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HENRY SALAZAR Junio 19, 2007 Práctica 1-2 Extracción de ADN y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – Diagnóstico de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y Herpes 1-2

Práctica 1-2: EXTRACCIÓN DE ADN Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) - Diagnóstico de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y Herpes 1-2 OBJETIVOS 1. Aprender la técnica de extracción de ADN humano a partir de sangre periférica. 2.

Usar el ADN extraído en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

3.

Conocer las aplicaciones de la PCR

ADN El ADNes una macromolécula compleja, compuesta por dos cadenas o hélices que se entrelazan entre sí formando una doble hélice. Cada cadena está formada por millones de eslabones, llamados nucleótidos o bases nitrogenadas (son cuatro: A-T, G-C). Ambas hélices están unidas entre sí, a nivel de los eslabones complementarios de cada hélice, por parejas. La secuencia de los pares de bases es lo que determina el código genético. Según el orden que sigan esos pares de bases, se codifica una función u otra, o simplemente no se codifica nada. El ADN de la célula se organiza en cromosomas. Cada cromosoma es una molécula largísima de ADN. El ser humano tiene su DNA organizado en 23 pares de cromosomas distintos, es decir, 46 cromosomas. La mínima secuencia de ADN que es capaz de codificar una función o una estructura completa se denomina GEN. Sin embargo existen largas secuencias del ADN, que aunque molecularmente se compongan de lo mismo que un GEN (son una secuencia de nucleótidos), no codifican absolutamente, y por lo tanto no se les llama genes. Algunos han llamado a esas secuencias ‘vacías’, ADN basura. Hoy día se piensa que la función de ese ADN es estructural, es decir, contribuye a dar estabilidad a la molécula de ADN. Cada cromosoma contiene miles de genes. Hoy día se estima que el ser humano tiene más de 30.000 genes en sus cromosomas.

INTRODUCCIÓN La PCR es una reacción bioquímica in vitro catalizada por una enzima, en la cual pequeñas cantidades de un segmento específico de ADN, que se hallan entre dos regiones de ADN de secuencia conocida, son amplificadas obteniéndose una gran cantidad de ADN lineal de doble cadena. Debido a que la PCR está basada en la acción enzimática de una ADN polimerasa (la más comúnmente utilizada es la Taq ADN pol I que es una de las enzimas más extensamente caracterizada y aplicada en biología molecular), la tecnología de la PCR fue aplicada inmediatamente en varias áreas de investigación, incluyendo la tecnología del ADN recombinante, la expresión génica, medicina general, medicina forense y evolución. Actualmente, la tecnología de la PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de las enzimas de restricción, con el clonaje del ADN y con el Southern blotting en el avance de la biología molecular. Los primeros experimentos de amplificación con PCR fueron realizados por el Dr. Mullís y el Dr. Fred A. Faloona, un matemático quien desarrolló el primer dispositivo automático regulador de la temperatura en ciclos, conocido como termociclador o máquina de PCR (Mullís y Faloona, 1987). La amplificación del ADN se obtiene por ciclos repetidos de PCR, cada uno de los cuales consta de tres estadios de temperatura distintos: (1) Desnaturalización del templado o "plantilla" de ADN (ADN que servirá de modelo para su amplificación) a una temperatura de 94 a 96ºC. 1)

