Pcr

ΣΕΥΝΙΚΗ ΣΗ΢ ΑΛΤ΢ΙΔΩΣΗ΢ ΑΝΣΙΔΡΑ΢Η΢ ΠΟΛΤΜΕΡΑ΢Η΢ (PCR) Παπαιέμεο Πέηξνο1, Μαξθαλαζηαζάθε Ειέλε2, Θώκε-Μαξίλα Τξύθνπ3 Μνξηαθήο Ιαηξηθήο, Ιαηξηθήο Σρνιήο Αζελώλ, Αλ. Γεληθόο Γξακκαηέαο Δ.Σ. Π.Ε.Τ.Ι.Ε., Πηπρηνύρνο Τερλνιόγνο Ιαηξηθώλ Εξγαζηεξίωλ Τ.Ε.Ι.- Αζήλαο, Καζεγεηήο Ινινγίαο-Μπθεηνινγίαο Δεκνζίνπ Ι.Ε.Κ.Ακαξνπζίνπ 2 Πηπρηνύρνο Τερλνιόγνο Ιαηξηθώλ Εξγαζηεξίωλ Τ.Ε.Ι.-Αζήλαο, Μεηαπηπρηαθή Φνηηήηξηα Μ.Π.Σ. «Πεξηβάιινλ & Υγεία-Δηαρείξηζε Πεξηβαιινληηθώλ Θεκάηωλ κε Επηπηώζεηο ζηελ Υγεία», Ιαηξηθήο Σρνιήο Αζελώλ 3 Τειεηόθνηηε Τκήκαηνο Ιαηξηθώλ Εξγαζηεξίωλ Τ.Ε.Ι.-Λάξηζαο 1M.Sc

Η αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (PCR) αλαθαιύθζεθε ην 1983 από ηνλ Karry Mullis, θαη έθεξε επαλάζηαζε ζηε κνξηαθή βηνινγία, αθνύ απνηέιεζε κία από ηηο ζεκαληηθόηεξεο κεζόδνπο ζηνλ ηνκέα ηεο κνξηαθήο δηαγλσζηηθήο. Η αξρή ηεο PCR ζπλνςίδεηαη ζηελ in vitro ελίζρπζε ελόο ζπγθεθξηκέλνπ ηκήκαηνο DNA κε ηε ρξήζε δηαδνρηθώλ κεηαβνιώλ ηεο ζεξκνθξαζίαο.

Ανηιδπαζηήπια PCR:

• Δςζαπεζηαγμένο Μεπό ή

• • • •

• •

αποζηειπωμένο Μεπό Λίγμα δεοξςνοςκλεοηιδίων (dNTPs) 10 mM PCR buffer MgCl2 (Mg2+ ιόνηα μαγνηζίος) Ζεύγορ εκκινηηών (ππόζθιος και οπίζθιος εκκινηηή) –forward, reverse primer) Taq DNA πολςμεπάζη, ένζςμο cDNA μικποποζόηηηα ή DNA

•Έλαο απιόο εθθηλεηήο απνηειείηαη από 18-30 λνπθιενηίδηα

(ζπλήζωο 20) θαη ην πεξηερόκελό ηνπ ζε βάζεηο GC πξέπεη λα θπκαίλεηαη κεηαμύ 40-60 % (ζπλήζωο 50%). •Τα ηόληα καγλεζίνπ (Mg2+) πξνζηίζεληαη ζην δηάιπκα κε κνξθή MgCl2. To MgCl2 είλαη ην πην θξίζηκν ζπζηαηηθό ζε κηα αληίδξαζε PCR, θαη ε ζπγθέληξωζή ηνπ επεξεάδεη ηελ εηδηθόηεηα θαη ηελ επαηζζεζία ηεο. Η δξάζε ηεο Taq DNA πνιπκεξάζεο εμαξηάηαη από ηελ παξνπζία ηωλ Mg2+ θαη είλαη ε κέγηζηε δπλαηή όηαλ ε ηειηθή ειεύζεξε ζπγθέληξωζή ηνπο θπκαίλεηαη πεξίπνπ ζε 1,2 κε 1,3 mM. •Σεκαληηθό ξόιν παίδεη ε ζεξκνθξαζία πβξηδηζκνύ ηωλ εθθηλεηώλ (Tm). Απηή νξίδεηαη ωο ε ζεξκνθξαζία θαηά ηελ νπνία ε κηζή πνζόηεηα ηωλ εθθηλεηώλ έρεη δεζκεπζεί ζηελ αιιεινπρία ζηόρν. Οη εθθηλεηέο πξέπεη λα έρνπλ παξαπιήζην Tm ην νπνίν κπνξεί λα ππνινγηζηεί από θαηάιιειν ινγηζκηθό ζε ειεθηξνληθό ππνινγηζηή.

