Diagnóstico Del Estado De Las Cepas Del Banco De Cepas De La Facultad De Ciencias Agrarias Y Del Ambiente Sede Los Patios (autoguardado).docx

DIAGNÓSTICO DEL ESTADO DE LAS CEPAS DEL BANCO DE CEPAS DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE SEDE LOS PATIOS.

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9 de Febrero del 2015.

Se realizó un primer ingreso al Banco de cepas de la Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente en su sede de Los Patios, en este día se tomaron 5 cepas madres y 10 microtubos que contiene la conservación en solución salina del hongo Paecilomyces sp, esta cepa es utilizada por la estudiante Wendy Peña en su trabajo de grado titulado Caracterización molecular mediante ITS del biocontrolador Paecilomyces sp del banco de cepas de la Universidad Francisco de Paula Santander. Sede campos Eliseos – Los Patios. Con esta cepa se inició el proceso de recuperación mediante reactivación a partir de la conservación en Caldo PDA y Saborau y su posterior purificación a medio solido (Agar PDA, Malta y Saborau). Estos son los resultados obtenidos hasta el momento: Se han logrado reactivar hasta el momento 6 de las 10 cepas de interés, las demás aún están en proceso ya que no se encontraron cepas madres, lo que obligo a reactivar desde la conservación en solución salina. En la figura 1 se puede evidenciar el crecimiento en cada uno de los medios.

Figura 1. Cepa Paecilomyces sp. A. Crecimiento en caldo Saborau. B. Crecimiento en medio PDA.

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16 de Febrero

En el siguiente ingreso se iniciaron actividades de diagnóstico como:  Lugar de trabajo: el laboratorio no contaba con las mejores condiciones de aseo, se encontró materiales en todos los mesones, cepas que se disponían

a ser desactivadas expuestas al medio ambiente, cajas de materiales de otros proyectos que se realizaron en este laboratorio debajo de mesones, etc. La mala disposición de materiales, reactivos y material biológico en todo el laboratorio ocasiona problemas de contaminación haciendo más difícil el proceso de mantenimiento y conservación de todos los microorganismos de interés biotecnológico.  Neveras: la nevera de conservación se encontraba totalmente llena de materiales (reactivos, medios y cepas en cajas de Petrí) que no deberían de estar allí, ya que esto ocasiona problemas de contaminación a los viales que contiene las conservaciones de los microorganismos además de forzar el funcionamiento de la nevera. La nevera en donde se encuentran las cepas madres estaba llena de mucho material es decir repeticiones de una misma cepa pero presentando agotamiento de medios de cultivo, contaminación (figura 2) y algunas en buen estado. Se sacaron 43 bacterias, 23 hongos, 10 levaduras y 5 actinomicetos, estas fueron desactivadas por el mal estado en que se encontraban.

Figura 2. A. cepa E. coli contaminada, B. Lactobacillus casei con agotamiento de medio.  Inventario de cepas: El almacenamiento de las cepas no es el adecuado ya que solo se cuenta con una nevera para conservación de cepas madre en donde se tienen que guardar los diferentes géneros de microorganismos y una nevera de conservación para el mismo fin. Se inició el conteo y la verificación del estado de las cepas en caja Petrí, primero se clasificaron cada uno de los géneros ya que estaban todos revueltos lo que facilita la contaminación, se encontraron muchas repeticiones de las cuales muy pocas presentaban buen estado, habían cepas desde el año 2012-2013 con agotamiento total del medio de cultivo, ocasionado la muerte de la cepa madre. En total el banco de cepas contaba con 224 cepas distribuidas así: bacterias 111 (43 mamas), hongos 75 (43 mamas), levaduras 27 (14 mamas)

y actinomicetos 11 (10 mamas); a este número de cepas madres se les realizo un diagnóstico se observó solo características macroscópicas y se clasificaron según su estado (puras, contaminadas o con agotamiento del medio de cultivo), la tabla 1 muestra las características evaluadas y el número de cepas reportadas en cada caso. Todas estas cepas madres están siendo sometidas a repiques sucesivos para lograr su recuperación y purificación. En la tabla 1 además se reportan las cepas que tuvieron pérdida total ya que no se encontró replica de cepa madre ni conservación por ninguno de los métodos con los que cuenta el Banco de cepas, las que no cuentan con cepa madre tienen que ser recuperadas haciendo viabilidad de las conservaciones en solución salían o aceite mineral. Tabla 1. Características evaluadas a cepas madres. Microorganismo