Unión o annealing de los primers (conocidos también como cebadores). Los primers son olígonucleótidos, formados por moléculas de cadena simple de ADN que son complementarios a ambos extremos de una secuencia determinada de ADN que actúa como templado o plantilla. Su función es servir al templado de ADN como punto de partida para la polimerización. Este paso requiere una temperatura que varía entre los 42 a 60°C; y 3) Extensión del primer por ADN polimerasa: Los primers son extendidos en una cadena templado de ADN de cadena simple (previamente desnaturalizado) gracias a la enzima ADN polimerasa en presencia de desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs) bajo condiciones adecuadas de reacción, esto da corno resultado la síntesis de nuevas cadenas de ADN complementario a las cadenas templado. Para este paso se requieren temperaturas entre los 60 a 72° C. Luego de la extensión se obtienen moléculas de ADN de doble cadena, sin embargo, la síntesis de nuevas cadenas de ADN puede ser repetida volviendo a desnaturalizar el ADN por calor (desnaturalización), seguidamente promoviendo el annealing o unión de los primers mediante el enfriamiento de la mezcla para finalmente conducir a la extensión de los primers gracias a la ADN polimerasa a la temperatura adecuada para cada reacción. Cada repetición de esta síntesis de nuevas cadenas constituye un ciclo de amplificación. La reacción de amplificación contiene dos prirners dispuestos de tal manera que puedan hibridizar con las cadenas opuestas de la secuencia "blanco" o secuencia a amplificarse. Debido a que el producto extendido incluye la secuencia complementaria a la del otro primer, el producto de cada reacción sirve como templado en el nuevo ciclo de PCR verificándose así una reacción bioquímica en cadena. 2)

El impacto de esta tecnología (PCR) ha sido particularmente importante en algunos campos relacionados al análisis del genoma humano, especialmente en el mapeo genético y físico de los cromosomas y análisis de la expresión génica.

MATERIALES EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE PERIFÉRICA -

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-

Dos muestras de 1 cc de sangre periférica heparinizada Agua bidestilada Recipiente con cloro Tampón de lisis de leucocitos: Tris (2M) NaCI (5M) EDTA (0.25M) Agua químicamente pura HCI SDS 10% Proteinasa K NaCI (6M) Etanol absoluto Isopropanol Etanol al 70% Tris-EDTA (TE) 1:0.1 pH 8 Vortex Baño maría a 37° C. Pipeta Pasteur Centrífuga multitubos Tubos cónicos Guantes estériles Vaso de precipitación.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) -

Termociclador Tubos eppendorf de 0,5 mi Gradilla para tubos eppendorf Parafilm Micropipetas de 200 y 10 microlitros Puntas para micropipetas (estériles) Tubos eppendorf de 1,5 mi Hielo picado

- Master Mix: -

Agua químicamente pura dNTPs Taq polimerasa Buffer o lampón de reacción 10X Primers MgCI2

ADN a ser amplificado

-

PRUEBA DE EXTRACCIÓN EN GEL DE AGAROSA -

-

Cámara de electroforesis Azarosa TAE1X: Bromuro de etidio 100pb Azul de Bromofenol Micropipetas Puntas para micropipeta Gel de Agarosa cámara Pequeña

% 1% 2%

Agarosa 0.2gr 0.4gr

TAE (50x) H20 destilada Producto 400ul 20ml ADN-ADNc 400ul 20ml PCR

cámara grande % Agarosa TAE (50x) H20 destilada Producto 1% 0.75gr 1.5 ml 75ml ADN2% 1.25gr 1.5 ml 75ml PCR Bromuro de Etidio STOCK = 10 mg/ml Diluido = 0.5 ug/ml (50 en 1000 ml de H2O destilada)

EXTRACCIÓN DE ADN EN SANGRE PERIFÉRICA 1. 2.

Tomar de 5 mi de sangre periférica con EDTA (tubo tapa lila) Ingresar los datos al cuaderno de registro y dar un código a la muestra. 3. De muestra coger 1ml, y colocar en un tubo estéril eppendorff de 2ml, previamente etiquetado. 4. Centrifugar la muestra por 10 minutos a 10000 RPM. 5. Retirar, con una micro pipeta de 1000 ul estéril el plasma; sin agitar el tapón celular (cuidado con los glóbulos blancos). 6. Llenar el tubo con buffer de lisis de eritrocitos y agitar suavemente hasta que se resuspenda el botón celular. 7. Colocar la muestra a 4°C por 3 minutos. 8. Centrifugar la muestra por 10 minutos a 10000 RPM 9. Descartar el sobrenadante con micro pipeta estéril, evitando tomar los glóbulos blancos. 10. Resuspender el tapón de células blancas en : a) 500 ul de buffer de lisis de leucocitos b) 10 ul de Proteinasa K (PK) 10 mg/ml c) 50 ul de DUODECIL sulfato de sodio (SDS) al 10% 11. Incubar la muestra en baño de maría húmedo a 37°C por toda la noche (o a 56 °C por 2 horas) Al día siguiente 12.Colocar 200 ul de Cloruro de Sodio (ClNa), 5 M a la muestra 13.Agitar suavemente la muestra por 15 minutos 14.Centrifugar la muestra por 10 minutos a 12000 RPM El ADN se encuentra a partir de este paso en el sobrenadante 15. Recuperar el sobrenadante y pasarlo a un nuevo tubo estéril