•

• •

• • •

΢ΣΑΔΘΑ PCR ΑΜΣΘΔΡΑ΢Η΢ Απνδηάηαμε ηνπ αξρηθνύ δείγκαηνο DNA (denaturation):

ζέξκαλζε ζηνπο 95ν C ώζηε λα απνδηαηαρζεί ην DNA θαη λα αλνίμεη ε δηπιή έιηθα ζε 2 κνλόθιωλεο αιπζίδεο. Τβξηδηζκόο (annealing): Η ζεξκνθξαζία κεηώλεηαη κεηαμύ 50 θαη 71ν C, ώζηε λα γίλεη πξόζδεζε ηωλ εθθηλεηώλ ζην κνλόθιωλν DNA-εθκαγείν ζην 3’ άθξν θάζε αιπζίδαο. Επηκήθπλζε (elongation): Η ζεξκνθξαζία απμάλεηαη ζηνπο 72ν C, ε νπνία είλαη ε βέιηηζηε ζεξκνθξαζία γηα ηε ζεξκνάληνρε Taq πνιπκεξάζε, όπνπ θαη γίλεηαη ε ζύλζεζε ηεο ζπκπιεξωκαηηθήο αιπζίδαο ηνπ DNA κε ηε ρξήζε δενμπξηβνλνπθιενηηδίωλ (dNTPs) ηνπ δηαιύκαηνο. Απνδηάηαμε πξνϊόληωλ: Η ζεξκνθξαζία απμάλεηαη ζηνπο 95ν C, ώζηε ηα κηθξά δίθιωλα ηκήκαηα DNA πνπ δεκηνπξγήζεθαλ λα απνρωξηζηνύλ πάιη θαη λα μεθηλήζεη έλαο λένο θύθινο. Επαλαιακβάλνληαη 25-40 θύθινη ηωλ ζηαδίωλ 2-4, αλαιόγωο. Μεηά ηνλ ηειεπηαίν θύθιν αθνινπζεί έλα κεγαιύηεξν ζε δηάξθεηα, ζηάδην επηκήθπλζεο, ώζηε κα ππάξρεη ρξόλνο γηα ηελ επέθηαζε όιωλ ηωλ πξνϊόληωλ από ην έλδπκν ηεο Taq πνιπκεξάζεο.

΢ρεκαηηθή απεηθόληζε κηαο PCR αληίδξαζεο. Ο θιώλνο 1 θαη ν θιώλνο 2 αληηπξνζωπεύνπλ ην αξρηθό DNA-εθκαγείν. Σα ζθνύξα ηκήκαηα είλαη νη εθθηλεηέο (primers).

Εθαπμογέρ PCR: • Δηάγλσζε γελεηηθώλ αζζελεηώλ. • Ιαηξνδηθαζηηθή. • Ταπηνπνίεζε παηξόηεηαο. • Δηάγλσζε ηώλ, HIV, HTLV, HPV. • Σηε δηάγλσζε βαθηεξίσλ θαη κπθήησλ. • Σηελ αλίρλεπζε γνληδίσλ. • Σηελ ηαπηνπνίεζε λέσλ δεηθηώλ κνξηαθώλ •

θαη θαξθηληθώλ. Σηελ ηαπηνπνίεζε γνληδίσλ κε αληίζηαζε ζηα αληηβηνηηθά.

Μεηνλεθηήκαηα ηεο ηερληθήο PCR • Πνιύ αθξηβή κέζνδνο. • Πνιύ κηθξέο πνζόηεηεο δείγκαηνο. • Εμαηξεηηθά ιεπηνί ρεηξηζκνί. • Εμεηδίθεπζε εθθηλεηώλ (primers) • Ξερσξηζηό πξσηόθνιιν γηα θάζε γνλίδην θαη θάζε αληίδξαζε.

Γηα λα γίλεη ειεθηξνθόξεζε ρξεζηκνπνηνύκε έλα εηδηθό δνρείν, γπάιηλν ή ζπλεζέζηεξα από plexiglass. Σν δνρείν απηό θέξεη ζηηο δπν άθξεο ηνπ, ζεηηθό θαη αξλεηηθό πόιν αληίζηνηρα όπνπ θαηαιήγνπλ ηα θαιώδηα από ην ηξνθνδνηηθό. Σν δνρείν ην γεκίδνπκε κε ην θαηάιιειν ξπζκηζηηθό δηάιπκα, ώζηε ε ειεθηξνθόξεζε λα γίλεηαη ζε ζπγθεθξηκέλν pH θαη ηνληηθή ηζρύ.

ΕΘΙΟΜΑ ΗΚΕΙΣΡΟΦΟΡΗ΢Η΢ ΠΡΟΪΟΜΣΩΜ PCR ΑΜΣΘΔΡΑ΢Η΢