Bacterias

Hongos

Levaduras

Actinomicetos

2 21 15 13

20 8 5 10

5 1 5 3

7 3 -

Característica

Cepa pura Contaminación Agotamiento medio de cultivo Cepas perdidas

Además de las cepas que se encuentran en inventario se encontraron 20 réplicas de Rizobacterias (tabla 5) del proyecto de Colciencias titulado Evaluación del efecto de bacterias diazotróficas en el crecimiento de plántulas de café (Coffee Arabica) a cargo de la ingeniera Nelcy Paola Vesga, de estas cepas solo se encontraron las mamas, las cuales estaban en muy mal estado, algunas contaminadas y otras con agotamiento de medio (figura 2), no se encontró conservación de las mismas.

Figura 3. Cepas contaminadas de Rizobacterias de café. Proyecto Colciencias.

INVENTARIO CEPAS EXISTENTES Sin Cepa Madre

Cepa Perdida

Cepa Pura

Tabla 1. Bacterias. CÓDIGO

NOMBRE

EB 001 EB 002 EB 003 EB 004 EB 005 EB 006 EB 008 EB 009 EB 010 EB 011 EB 012 EB 013 EB 014 EB 015 EB 016 EB 017 EB 018 EB 019 EB 020 EB 021 EB 022 EB 023 EB 024

Serratia marcences Escherichia coli Escherichia vulneris Posible Enterobacter Proteus mirabilis Escherichia coli Pseudomonas Stutzeri Pseudomona aeruginosa Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Burkholderia cepacia Pseudomona diminuta Pseudomonas putida Pseudomonas fluorens Pseudomona diminuta Acinetobacter baumannii str Escherichia coli Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Stenotrophomonas maltophilia Pseudomona aeruginosa Posible Enterobacter Posible Enterobacter

CONSERVACIÓN SLN Salina Aceite # Viales Mineral 11 2 1 15 12 1 10 4 14 1 2 1 10 16 15 15 15 1 7 1 14 1 17 10 18 16 9 17 1 21 1 18 1

CEPA MADRE

ESTADO Medio agotado Contaminada

Contaminada Contaminada

EB 025 EB 026 EB 027 BLB 001 BLB 002 BLB 003 BLB 004 BLB 005 BLB 006 BLB 007 BLB 008 BLB 009 BLB 010 BLB 011 BLB 012 BLB 013 BLB 014 BLB 015 BLB 016 BLB 017 BLB 018 BLB 019 BLB 020 BLB 022 BLB 023 BLB 024 BLB 025

Yersenia enterolitica Escherichia coli (Transf) Escherichia coli (Transf) Bacillus badus Bacillus pantothentico Bacillus sp. Bacillus pasteurii Cocos Gram ( + ) Bacilos Gram ( - ) Arizona sp. Bacillus sp. Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis Bacillus laterosporus Bacillus macguariens Bacillus schelegelli Arizona Azotobacter sp. Bacillus macerans Bacillus natus Bacillus thuringensis Stenotrophomonas maltophilia Bacillus Salmonella sp. Bacilos Gram ( + ) Salmonella enteritidis Bacillus Salmonella cholerae Bacillus sp.

18 No hay No hay 11 18 12 9 14 19 15 12 7 12 11 19 14 10 9 13 7 11 35 4 8

No hay No hay

1 1 1 1 1 1 1 1 1

Medio agotado Medio agotado Contaminada Contaminada Contaminada Contaminada Medio agotado Medio agotado

1 1 1 1

13

1

12

1

18

Contaminada Perdida Perdida Contaminada Contaminada Contaminada Contaminada

Contaminada Contaminada Medio agotado Contaminada

BLB 026 BLB 027 BLB 028 BLB 029 BLB 030 BLB 031 BLB 032 BLB 033 BLB 034 BLB 035 BLB 036 BLB 037 BLB 038 BLB 039 BLB 040 BLB 041 BLB 042 BLB 043 BLB 044 BLB 045 BLB 046 BLB 047 BLB 048 BLB 049 BLB 050 BLB 051 BLB 052 RzC011 RzC012 RzC013