previamente etiquetado (no llevar nada del precipitado) 16. Añadir fenol cloroformo 500 ul, dar vortex y centrifugar a 15 minutos a 12000 RPM. 17. Recuperar el sobrenadante y pasarlo a otro tubo eppendorff rotulado y agregar un volumen = de cloroformo, dar vortex por 10 segundos y centrifugar por 2minutos a 12000 RPM (para limpiar el ADN). 18. Recuperar el sobrenadante y pasarlo a otro tubo eppendorff rotulado y añadir 300 ul de isopropanol (helado) 19.Invertir la muestra suavemente hasta que la medusa del ADN se observe. 20.Centrifugar la muestra por 2 minutos a 10000 RPM. 21. Retirar el sobrenadante tener cuidado de no llevarse la medusa y añadir 500ul de etanol al 70% 22. Centrifugar el tubo de Eppendorff por 2 minutos a 10000 RPM y descartar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder la medusa de ADN 23. Dejar evaporar el etanol a temperatura ambiente o baño de maría seco a 37°C y suspender la medusa de ADN en agua bidestilada. 24.Dejar la muestra en baño de maría seco a 37°C por 1 hora. 25. Cuantificar la muestra en el espectrofotómetro y dejarla en una concentración final de 100 ng/ul.

26.Congelar la muestra a -20°C.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA PCR 1. Sobre una cubeta con hielo picado colocar un tubo eppendorf estéril para preparar la rnaster rnix o mezcla maestra para PCR, usando la hoja especialmente diseñada para el objeto. * Todos los reactivos deben ser sacados del congelador poco tiempo antes de hacer la mezcla y deberán ser mantenidos sobre hielo picado antes y después de ser usados. Al descongelarlos se debe cuidar de que todo el reactivo se disuelva completamente. Para la adición de cada reactivo se deben utilizar puntas de pipeta nuevas y estériles y la preparación de la mezcla se debe realizar con mascarilla y guantes. *

* Evitar tocar el extremo de las puntas a usarse con cualquier material, el pelo, la piel, etc. * La cantidad de rnaster rnix a preparar debe ser calculada según el número de tubos de reacción. MASTER MIX (Volumen final por tubo de reacción = 25 microlitros) M-MIX H2O bd Buffer MgCl DNTPs Primers Taq Polimerasa ADN

Ci 10x 50mm 25mm 10x 5u -

Componentes del PCR Vi Cf 16.6 ul 2.5 ul 1x 1.5 ul 1.5mm 0.2 ul 0.2mm 1 ul c/u 0.8x 0.15 ul 0.075u

Vf 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul

No. R 3 3 3 3 3 3

2.5 ul c/u

25 ul

3

-

Colocar 22.5 microlitros de master mix en cada tubo de reacción (tubos eppendorf 0,2 ml). Añadir a cada uno 1 microlitro del ADN extraído. 3. Llevar los tubos al área de PCR 4. Una vez terminados los ciclos respectivos, congelar los tubos de reacción en caso de no usarlos inmediatamente. 2.

ELECTROFORESIS La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular. Fundamento. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión. La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también. Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos. GEL DE AGAROSA

1. 2. 3.

4. 5. 6.

7. 8. 9.

