a S i n i c







a

×

模板和用灭 菌双 蒸

D NA

肚L

10

d

g la

n



反应过 程 是首 先 在 64 ℃ 水 浴 锅

混合均匀 进行

t

e

l /L

m o



聚 合 酶 大 片 段 ( Ne w

3

Hu

ia

环引



6 , 1

l /L M g S O 。

m m o

l /L M g S 0

m m o

D NA

t

MA



4

LA MP



m

(pH

梯形 条带 以 证 实是 否 发 生 了 .

4

)各

终止 反 应 通 过 肉眼 观 察 有 无 白色 焦 磷 酸 镁



r



2 5





水补 足 体 系 10



外引物 (F3 和

( N H4 )2 S 0

8 u B



St





n x

的反 应 体 系 由 内引 物 ( F IP

肚L

l /L T r i s H C l

m m o



中反 应

a

0

25



聚 合 酶 反 应 缓 冲 液 ( Ne w

l /L

m m o







甜 菜碱 ( S ig m Bs

反应

LAMP

4





L ia



倍 (1



0 1

×

而稀释到

就不 能检 测 到 阪崎 肠 杆菌 即灵 敏度 为 10 1 ,

其 琼 脂 糖 凝胶 电泳 图 如 图 常规

P CR

的灵 敏度试 验



3 C 一

L A MP

所示



C F U /m L

比 较 LA

MP





更 加灵 敏 其灵 敏度 ,



胡 连 霞 等 : 改 良环 介 导 等 温 扩 增 技 术 快 速 检 测 婴 儿 配 方 奶 粉 中 的 阪 崎 肠 杆 菌





P CR

2 3

10 0 0

L AM P







检测人工 污染样品 中的阪崎肠

P CR

杆菌的检 出限 的 比较 人工 污 染 的奶 粉 溶 液 的 阪 崎 肠 杆 菌 的 浓 度 从 1



10

10

×



C F U /m L



方法处 理 样 品提取

1

10



DNA



×

10

进行





C F U /m L





和 常规

L A MP

1 2





测 人 工 污 染 婴 儿 配 方 奶 粉 的阪崎 肠 杆 菌 的 检 出 限试

验如 图 10

(1

0

4

所示

LA MP



方法在稀释 到

)时能 出沉 淀 电 泳 有 梯 形 条 带 ,



10

×

10



其沉 淀图如 图



稀释到



而 常规

4 A .

P CR

1



10

C F U /g

×





耗时约

1 h



稀释到

10



10



倍 (1 倍 (1



10





4 c .

10

×

102)

所示





4 B .

)时能

X

时就

1 10 0 CF U / g



其琼脂糖凝胶 电泳 图如 图

10



不 能检测 到 阪崎 肠 杆菌 即检 出 限 是 ,

10

所 示 琼脂糖凝胶 电泳 图 如 图



3 h

10



即检 测 人 工 污 染婴 儿 配 方 奶 粉 中

检测 到 阪 崎 肠 杆 菌 稀 释 到 时

倍(1



的阪 崎 肠 杆 菌 的 检 出 限 是



10

) 时不 能 检测 到 阪崎 肠 杆 菌 不 出 沉 淀

电泳 无 梯 形 条带

所示





的检 出 限是



比较





10 0 0

同样





L A MP



阪崎肠 杆 菌在极 其少 量 的情况 下 都有 致病 性

n



即使是 婴 儿配 方 奶 粉 中大 肠 茵群 污 染 水 平 符



合相 应 的微 生 物 学 标 准 也 可 能 存 在 阪 崎 肠 杆 菌 的 ,

污染

… ”。

因此 检测 阪崎 肠 杆 菌 的 方 法 是 否 灵 敏 快





速 至 关重 要

近 年 来 阪崎 肠 杆 菌 的生 化 及分 子 检





测方法取得重 要 进展 基 于 保守 序列 如

16 S



23S

r

R NA 以 及 16 S 2 3 S

子 检测技术 相继 建立

最近研究表明



序列 采 用带有



¨。



J

本研



间 区 序列 作为靶

R NA

r



条环 引物 的

2



16 S 2 3 S

R NA

法检测

L A MP

各 种食 源 性 致 病 菌 方 面 具 有 良好 潜 力

究 以 阪崎 肠 杆 菌 的

r

问 区 序 列 ( ITS ) 等 的 分

R NA

r



方法 检测婴儿

LA MP



配方奶粉 中的阪崎 肠 杆 菌 表现 出较 高 的灵 敏度 A L

法检测 阪崎肠 杆 菌的研 究至 今未见 报道 本 ,

种更 为稳 定 快 捷 的分子 检 测 样 品 中





阪崎 肠 杆 菌 的新 技 术 方法是

LA MP



种新 型 的恒 温核 酸扩增技术



它依赖于能够识 别靶

引物和

种具 有链 置 换 活 性 的





上 6 个特定 区 域 的 4 条

D NA

聚合 酶 在 恒 温

D NA



500

条 件 下 扩 增 核 酸 保 证 了 扩 增 的高 特 异 性 和 高效 率

500

由于

10 0

重 复 靶 序 列 的茎 环 状





和 花 椰 菜状

D NA





结 合 产 生 肉眼可 见 的扩增 反 应 副产 物 白色焦 一



磷 酸镁 沉 淀 18 9 b D

另外 核 酸大量生成 时 从



中析 出的焦磷 酸根 离子 与 反 应体 系 中的

dNTP s 。’