Cocos Gram ( + ) Bacilos Gram ( - ) Bacilos Gram ( + ) Pseudomonas szuteri Pseudomonas aeruginosa Burkholderia cepacia Flavobacterium odoratum Bacillus spanaricus Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus spanaricus Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus Stretococcus agalactiae Bacillus subtilis Corinobacterium aquaticum Bacillus cereus Micrococus luteus Bacillus brevis Corynebacterium aquaticum Micrococcus luteus Bacillus cereus Bacillus brevis Bacillus brevis Bacillus megaterium Lactobacillus casei Bacilos cortos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+)

15 16 16 14 12 12 13 17 16 18 16 18

1 1 1 1 1

1 1

Contaminada Contaminada Contaminada Medio agotado Contaminada Medio agotado Medio agotado Medio agotado Contaminada Pérdida Medio agotado Pérdida Pérdida

16 Pérdida Pérdida 10 Pérdida Pérdida Contaminada Pérdida Medio agotado Medio agotado

9 8 9 48 31

1 1 1

RzC014 RzC019 RzC020 RzC023 RzC025 RzC026 RzC030 RzC037 RzC038 RzC044 RzC045 RzC047 RzC048 RzC049 RzC051 RzC057 RzC058 RzH010 RzH012 RzH013 RzH017 RzH018 RzH019 RzH030 RzH033 RzH036 RzH071 RzH072 RzH073 RzH074

Bacilos cortos Gram (+) Bacilos cortos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos cortos Gram (-) Bacilos cortos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos cortos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos cortos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos cortos Gram (+) Bacilos cortos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos cortos Gram (+) Bacilos rectos Gram (+) Bacilos cortos Gram (+)

30 43 22 23 25 31 7 17 25 20 25 28 43 13 11 22 28 17 17 17 No hay No hay No hay No hay 16 No hay No hay No hay No hay No hay

2 No hay 1 1 1 1 1 1 1 1 1 No hay 1 1 1 1 1 1 1 Perdida 1 1 1 1 1 1 1 Perdida

RzH075 RzH077 RzH079 RzH080 RzH092b RZH110 Azotobacter sp RZH132 Azospirillum sp. Total bacterias: 111

No hay No hay No hay No hay 11 11 9

1 Perdida 1 1 1 Medio agotado Medio agotado

Tabla 2. Hongos. CÓDIGO

NOMBRE

HD 001 HD 002 HD 003 HD 004 HD 005 HD O06 HD 007 HD 008 HD 009 HD 010 HD 011 HD 012 HD 013 HD 014 HD 015 HD 016 HD 017

Aspergillus Niger Aspergillus Flavus Aspergillus Oryzae Aspergillus Niger Aspergillus Fumigatus Hongo descp aislado de compost. Hongo desco aislado de compost. Hongo desc aislado de compost. Hongo desc aislado de compost. Hongo desc aislado de compost. Hongo desc aislado de compost. Hongo desc aislado de compost. Hongo desc aislado de caprino Hongo desco aislado de caprino Hongo desc aislado de caprino Aspergillus sp. Aspergillus sp.

CONSERVACIÓN Sln Salina Aceite # viales Mineral 11 1 14 1 15 1 18 1 15 1 17 1 19 1 19 1 1 19 1 15 1 19 1 14 1 18 1 1

CEPA MADRE

ESTADO Medio agotado Contaminada Contaminada

Perdida 18

HD 018 HE 001 HE 002 HE 003 HE 004 HE 005 HE 006 HE 007 HE 008 HF 001 HF 002 HF 003 HF 004 HF 005 HF 006 HF 007 HF 008 HF 009 HF 010 HF 011 HF 012 HF 013 HF 014 HF 015 HF 016 HF 017 HF 018 HF 019 HF 020 HF 021

Aspergillus oryzae Metarhizium Anisopliae Beauveria Bassiana Paecilomyces Fumosoroseus Lecanicillium lecanni Lecanicillium sp. 2 Lecanicillium sp. 3 Lecanicillium sp. 1 Metarizium sp Alternaria Sp. Geotrichum Sp. Geotrichum Sp. Fusarium Sp. Cladosporium Sp. Fusarium Semitectum Rhizopus orizae Mucor plumbeus Curvularia sp. Fusarium sp. Fusarium sp. Fusarium sp. Fusarium sp. Fusarium sp. Geotrichum sp. Colletotrichum sp. Mucor sp Fusarium sp. Cladosporium sp Alternaria sp Curvularia sp