Pesar 0,4 gr de agarosa. Calentar la solución hasta que se disuelva la agarosa cuidando de que al hervir no se riegue la misma. Dejar enfriar la solución hasta aproximadamente 55° C y agregar. Preparar el molde del gel y verter la solución en el mismo moviendo las burbujas hacia la orilla. Colocar la peinilla en el gel y dejar que éste se solidifique, entonces retirar la peinilla con cuidado. En un pedazo de parafilm limpio colocar 4 microlitros de tinta azul por cada tubo de reacción y mezclar con 10 microlitros de ADN amplificado en el termociclador. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y cubrirlo con TAE 1X. Colocar la mezcla obtenida en el paso 5,en cada uno de los pocillos del gel preparado anteriormente. Procederá la electroforesis a voltaje constante (90 voltios). Colocar el gel en la solución Bromuro de Etidio por 5 minutos. Lavar el Gel en abundante agua y observarlo en la cámara de UV.

Nest- PCR para el diagnóstico de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus, y Herpes 1-2 utilizando cebadores específicos que amplifican un fragmento conocido 1ra amplificación. Procedimiento: 1. Reacción de PCR 1 reacción de PCR Volumen de reacción 25 uL

M- MIX H2O bd Buffer MgCl DNTPs Primers ( f ) Primers ( r ) Taq Polimeraza ADN 5 tubos

Ci 10x 50mm 25mm 10x 10x 5u

Componentes del PCR Vi Cf 16.6 ul 2.5 ul 1x 1.5 ul 1.5mm 0.2 ul 0.2mm 1 ul 0.8x 1 ul 0.8x 0.15 ul 0.075u 2.5 ul

Vf 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul

No. R 48.3 ul 7.5 ul 4.5 ul 0.6 ul 3 ul 3 ul 0.45ul

25 ul

2.5c/u

CN

MI

M2

RH

H2O

ADN uL

Notas: Descongelar los reactivos y mantenerlos a 4°C durante la preparación de la mezcla. El MgCI2 descongelarlo y homogeneizarlo bien mediante "vortex" antes de añadirlo en la mezcla.

2. Condiciones de amplificación

Desnaturalización inicial

94ºC 5min

35 ciclos de: Desnaturalización Annealing Extensión

94ºC 1min

Extensión final

72ºC 10min 4ºC.

55ºC 1min 72ºC 1min

3. Electroforesis en gel de agarosa al 2 %.

Preparación de la muestra: A 10 ul de producto de PCR se le añaden 2 ul de Bromofenol azul 6x ( 0.25 % Bromofenol azul, 40 % (w/v) Sucrosa en agua (4°C) • Corrida: La corrida se realizara en una cámara de electroforesis submarina , utilizando para ello el tampón de corrida TAE 1x. a 100V • Visualización del ADN: Se visualiza el ADN, mediante luz ultravioleta utilizando un transiluminador. 2da amplificación Procedimiento:

•

1. Reacción de PCR 1 reacción de PCR Volumen de reacción 25 ul M- MIX H2O bd Buffer MgCl DNTPs Primers ( f ) Primers ( r ) Taq Polimeraza ADN

Ci 10x 50mm 25mm 10x 10x 5u

Componentes del PCR Vi Cf 16.6 ul 2.5 ul 1x 1.5 ul 1.5mm 0.2 ul 0.2mm 1 ul 0.8x 1 ul 0.8x 0.15 ul 0.075u 2.5 ul

Vf 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul

No. R 112.7 ul 17.5 ul 10.5 ul 1.4 ul 7 ul 7 ul 1.4ul

25 ul

17.5c/u

Mezcla 6 tubos

CN nest

CN

MI

M2

RH+

H2O

1 ul

1 ul

ADN- PCR 1 -

1ul

1 ul

2. Condiciones de amplificación

1 ul

Desnaturalización inicial

93ºC 5min

20 ciclos de: Desnaturalización Annealing Extensión

93ºC 1min 55ºC 1min 72ºC 1min

Extensión final

72ºC 10min 4ºC.