速检测

结果 鉴 定 简单 非 常适 合 高通 量 的快







从 研 究 结果 中我 们 可 以 看 到 改 良的 法 检 测 灵 敏度 是 常规 的 ,

A L



P CR

技术可 检测 到

MP

倍 许 多研 究 表

10 0 0



个拷 贝数甚 至 更低的靶

10

标 在检测灵 敏度上 具 有更大 的优势

’一 。。



而且





方法操作简单 反应快速 不需要 昂贵的仪器

MP

A L



MP

A L







L A MP



应典型 的 阶梯 状 条 带

所组成

DNA

的混 合 物 在琼 脂 糖 凝 胶 电泳 上 会 呈 现 出

Mg



独 特 的 核 酸 扩增 机 制 它 的 产 物 是 由多

L A MP



+





MP

研究探索 了

bD

38 1

反 应 的检 出 限 试 验

PCR

P CR

)

讨论

3

2



P CR

/微 生 物 学 报 ( 2 0 0 9 ) 4 9 ( 3

和常规

LAMP









设 备 繁琐 的 电泳 过 程 尤其 适 合 在 基 层 医 疗 单位 和 、



食 品 检 测 部 门推 广 和 应 用



参考文献 [

1

]

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2

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magnesi um 

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( I n s t i t u t e   o f   Fo o d   S c i e n c e   a nd   Te c hn o l o g y,Ag ic r u l t ur a l   Un i v e r s i t y   o f   He b e i ,Ba o d i n g   071 0 01,Chi na )  

Abs t r ac t : [ob j e c iv f e]A  l o o p   me di a t e d   i s o t h e r ma l   a mp l i ic f a t i o n(LAMP)t e c hn o l o g y   wi t h   t wo   l o o p   pr imer s  wa s  d e v e l o p e d   f o r   r a p i d l y   d e t e c t i n g  En t e r o b a c t e r   s a k a z a ki i  i n   po wde r e d   i n f a n t  f or mu l a.1   Me t hod s   J  Se q ue n c e s  o f  1 6S一 2 3S  r RNA  o f  Ent e r ob a c t e r  

s a k az a ki i( ATCC29 5 44)we r e   us e d   a s   t a r g e t   s e q ue n ce s ,t o   de s i g n   o ut er   p ime r r s,i n ne r   p ime r r s   a n d   l o o p   p ime r r s.We   j u dg e d   t he   r e s ul t s   o f   de t e c t i o n,t h r o ug h   vi s i b l e   t o   t he   na k e d   e y e   o f   t he   wh i t e   pr e c i pi t a t e.1   Re s ul t s   J  The   s e ns i t i v i t y   o f   t h e   LAMP  a s s a y   was   0.101  CFU/mL:t he det ect i on l i mi t  of  ar t i ici f al  cont ami nat i on was  1.1  CFU/g. The det ect i on coul d be f ini shed about  an hour   f r om deal i ng wi t h t he s ampl e  t o  r epor t  t he  r esul t s  wi t h DNA ki t.Compar ed  wi t h  LAMP,t he  s ens i t i vi t y o f   t he  PCR  as s ay  was   101  

CFU/mL  and t he  det ect i on l i mi t  of  ar t i ici f al  cont ami nat i on  was  l   100 CFU/g i n t hr ee  hour s . To  appl y  t he  s ame  me t hod of  

e x t r a c t i n g   DNA,f r o m  de li a n g   wi t h   t h e   s a mpl e   t o  r e p o t t r he  r e s uhs,i t   t o o k   a bo u t  t hr e e  h o ur s.1   Co nc l us i on  J  Th e r e f o r e,t h i s   LAMp- bas ed as say  i s  s ens i t i ve  and  f as t.These  r es ul t s  i ndi cat e t hat   LAMP  can  pr ovi de  a  r api d yet   si mpl e  t es t   or  f t he det ect i on o f 

Ent er obact er   s akazaki  i n powdered i f ant n   f or m ul a.   Keywords. .1 oop—medi at ed i s ot her m al  ampl i icat f i on;I A MP;det ect i on;Ent e r obac t e r   sakazaki i;powder ed i f ant n   or f m ul a 

(本 文责编 :张晓丽)  

Su pp o r t e d   by   t he   Na t u r a l  S c i e nc e   f o u nda t i o n   o f   He be i  P r o v i nc e( C20 08 00 021 6)   Corr espondi ng aut hor.Tel: +86- 312- 7528186;E-ma ll:zhangwei 631126@ yahoo.eom.en  Recei ved:ll  November  2008/Revi sed:8 December  2008 

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