Perdida 1 14 11 3 19

1 1 1 1 Medio agotado Perdida

19 Perdida 7 7 13 9 5 17

1

Contaminada Perdida 18 19 19 19 18 18

Medio agotado 1 Perdida

19 21

Perdida Contaminada

HF 022 Fusarium sp HA 001 Trichoderma Sp. HA 002 Trichoderma Sp. HA 003 Trichoderma lonzibrachiatum HA 004 Trichoderma asperellum HA 005 Trichoderma viride HA 006 Trichoderma harzianum HA 007 Paecilomyces sp. HA 008 Paecilomyces sp. HA 009 Paecilomyces sp. HA 010 Paecilomyces sp.1 HA 011 Paecilomyces sp.2 HA 012 Paecilomyces sp.3 HA 013 Paecilomyces sp.4 HA 014 Paecilomyces sp.5 HA 015 Paecilomyces sp.6 HA 016 Paecilomyces sp.7 HA 017 Trichoderma sp.3 HA 018 Trichoderma sp.1 HA 019 Trichoderma sp.2 HA 020 Gliocadium sp. HA 021 Paecilomyces sp. HA 022 Trichoderma sp HI 001 Penicillium Roquefortii HI 002 Penicillium Camembertii HI 003 Penicillium sp. HI 004 Penicillium sp. HI 005 Penicillium sp. Total hongos: 75

Perdida 16 14 16 16

1 1 1 1 1 1

Contaminado Contaminada

17 16 17 18 18 18 17 18 18 18 18 19 19 18

18 16 18 18

1 1

Perdida Perdida Medio agotado

Medio agotado Contaminada

Tabla 3. Levaduras CÓDIGO

NOMBRE

LV 001 LV 002 LV 003 LV 004 LV 005 LNS-01 LNS-02 LNS-04 LNS-05 LNS-06 LNS-07 LNS-08 LNS-09 LNS-10 LNS-11 LNS-12 LNS-13 LNS-14 LNS-15 S-04 LYP LYP 1 LYP 2 LYP 3 LYP 4

Torula Sp. Torula Sp. Sacharomyces Cerevisia Sacharomyces Ovarum Sacharomyces Cerevisia Kloeckera spp. Kloeckera spp Cryptococcus albidus Candida dubliniensis Candida guillermondii Saccharomyces cerevisiae 1 Saccharomyces cerevisiae 1 Candida parapsilosis Cryptococcus neoformans Candida parapsilosis Candida peliculosa Candida lusitaniae Saccharomyces cerevisiae 1 Saccharomyces cerevisiae 1 Saccharomyces cerevisiae 1 Saccharomyces cerevisiae Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis

CONSERVACIÓN SLN Salina Aceite Mineral 11 1 8 1 7 1 13 1 7 1

CEPA MADRE

ESTADO

Perdida Perdida Perdida Sin aceite 1 1 Sin aceite 1 1 1 Sin aceite 1 Sin aceite Sin aceite 1 1 1 1 1 1

Medio agotado

Medio agotado Medio agotado Contaminada Medio agotado

Candida guillermondii LYP 5 Candida tropicalis LYP 6 Candida lusitaniae LYP 7 Total levaduras: 27

1 1 1

Medio agotado Medio agotado

Tabla 4. Actinomicetos. CÓDIGO

NOMBRE

ACB 001 Streptomyces Sp. ACB 002 Streptomyces Sp. ACB 003 Actinomicetos ACB 004 Actinomicetos ACB 005 Actinomicetos ACB 006 Actinomicetos ACB 007 Actinomicetos ACB 008 Actinomicetos ACB 009 Actinomicetos ACB 010 Actinomicetos ACB 011 Actinomicetos Total actinomicetos: 11

CONSERVACIÓN CEPA MADRE ESTADO Sln Salina Aceite # Viales Mineral 14 1 14 1 18 Contaminada 19 No hay 19 1 18 Sin aceite 19 1 Contaminada 19 1 19 1 Contaminada 20 1 18 1 Contaminada

Tabla 5. Rizobacterias Código Antiguo 2.(5) F6 3.3. F5 H.F5 3.1. F5 (2) T3. F5 16 (2)

Código Proyecto RZCT002 RZCT003 RZCT004 RZCT013 RZCD018

Nombre Azospirillum sp *Gluconacetobacter sp *Gluconacetobacter sp *Gluconacetobacter sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp

Estado Contaminada Medio agotado Contaminada Contaminada Medio agotado Contaminada

10 (2)F1 16 (1) F1 3 (10)(1) F1 15 (1) F1 14. (2). F1 16.F1 (2) 2 (2) F2 T1.F4 H1. F1 T3.F4 3.3. F5 JMV (2) 2. (5). F5 T2. F5

*Posible.