RESULTADOS: C+ 1500pb … 500pb 400pb 300pb 1500pb 200pb … 100pb 500pb 78pb 400pb 0pb 300pb 200pb 100pb 78pb 0pb 1500pb … 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb 78pb 0pb

C-

066

C+

C-

m1

m2

m3

m4

m5

HSV +

HSV -

m1

m2

m3

m4

m5

Las muestras 1 y 4 tienen la presencia del citomegalovirus mientras que las muestras 1,3 y 5 del herpes. Las muestras no fueron contaminadas ya que el grupo control tanto C- Y HSV- no fueron marcadas en la escala de pb. Investigación: 1. ¿Qué es el PCR anidado o nested PCR?

Es una técnica que comporta dos reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) sucesivas, con dos pares de cebadores distintos, de tal modo que los cebadores utilizados en la segunda PCR (internal o nested PCR) flanqueen una región genómica amplificada en la primera reacción en cadena (external PCR), como ilustra la figura. El método de la PCR interna se utiliza sobre todo cuando se tienen pequeñas cantidades del ADN de interés o cuando se quieren evitar las amplificaciones inespecíficas que a veces se observan con la PCR clásica, dado que en cada etapa se realiza un número menor de ciclos (las PCR de muchos ciclos conllevan a menudo errores de lectura y de síntesis, debido, entre otras cosas, a la falta de fidelidad de la polimerasa Taq). Además, si el producto de la primera PCR es el resultado de una amplificación inespecífica, el segundo par de cebadores internos no reconocerá la secuencia complementaria, y por consiguiente no habrá amplificación. 2. ¿De qué depende la temperatura de annealing o unión de los primers? Explique La temperatura de annealing debe ser de aproximadamente 5°C menor que la temperatura de fusión pero en algunos otros experimentos debe ser de hasta menos de 15 °C que la temperatura de fusión. Si la temperatura de annealing es demasiado baja o demasiado alta, los primers pueden hibridar parcialmente sin incluir el extremo 3', y estos híbridos no serán extendidos. Sin embargo, si la hibridación parcial incluye el extremo 3', sí habrá elongación. Evitar en lo posible la utilización de primers que tengan en su secuencia más de 3 ó 4 Gs ó Cs seguidas. Los primers deberán tener, al menos, 18 bases para asegurarnos de que hibriden con el ADN aecuenciar. Si es posible es interesante anclar los primers con GCs en 3´.Utilizar primers con una Tm por encima de 500C . Para primers con un contenido en GCs menor del 50%, puede ser necesario extender el oligo más de 18pb para conseguir una Tm por encima de 500C. La utilización de primers más largos de 18 pb, minimiza la posibilidad de hibridaciones secundarias en el vector o en el inserto. Evitar la utilización de primers con secuencias que formen estructuras secundarias,especialmente en el extremo 3´, o que puedan hibridar formando dímeros intercatenarios. No emplear primers con mismatches, ni primers que hibriden en más de un sitio en la secuencia. 3. Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR? Es necesario usar material que sea de plástico descartable y estéril que este

certificado para el uso en cultivos (punteras y microtubos). Usar micropipetas exclusivamente para la manipulación de ciertos tipos de muestra. Todo material que no sea descartable debe ser esterilizado. El uso siempre de material nuevo es indispensable para evitar el contagio y contaminación entre las muestras, y evitar el contagio hacia la persona que esta trabajando (ej. Si se esta trabajando con algún tipo de virus muy fuerte como el VIH).También para no contaminar la muestra que contiene DNA se debe cambiar las puntas de las micro pipetas al utilizar cada sustancia para evitar problemas de contaminación por formación de aerosoles. 4. Herpes 1-2 5. Citomeglovirus 6. Toxoplasma gondii 7. Contaminación por aerosoles BIBLIOGRAFÍA León J., García J.M. 1992. Manual de Genética Molecular. SÍNTESIS Ed. Madrid. Newton, C.R; Graham, A. 1994. PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford, United Kingdom. Strachan, J., Read, A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers Limited, UK. Thompson, N.W; Mclnnes, R.R; Willard, H.F. 1996. Medicine.W.B.Saunders Company, Philadelphia, U.S.A.

Genetics in

Verma, R; Babu, A. 1995. Human Chromosomes. Principies and Techniques. McGraw. Philadelphia.