RZCC009 RZCC010 RZCC011 RZCC016 RZCC017 RZCC019 RZCB006 RZCL012

*Burkholderia sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Gluconacetobacter sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Burkholderia sp *Gluconacetobacter sp *Burkholderia sp

Medio agotado Contaminada Contaminada Medio agotado

Contaminada

ACTIDADES A REALIZAR

Después de realizada la revisión del estado en que se encontraban las cepas de microorganismo (bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos) se inició todo el proceso de recuperación y reactivación de cepas madre. Hasta el momento se han recuperado y purificado e identificado las cepas requeridas por docentes y estudiantes para su uso en prácticas de docencia, proyectos de investigación y proyectos de aula (tabla 1). Muchas de estos microorganismos no tenían cepa madre lo que hizo necesario recuperarlas de las conservaciones en solución salina y tubo inclinado con aceite mineral. Tabla 1. Microorganismo de uso frecuente. HONGOS Metarhizium Anisopliae Beauveria Bassiana Paecilomyces sp Lecanicillium lecanni Aspergillus Oryzae Aspergillus Niger Fusarium sp. Geotrichum sp. Curvularia sp Trichoderma sp

BACTERIAS Bacillus thuringiensis Serratia marcences Escherichia coli Pseudomona aeruginosa Staphylococcus aureus

LEVADURAS Torula Sp. Sacharomyces Cerevisiae

El proceso de recuperación de las cepas del proyecto de Colciencias ejecutado por la Ingeniera Nelcy Vesga, ha sido un proceso tedioso ya que estas cepas se encontraron en muy mal estado y no tenían conservación, desde la preparación de los medios de cultivo hasta su purificación. Además de estas cepas todas las agrupadas como Rizobacterias han demandado mucho tiempo en este proceso sin tener muy buenos resultados, solo dos cepas recuperadas. El proceso de recuperación requiere un tiempo prolongado de repiques, purificación, identificación y conservación con nuevos métodos que sean más adecuados con las condiciones del laboratorio, que permitan mantener viables y estable la genética de los microorganismos. A continuación se enumera las actividades pendientes a realizar para el correcto funcionamiento y productividad del Banco de Cepas de la Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente, estas actividades permitirán dar un manejo adecuado a las cepas ya que estos microorganismos que se han obtenido de muchos proyectos de investigación que son de interés Biotecnológico y de gran importancia para realizar procesos Agroindustriales y Agrícolas.

1. Hacer viabilidad de las conservaciones en solución salina y tubo inclinado con aceite mineral. Es necesario realizar este proceso para verificar el estado de estas y lograr obtener cepas madres de todos los microrganismos. 2. Purificar cepas madres. Terminar el proceso de purificación de las cepas madres que se encontraban contaminadas y agotamiento de medios de cultivo. 3. Realizar proceso de identificación macro y microscópicas. Poder identificar los microorganismos según sus estructuras morfológicas, con el objetivo de obtener géneros y luego realizar secuenciación genética para lograr identificar géneros y especies. 4. Conservación. Al momento de recuperar las cepas se debe realizar el proceso de conservación para evitar contaminación y pérdida de los microrganismo; es necesario evaluar nuevos métodos de conservación que sean viables y estables para cada una de las cepas. 5. Mantenimiento cepas madres. A las cepas madre es necesario realizarles repiques a medios de cultivos nuevos por lo menos cada mes, ya que estos se agotan por los requerimientos nutricionales y el metabolismo de cada especie. 6. Base de datos. Los formatos que actualmente se encuentran en el banco de cepas no proporcionan la información necesaria para hacer un reconocimiento e identificación de las estructuras morfológicas de los microorganismos.